馬齒莧中吲哚類生物堿的生物活性研究

蘭秀娟　郭勝男　王金煥　王呈玉　英錫相

【摘 要】 目的：研究馬齒莧中分離所得吲哚類生物堿的抗膽堿酯酶活性及抗氧化活性。方法：采用改良的Ellman法測定各化合物的抗膽堿酯酶活性，通過測量吸光度值計算化合物的膽堿酯酶抑制率，并計算IC50值；采用DPPH自由基清除法測定各化合物的抗氧化活性，通過測量吸光度值計算化合物的DPPH清除率，并計算IC50值。結果：馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G均有抗膽堿酯酶活性，其中，oleraindole B 抗膽堿酯酶作用的IC50值為40.22 μM，與陽性藥毒扁豆堿（IC50=37.92 μM）的活性相當；oleraindole A、B、C、D和G均具有抗氧化活性，其中，oleraindole C和oleraindole A抗氧化作用的IC50值分別為7.49 μM和9.68 μM，遠遠優于陽性藥BHA的活性（IC50=37.81 μM）。結論：oleraindole B抗膽堿酯酶活性較強，oleraindole C和oleraindole A抗氧化活性較優，可為馬齒莧生物堿的深入研究提供科學依據。

【關鍵詞】 馬齒莧；吲哚類生物堿；生物活性

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2024）05-0020-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.05.zgmzmjyyzz202405005

Study on the Biological Activities of? Indole Alkaloids in Portulaca Oleracea L.

LAN Xiujuan GUO Shengnan WANG Jinhuan WANG Chengyu YING Xixiang*

Abstract：Objective To investigate the anticholinesterase activity and antioxidant activity of the indole alkaloids isolated from Portulaca oleracea L.. Methods The anticholinesterase activity of the compounds was determined by the modified Ellmans method， and the IC50 values were calculated by measuring the absorbance values. The antioxidant activity of the compounds was determined by the DPPH radical scavenging method， and the IC50 values were calculated by measuring the absorbance values. Results The results showed that oleraindole A-oleraindole G all had anticholinesterase activity， among which， the IC50 value of the anticholinesterase effect of oleraindole B was 40.22 μM， which was comparable to the activity of the positive drug eserine （IC50=37.92 μM）; oleraindole A， B， C， D and G all had antioxidant activity， among which， the IC50 values of oleraindole C and oleraindole A were 7.49 μM and 9.68 μM， respectively， which were much better than the activity of the positive drug BHA （IC50=37.81 μM）.Conclusion The stronger anticholinesterase activity of oleraindole B and the superior antioxidant activity of oleraindole C and oleraindole A could provide a scientific basis for the in-depth study of Portulaca oleracea L..

Keywords：Portulaca oleracea L.; Indole Alkaloids; Biological Activities

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，又名長命菜、五行草等，為藥食兩用植物［1］。馬齒莧生命力頑強，分布范圍廣泛，多見于田野路邊，被世界衛生組織（WHO）列為世界上應用最廣泛的藥用植物之一［2-3］。馬齒莧作為傳統中藥已經有上千年的歷史，其味酸、性寒，歸肝、大腸經，具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效。馬齒莧中含有多種化學成分，如生物堿［4-6］、黃酮［7， 8］、有機酸［9］、萜類［10］等，具有抗氧化［11］、抗乙酰膽堿酯酶［12］、抗炎［13］等多種藥理活性。課題組長期從事馬齒莧研究工作，其中生物堿類成分為馬齒莧活性成分之一，本文對課題組分離得到的吲哚類生物堿進行生物活性研究。

阿爾茨海默病（alzheimers disease，AD）是一種神經系統退行性疾病，主要表現為記憶障礙、認知障礙和行為異常等癥狀，給患者身體帶來傷害，嚴重影響生活質量［14］。研究［15］表明，抑制膽堿酯酶可以使乙酰膽堿堆積，興奮膽堿受體，改善AD患者學習和記憶能力。因此，本文對實驗室分離的馬齒莧吲哚類生物堿進行了抗膽堿酯酶活性研究，為AD藥物的進一步研究提供實驗基礎。此外，自由基氧化損傷被認為是中樞神經系統疾病（如帕金森、AD等）的重要因素［16］，抗氧化作用可以作為中樞神經系統疾病的潛在治療方法，故本文還對馬齒莧中吲哚類生物堿進行了抗氧化活性研究，期望為馬齒莧中生物堿成分的深入研究提供科學基礎。

1 材料

1.1 實驗材料及試劑 Oleraindole A、Oleraindole B、Oleraindole C、Oleraindole D、Oleraindole E、Oleraindole F及Oleraindole G（均由本實驗室分離所得，純度>97%），毒扁豆堿（上海瀚翔生物科技有限公司），碘代硫化乙酰膽堿（ATCI）和乙酰膽堿酯酶（AChE）（大連美倫生物科技有限公司），二硫代二硝基甲酸（DTNB）（上海金水生物科技有限公司），磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉（上海國藥控股試劑有限公司），1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）（美國sigma公司），丁基羥基茴香醚（BHA）（上海祥瑞生物有限公司），甲醇（色譜純，天津市凱信化學工業有限公司）

1.2 實驗儀器與設備 HBS-1096A96孔酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司），Hitachi UV-3010型紫外可見分光光度計（日本日立公司），十萬分之一天平（瑞士METTLER），HH-4型數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 抗膽堿酯酶試驗 本實驗根據改良的Ellman法測定各個化合物的抗膽堿酯酶活性。精密稱取oleraindole系列化合物及毒扁豆堿，用甲醇配制成五個系列濃度31.25 μM、62.5 μM、125 μM、250 μM和500 μM的樣品溶液。具體操作如下：于96孔酶標板中加入140 μL的磷酸緩沖鹽溶液（0.1 M，pH=8.0，包含0.1 moL/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉），20 μL的樣品溶液，15 μL的AChE（0.2 U/mL），于37 ℃下孵育10 min后，加入10 μL的ATCI（15 mmoL/L）和10 μL的DTNB（15 mmoL/L），于37 ℃下孵育20 min后，將96孔板置于酶標儀中，在405 nm波長下測量各組樣品的吸光度值。其中，以甲醇代替樣品溶液作為空白組，以毒扁豆堿代替樣品溶液作為陽性對照組。各化合物膽堿酯酶抑制率按下列公式計算（A代表吸光度）：

抑制率（%）=（A空白-A樣品）/A空白×100%

2.2 抗氧化試驗 本實驗使用DPPH自由基清除法測定各個化合物的抗氧化活性。精密稱取oleraindole系列化合物及BHA，用甲醇配制成10 μM、20 μM、30 μM、50 μM和100 μM五個系列濃度的樣品溶液。此外，DPPH溶液現用現配，精密稱取適量DPPH，用甲醇配制成濃度為80 μM的溶液，全程避光操作。具體操作如下：將1 mL的樣品溶液與1 mL的DPPH溶液充分混合，于室溫、避光環境下放置10 min，將紫外分光光度計檢測波長設置為517 nm后，測量樣品的吸光度值。其中，以甲醇代替樣品溶液作為空白組，以BHA代替樣品溶液作為陽性對照組，以1 mL甲醇與1 mL樣品溶液的混合溶液作為對照組。各化合物DPPH清除率按下列公式計算（A代表吸光度）：

DPPH清除率（%）=［1-（A樣品-A對照）/A空白］× 100%

3 結果

3.1 各化合物抗膽堿酯酶活性 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G的化學結構如圖1所示，其抗膽堿酯酶活性結果如圖2所示，從活性結果中可以看出，oleraindole A至oleraindole G均表現出一定的抗膽堿酯酶活性，且各化合物對膽堿酯酶的抑制作用隨著化合物濃度的增大而增強，呈劑量依賴性的趨勢。

表1所示結果為各化合物抗膽堿酯酶作用的IC50值，由此結果可知，oleraindole B 的抗膽堿酯酶活性最強，其IC50值為40.22 μM，與陽性藥毒扁豆堿（IC50=37.92 μM）的活性相當。在苷元結構中，Oleraindole A 的活性次之，而在苯環上有兩個羥基取代的oleraindole C活性最弱。與苷元oleraindole B和oleraindole A 的活性相比，其苷類結構即oleraindole E 、oleraindole D、oleraindole F和oleraindole G的活性均下降。

3.2 各化合物抗氧化活性 馬齒莧中oleraindole A-oleraindole G的抗氧化活性結果如圖3所示，從活性結果中可以看出，oleraindole A、oleraindole B、oleraindole C、oleraindole D、oleraindole G均表現出了較強的抗氧化活性，且各化合物的抗氧化作用隨著化合物濃度的增大而增強，呈劑量依賴性的趨勢。

表2所示結果為各化合物抗氧化作用的IC50值，由此結果可知，oleraindole C的抗氧化活性最強（IC50=7.49 μM），oleraindole A的活性次之（IC50=9.68 μM），且二者的抗氧化活性均優于陽性藥BHA（IC50=37.81 μM）。在苷元結構中，oleraindole B的活性最弱（IC50=42.10 μM）。與苷元oleraindole A和oleraindole B的活性相比，其苷類結構中，oleraindole G（IC50=41.87 μM）和oleraindole D（IC50=62.30 μM）表現出較強的抗氧化活性，而oleraindole F和oleraindole E的活性明顯降低。

4 討論

馬齒莧作為傳統中藥已經有上千年歷史，其具有化學成分多樣性和藥理活性多樣性的特點，受到了學者們的關注。課題組長期從事馬齒莧相關研究工作，從馬齒莧當中分離出了多種化學成分，生物堿類化學成分作為馬齒莧活性成分之一，有必要對其生物活性進行研究。

AD又稱老年癡呆，是一種進行性發展的神經退行性疾病，臨床上表現為記憶障礙、執行功能障礙、行為改變、人格改變等特征，病因迄今未明。膽堿能系統改變與AD的認知功能損害程度密切相關，通過抑制膽堿酯酶來增強膽堿能神經傳遞是治療AD的有效方法之一［17］。研究［18］表明，生物堿類常表現出乙酰膽堿酯酶抑制作用，具有治療AD的潛力，故本實驗對馬齒莧中吲哚類生物堿進行抗膽堿酯酶活性研究。實驗結果顯示oleraindole B的抗膽堿酯酶活性最優，oleraindole A的活性次之，oleraindole C的活性明顯下降，通過比較各化合物化學結構的特點，可以推斷化學結構中-3″位置的取代基對活性影響較大，其中，當-3″位置為疏水基團甲氧基取代時，oleraindole B的活性最優；當-3″位置無取代基團時，oleraindole A的活性次之；而當-3″位置為親水基團羥基取代時，oleraindole C的活性則明顯下降。與苷元結構相比，oleraindole D至oleraindole G的抗膽堿酯酶活性均下降，說明oleraindole系列的糖苷形式不利于化合物抗膽堿酯酶活性的發揮。

細胞受到氧化損傷是中樞神經系統疾病（如精神分裂、帕金森氏癥、腦癱阿爾茨海默病）發生的重要因素，抗氧化作用可作為中樞神經系統疾病治療的潛在手段，且研究［19］表明含有酚羥基基團的生物堿類化學成分常具有較強的抗氧化活性。因此，本實驗對馬齒莧中吲哚類生物堿進行抗氧化活性研究。實驗結果顯示oleraindole C的抗氧化活性最優，其化學結構中-3″和-4″位置含有兩個酚羥基；oleraindole A的-3″位置無酚羥基取代，其活性次之；而oleraindole B的-3″位置為供電子集團甲氧基，使其抗氧化活性下降。與苷元結構相比，oleraindole D-oleraindole G的抗氧化活性均下降，其中，oleraindole G的-6位有兩個葡萄糖取代，其抗氧化活性與oleraindole B的活性相當。上述活性結果提示生物堿抗氧化活性與其結構中酚羥基的個數相關，酚羥基個數越多，抗氧化活性越強。

本實驗對馬齒莧中吲哚類生物堿oleraindole A-oleraindole G進行了抗膽堿酯酶活性及抗氧化活性研究，發現oleraindole A既表現出較強的抗膽堿酯酶活性，又表現出較優的抗氧化活性，具有進一步研究的價值。此外，oleraindole B抗膽堿酯酶活性最佳，oleraindole C抗氧化活性最佳，該實驗結果可為吲哚類生物堿的深入研究提供科學依據。

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（收稿日期：2023-06-12 編輯：劉 斌）

基金項目：遼寧省科技廳博士科研啟動基金計劃項目（2022-BS-198）；遼寧中醫藥大學2021年高層次引進人才科研啟動項目（2100221002）。

作者簡介：蘭秀娟（1991—），女，漢族，博士，講師，研究方向為中藥藥效物質。E-mail：xiujuanlan@139.com

通信作者：英錫相（1964—），男，滿族，博士，教授，研究方向為中藥藥效物質與藥代動力學。E-mail：yingxixiang@163.com