臨沂地區(qū)草莓葉枯病病原菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

摘要" 為明確山東臨沂地區(qū)草莓葉枯病的致病菌類型及其生物學(xué)特性。采用組織分離法和柯赫氏法則，對山東省臨沭縣草莓種植園的草莓葉枯樣品進(jìn)行病原菌的分離、鑒定以及致病性回接試驗，并對其進(jìn)行生物學(xué)特性研究。分離出一株草莓葉枯致病菌CM1，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為棒狀擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora），該菌株可導(dǎo)致草莓葉片出現(xiàn)黑褐色病斑，后期產(chǎn)生墨水狀黏稠小黑點，該菌株生物學(xué)特性研究表明，該菌株最適生長條件：溫度25 ℃，pH為6，蔗糖作為碳源，氮源為牛肉膏或蛋白胨。該試驗首次報道了山東臨沂地區(qū)棒狀擬盤多毛孢菌對草莓葉片的致病能力，為今后草莓葉枯病的病原學(xué)研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞" 草莓葉枯??；新棒狀擬盤多毛孢；生物學(xué)特性

中圖分類號" S436.68+4" 文獻(xiàn)標(biāo)識碼" A" 文章編號" 0517-6611（2024）05-0140-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.05.034

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Isolation，Identification and Biological Characteristics of the Pathogen of Strawberry Leaf Blight in Linyi

LIANG Song，GAO Yuan，YU Xin et al

（Kingenta Ecological Engineering Group Co.Ltd.，Linshu， Shandong" 276700）

Abstract" To clarify the pathogenic bacteria types and biological characteristics of strawberry leaf blight in Linyi，Shandong Province.Using tissue isolation method and Koch's rule，the pathogenic bacteria were isolated，identified and pathogenicity of strawberry leaf blight samples from the strawberry plantation in Linshu County，Shandong Province，and the biological characteristics were studied.A pathogenic bacteria CM1 of strawberry leaf blight was isolated.It was identified as Neopestalotiopsis clavispora，which could cause black-brown spots on strawberry leaves and produce ink-like thick small black spots in the later stage.The biological characteristics of the strain showed that the optimum growth temperature of the strain was 25 ℃，pH was 6，the carbon source was sucrose，and the nitrogen source was beef extract or peptone.This experiment reported for the first time the pathogenicity of Neopestalotiopsis clavispora to strawberry leaves in Linyi，Shandong Province，providing a basis for the future study of the etiology of strawberry leaf blight.

Key words" Leaf blight disease of strawberry;Neopestalotiopsis clavispora;Biological characteristics

基金項目" 泰山產(chǎn)業(yè)領(lǐng)軍人才工程項目（2018TSCYCX-32）；山東省重點研發(fā)計劃（2022SFGC0301）；山東省大科學(xué)計劃（2018-001）。

作者簡介" 梁松（1998—），男，山東泰安人，碩士，從事植物病害的生物防治研究。*通信作者，副研究員，從事生物肥料創(chuàng)制及植物病害生物防控研究。

收稿日期" 2023-02-27

草莓（Fragaria ananassa Duch.）為薔薇科多年生常綠草本植物［1］，具有較高的欣賞價值、營養(yǎng)價值和經(jīng)濟(jì)價值，被人們贊譽為“水果皇后”［2-4］。近年來，隨著草莓溫室種植面積的增加，草莓產(chǎn)量逐年增加，但由于溫室多年連作［5］，導(dǎo)致草莓葉部病害逐年嚴(yán)重。葉片是進(jìn)行光合作用的重要器官，一旦發(fā)生葉部病害，則會嚴(yán)重影響草莓的光合作用，最終影響草莓的生長。

草莓葉枯病是草莓生長過程中常暴發(fā)的一種葉部病害，國內(nèi)外研究表明，多種植物病原菌均可導(dǎo)致其發(fā)病，朱曉琴等［6］采用組織分離法從河南商丘草莓葉枯樣品中分離到一株斑污擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis maculans），經(jīng)柯赫氏法則驗證其可導(dǎo)致草莓葉片出現(xiàn)病斑。Ayoubi等［7］首次報道由彎孢霉屬（Curvularia inaqualityis）引起的草莓葉枯病。Kummanid等［8］報道了在泰國清邁地域由擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis sp.）導(dǎo)致草莓葉枯病的發(fā)生。Abd-El-Kareem等［9］報道由擬莖點霉菌（Phomopsis obscurans）導(dǎo)致草莓葉枯病的發(fā)生。李忠峰等［10］在河南鄭州地域初次報道由棒狀擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）導(dǎo)致草莓紅斑葉枯病的暴發(fā)，受害草莓癥狀表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)不規(guī)則病斑，隨著病菌侵染，病斑逐漸變大，最后整個葉片枯死，被害草莓根系呈現(xiàn)黑褐色枯死。

筆者從山東臨沂地區(qū)患病草莓葉片中分離草莓葉枯病病原菌，對其進(jìn)行菌株鑒定，并經(jīng)過柯赫氏法對其進(jìn)行致病性驗證，同時研究草莓葉枯病病原菌的生物學(xué)特性，以期為草莓葉枯病的病原學(xué)研究以及病害防治提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

患病草莓葉片采集于山東省臨沂市臨沭縣朱村草莓種植基地，草莓品種為紅顏。

供試培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、孟加拉紅培養(yǎng)基、基礎(chǔ)培養(yǎng)基［11］。以上培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃高壓滅菌后使用。

1.2" 病原菌的分離純化

采用組織分離法［11］，將患病草莓葉片放入75%乙醇溶液中消毒30 s，取出后用無菌水漂洗3～4次，再放入1%次氯酸鈉溶液中消毒30 s，取出后用無菌水漂洗3～4次，后放在滅菌濾紙上晾干備用，用無菌剪刀剪取草莓葉片的病健交界處（5 mm×5 mm），置于孟加拉紅平板中，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察，待長出真菌菌絲后，用無菌接種針挑取少許菌絲接入PDA培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培育。

1.3" 病原菌的致病性測定及回接試驗

采用室內(nèi)離體葉片菌餅接種法［12］，用5 mm口徑無菌打孔器打取純化好的病原菌菌餅，用無菌接種針刺傷消毒后的草莓葉片，在傷口處放置菌餅（菌絲面朝向傷口），以放置無菌PDA培養(yǎng)基5 mm餅塊作為對照。每個處理重復(fù)3次，濾紙保濕，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后觀察傷口處是否出現(xiàn)癥狀，并利用柯赫氏法則對其進(jìn)行病菌回接試驗。

1.4" 病原菌的鑒定

1.4.1" 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

挑取純化后的病原菌少量菌絲置于PDA培養(yǎng)基中央，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，利用無菌接種針取少量病菌菌絲，放置于電子顯微鏡下觀察形態(tài)［13］。

1.4.2" 病原菌的分子生物學(xué)鑒定。

利用CTAB法提取病原菌基因組DNA，運用ITS通用引物（ITS1/ITS4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收擴(kuò)增產(chǎn)物，送武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，應(yīng)用 NCBI進(jìn)行在線序列比對分析。選擇同源性較高的序列用 MEGA7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［14］。

1.5" 病原菌的生物學(xué)特性［11］

1.5.1" 不同溫度對病原菌生長的影響。

將直徑5 mm的草莓葉枯病菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，置于10、15、20、25、30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測量草莓葉枯病菌直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.2" 不同pH對病原菌生長的影響。

用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液和HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液將PDA培養(yǎng)基的pH分別調(diào)整為4、5、6、7、8后，將直徑5 mm的草莓葉枯病菌菌餅接種于不同pH的PDA培養(yǎng)基平板中央，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測量草莓葉枯病菌直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.3" 不同碳源對病原菌生長的影響。

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源蔗糖分別用同等質(zhì)量的葡萄糖、木糖、麥芽糖、果糖替換，將直徑5 mm的草莓葉枯病菌菌餅接種于不同碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d后測量草莓葉枯病菌直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.5.4" 不同氮源對病原菌生長的影響。

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源硝酸銨用同等質(zhì)量的牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨替換，取直徑5 mm的草莓葉枯病菌菌餅接種于不同氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板中央，28 ℃培養(yǎng)5 d后測量草莓葉枯病菌直徑，每個處理重復(fù)3次。

1.6" 數(shù)據(jù)分析" 采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，應(yīng)用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 病原菌的分離鑒定

2.1.1" 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定。

從采集到的草莓葉枯葉片樣品上分離得到一株疑似病原菌菌株CM1（圖1），該菌株在PDA培養(yǎng)基上為白色菌絲，菌絲呈波浪狀向外延展，菌落背面淺黃色，菌落中央產(chǎn)生黑色黏稠液體。病原菌孢子為紡錘形，具備4個隔膜，病原菌孢子中央呈褐色，兩端透明并長有附屬絲，根據(jù)其形態(tài)特性，該菌株CM1符合擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）的特征。

2.1.2" 病原菌的分子生物學(xué)鑒定。

利用ITS通用引物對病原菌菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至武漢擎科生物科技有限公司測序，經(jīng)過DNAMAN軟件拼接和校正，獲得菌株F45的核苷酸序列，菌株CM1的ITS序列長度為526 bp。使用軟件MEGA 7.0，應(yīng)用鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。

因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將菌株CM1鑒定為棒狀擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）。

2.2" 病原菌的致病性測定及回接試驗

接種3 d后，在病原菌接種處顯現(xiàn)深褐色病斑，接種7 d后病斑處出現(xiàn)黑色墨水狀黏稠小黑點，再次利用組織分離法，在發(fā)病部位可重新分離得到該病原菌，由此確定，菌株CM1是引起臨沂地區(qū)草莓葉枯病發(fā)生的病原菌（圖3）。

2.3" 菌株CM1的生物學(xué)特性

2.3.1" 不同溫度對菌株CM1生長的影響。

由圖4可知，菌株CM1在10～30 ℃均可生長，在25 ℃生長最快，5 d后，菌株CM1菌絲直徑為8.00 cm，在10 ℃生長最慢，5 d后，菌株CM1菌絲直徑為3.65 cm。表明溫度為25 ℃時，最利于菌株CM1生長。

2.3.2" 不同pH對菌株CM1生長的影響。

由圖5可知，菌株CM1在pH 4～8均可生長，在pH為6時生長最快，5 d后，菌株CM1菌絲直徑為7.94 cm，在pH為4時生長最慢，5 d后，菌株CM1直徑為5.21 cm。表明pH為6時，最利于菌株CM1生長。

2.3.3" 不同碳源對菌株CM1生長的影響。

由圖6可知，菌株CM1在5種碳源上均可生長，在碳源為蔗糖時生長最快，5 d后，菌株CM1直徑為7.75 cm，在麥芽糖為碳源時生長最慢，5 d后，菌株CM1菌絲直徑為5.24 cm。表明碳源為蔗糖時，最利于菌株CM1生長。

2.3.4" 不同氮源對菌株CM1生長的影響。

由圖7可知，菌株CM1在5種氮源上均可生長，在氮源為牛肉膏或蛋白胨時生長最快，5 d后，菌株CM1菌絲直徑均為7.72 cm，在尿素為氮源時生長最慢，5 d后，菌株CM1菌絲直徑為6.21 cm。表明氮源為牛肉膏或蛋白胨時，最利于菌株CM1生長。

3" 結(jié)論與討論

該研究從臨沂地區(qū)患病草莓葉片上分離得到一株疑似病原菌CM1，通過柯赫氏法則驗證，證明其為草莓葉枯病致病菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，其為棒狀擬盤多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora），這是在山東臨沂地區(qū)首次報道由棒狀擬盤多毛孢菌導(dǎo)致的草莓葉枯病，另外該研究還探究了菌株CM1的生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)該菌株最適生長溫度為25 ℃，pH為6，碳源為蔗糖，氮源為牛肉膏或蛋白胨。

近年來，越來越多的致病性擬盤多毛孢菌屬被報道［15-19］，薛德勝等［20］從發(fā)病藍(lán)莓植株上分離藍(lán)莓葉斑病菌，成功分離到一株棒狀擬盤多毛孢菌，并篩選了防治該病菌的化學(xué)藥劑，發(fā)現(xiàn)苯醚甲環(huán)唑和福美雙對其具有較高抑菌效果。王鈴朝等［21］在青島萊西地區(qū)分離到3株草莓根腐病病菌，其中一株為棒狀擬盤多毛孢菌。王夢園［23］從山東省臨沂市草莓種植大棚進(jìn)行取樣，分離得到一株草莓根腐病病原菌，經(jīng)鑒定其為棒狀擬盤多毛孢菌，與該研究篩選結(jié)果一致，但該研究是從草莓患病葉片中分離得到，后期應(yīng)繼續(xù)研究菌株CM1對草莓根系的侵染能力。

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