不同梨品種花粉量與活力差異的研究

葛彤 齊開(kāi)杰 謝智華 岳冬 王亞茹 王鵬 毛海艷 張巖 張紹鈴 吳巨友

摘要：以105個(gè)梨品種為試驗(yàn)材料，調(diào)查單花花藥量和單花藥花粉量，對(duì)散粉效果較好的77個(gè)品種進(jìn)行花粉活力檢測(cè)。結(jié)果表明，不同梨品種花粉量及花粉活力存在差異，花粉數(shù)量性狀變異系數(shù)大，花粉變異程度高。其中，單花花藥量變幅為13～36粒，單花藥花粉量變幅為0～15 440粒，除花粉萌發(fā)率為0%的品種外，其余品種花粉萌發(fā)率變幅為1.76%～82.74%，花粉管長(zhǎng)度變幅為102.49～400.29 μm。經(jīng)系統(tǒng)聚類分析，供試品種被分為六大類群，其中第Ⅰ、第Ⅱ類群的15個(gè)品種花粉量多、花粉萌發(fā)率高且花粉管生長(zhǎng)速率較快。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單花花藥量、單花藥花粉量和花粉萌發(fā)率符合正態(tài)分布規(guī)律，將符合正態(tài)分布的花粉數(shù)量性狀用4個(gè)分點(diǎn)分為5級(jí)，明確了每級(jí)花粉數(shù)量性狀的頻率分布。初步篩選出15個(gè)花粉育性較好的品種以及9個(gè)花粉敗育品種，為梨園授粉樹(shù)配置和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

關(guān)鍵詞：梨；花藥量；花粉量；花粉活力；聚類分析；花粉敗育

中圖分類號(hào)：S661.203? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）06-0142-08

收稿日期：2023-05-24

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2022YFD1200503）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-28）。

作者簡(jiǎn)介：葛彤（1998—），女，江蘇徐州人，碩士研究生，從事梨園花果管理研究。E-mail：1413230543@qq.com。

通信作者：吳巨友，博士，教授，博士生導(dǎo)師，從事梨種質(zhì)資源創(chuàng)新、成花受精機(jī)理與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用研究。E-mail：juyouwu@njau.edu.cn。

梨是薔薇科（Rosaceae）梨屬（Pyrus）植物，我國(guó)是梨的起源中心，栽培歷史悠久、種植范圍廣泛，具有豐富的梨種質(zhì)資源^[1]。花粉是研究植物遺傳、育種、生殖和進(jìn)化的重要材料，明確不同品種的花粉育性和授粉特性是開(kāi)展高效栽培和良種繁育工作的基礎(chǔ)^[2-3]。梨作為典型的配子體自交不親和果樹(shù)，多數(shù)品種自花授粉不能結(jié)實(shí)，為保證果園豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，花期通常采用配置授粉樹(shù)或人工輔助授粉等方法來(lái)提高花粉授粉效果^[4]。不同梨品種之間親緣關(guān)系復(fù)雜，花粉育性和交配親和性差異顯著，部分品種存在雄性不育現(xiàn)象^[5-6]。有研究顯示，梨的花粉萌發(fā)率和花粉量呈現(xiàn)出越靠近梨屬植物起源地越高的趨勢(shì)^[7]。因此，探究不同梨品種花粉量和花粉育性，對(duì)充分利用梨特異種質(zhì)、合理配置授粉樹(shù)以及雜交育種具有重要研究意義。目前，關(guān)于梨花粉量和花粉萌發(fā)率差異的研究已有較多報(bào)道，但主要集中在花粉萌發(fā)水平和授粉特性上，而有關(guān)花粉育性分類和數(shù)量性狀分級(jí)的報(bào)道較少^[8-10]。

因此，本研究通過(guò)調(diào)查不同梨品種的花粉量與花粉活力，對(duì)其花粉數(shù)量性狀進(jìn)行概率分級(jí)，同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)聚類分析，明確各品種花粉育性，篩選出花粉敗育品種，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中授粉品種的選用和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料及取樣

試驗(yàn)于2022年2月底至4月初進(jìn)行，105個(gè)梨品種的花蕾材料采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨種質(zhì)資源圃和江蘇省睢寧縣示范基地。每個(gè)品種隨機(jī)采集處于大蕾期的鈴鐺狀大花蕾約100朵，剝下花藥，取50粒飽滿、未開(kāi)裂的花藥用于單個(gè)花藥花粉量測(cè)定，其余花藥用硫酸紙包好后置于硅膠中陰干，待花粉全部散出后，加干燥劑，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2? 單花花藥量與單花藥花粉量檢測(cè)

隨機(jī)采集各品種處于大蕾期的鈴鐺狀大花蕾約100朵，揉開(kāi)花蕾，記錄不同品種單朵花蕾的花藥數(shù)量并計(jì)算每個(gè)品種單花花藥量的平均值，統(tǒng)計(jì)花藥量后及時(shí)剝下花藥，隨機(jī)取50粒形狀飽滿、尚未開(kāi)裂的花藥放入2 mL離心管中^[10]，將離心管放入35 ℃烘箱中干燥，待花粉完全散出后加入2 mL濃度為200 g/L的六偏磷酸鈉溶液，在漩渦振蕩器上振蕩成懸浮液。分別取400 μL懸浮液和1 600 μL六偏磷酸鈉溶液置于新的2 mL離心管中，搖勻，吸取5 μL混合后的溶液滴在載玻片上，在Olympus IX 73顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)單花藥花粉量（粒）。

單花藥花粉量（花粉量/花藥）=每個(gè)載玻片上總花粉數(shù)×40。

1.3? 花粉萌發(fā)率與花粉管長(zhǎng)度檢測(cè)

將花粉從-20 ℃冰箱中取出，在4 ℃條件下放置2 h，再移至室溫下放置2 h，使花粉逐漸解凍。刮取適量花粉置于2 mL離心管中，加入400 μL液體培養(yǎng)基[其配方為10%蔗糖+0.01%硼酸+0.03% Ca（NO₃）₂·H₂O+30 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸（MES），pH值為6.2]，混勻后放入25 ℃、120 r/min的搖床中培養(yǎng)3 h，統(tǒng)計(jì)花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度。每個(gè)處理觀察3個(gè)視野，以花粉管長(zhǎng)度大于花粉粒直徑視為萌發(fā)，隨機(jī)選取50根花粉管拍照，并使用Image J軟件測(cè)量花粉管長(zhǎng)度。

花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

1.4? 花藥橫切面石蠟切片觀察

將適量花藥放入50%甲醛-乙酸-乙醇（FAA）固定液中固定后，送至武漢賽維爾生物科技有限公司制作石蠟切片。將切片放置在倒置顯微鏡下觀察藥室內(nèi)花粉數(shù)量。

1.5? ?數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Excel和IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行分析，分別統(tǒng)計(jì)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等。利用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)法對(duì)花粉數(shù)量性狀進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。將符合正態(tài)分布的數(shù)量性狀劃分為5個(gè)等級(jí)，4個(gè)分點(diǎn)依次為x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，1～5級(jí)分布的概率依次為10%、20%、40%、20%、10%，其中：x為各性狀的平均值，s為各性狀的標(biāo)準(zhǔn)差^[11]。利用GraphPad Prism 8.0.2軟件對(duì)單花藥花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度進(jìn)行變異系數(shù)統(tǒng)計(jì)與相關(guān)性分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同梨品種花粉量及花粉活力調(diào)查

調(diào)查結(jié)果（表1）顯示，單花花藥量變幅為13～36粒，平均花藥量為23粒；單花藥花粉量變幅為 0～15 440 粒，大多品種單花藥花粉量分布在907～8 627粒范圍內(nèi)，占供試品種總數(shù)的72.38%。其中，龍香、綠安久和六棱梨花粉量極少，夏露、夏清和黃金梨等11個(gè)品種沒(méi)有檢測(cè)到花粉。

花粉萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)速率可反映花粉活力，本試驗(yàn)中花粉管長(zhǎng)度為花粉培養(yǎng)3 h后的生長(zhǎng)量，可用花粉管長(zhǎng)度反映花粉管的生長(zhǎng)速率。對(duì)77個(gè)散粉效果好的梨品種進(jìn)行花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度檢測(cè)，結(jié)果表明，除建始早古、水洞瓜和海棠酥這3個(gè)品種的花粉萌發(fā)率為0外，其余品種花粉萌發(fā)率變幅為1.76%～82.74%，花粉管長(zhǎng)度變幅為102.49～400.29 μm。其中，28個(gè)供試品種花粉萌發(fā)率在50%以上，占供試品種總數(shù)的36.36%。

2.2? 花藥橫切面觀察

在花粉量檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，有14個(gè)品種花粉量極少或無(wú)花粉，為驗(yàn)證調(diào)查結(jié)果，對(duì)其花藥橫切面進(jìn)行切片觀察（圖1）。梨花藥由4個(gè)花粉囊和藥隔組成，正常成熟花藥橫切面一般呈蝶形，花粉均勻布滿藥室。以花粉量較多的陽(yáng)信大鴨梨為對(duì)照（CK），其藥室內(nèi)均勻布滿花粉粒；而夏露（圖1-A）、黃金（圖1-B）、新高芽變（圖1-C）、八里香（圖1-D）、云南黃酸梨（圖1-G）、寧霞（圖1-H）、夏清（圖1-I）、天皇（圖1-J）和新梨7號(hào)（圖2-K）這9個(gè)品種的藥室內(nèi)無(wú)花粉，花藥呈空囊狀，石蠟切片與花粉量檢測(cè)結(jié)果基本一致，判斷為花粉敗育品種。綿梨（圖1-E）和酒泉長(zhǎng)把（圖1-F）花藥較小，呈皺縮狀態(tài)，發(fā)育不完全；綠安久（圖1-L）花藥皺縮未開(kāi)裂；龍香（圖1-M）和六棱梨（圖1-N）花藥開(kāi)裂，但藥室內(nèi)花粉含量少，花粉量異常機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.3? 花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管生長(zhǎng)速率聚類分析

以花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度為變量，對(duì)花粉可萌發(fā)的品種進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，74個(gè)梨品種被分為6個(gè)類群（表2）。第Ⅰ類群包括花粉量大、萌發(fā)率高且花粉管生長(zhǎng)速率快的3個(gè)品種，分別為連城石頭梨、龍都大鴨梨和大洋木梨（莆田），其平均花粉量為14 107粒，平均萌發(fā)率為54.58%，平均花粉管長(zhǎng)度255.20 μm。第Ⅱ類群包括12個(gè)品種，其花粉量較大，花粉萌發(fā)率較高，花粉管生長(zhǎng)速率較快。第Ⅲ類群包括15個(gè)品種，為花粉量較高，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度處于中等水平的品種。第Ⅳ類群包括18個(gè)花粉量和花粉萌發(fā)率中等，但花粉管長(zhǎng)度較短的品種。第Ⅴ類群包括10個(gè)品種，為花粉量較少、花粉萌發(fā)率較低，但花粉管生長(zhǎng)速率較快的品種。第Ⅵ類群包括16個(gè)品種，其花粉量、萌發(fā)率和花粉管生長(zhǎng)速率均表現(xiàn)較差。綜合比較之下，第Ⅰ、第Ⅱ類群品種的花粉育性最好，第Ⅲ、第Ⅵ類群品種的花粉育性中等，第Ⅴ、第Ⅳ類群品種的花粉育性最差。

2.4? 花粉數(shù)量性狀的正態(tài)性檢驗(yàn)及頻率分布

經(jīng)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，除花粉管長(zhǎng)度的P值為0.023，不符合正態(tài)分布規(guī)律外，單花花藥量、單花藥花粉量及花粉萌發(fā)率的P值均大于0.1，符合正態(tài)分布規(guī)律。將符合正態(tài)分布規(guī)律的3個(gè)數(shù)量性狀依據(jù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表3）劃分為5個(gè)等級(jí)，4個(gè)分點(diǎn)依次為x-1.281 8s、x-0.524 6s、x+0.524 6s和x+1.281 8s，其分布頻次如圖2所示。根據(jù)分點(diǎn)值確定取值范圍并計(jì)算分布頻率，通過(guò)變異系數(shù)將數(shù)據(jù)多樣性進(jìn)行量化。

單花花藥量的變幅為13～36粒，平均單花花藥量為23粒，變異系數(shù)為16.81%。單花花藥量概率分級(jí)的頻率分布：1級(jí)（＜18粒）占4.8%，2級(jí)（18～21粒）占20.0%，3級(jí)（>21～25粒）占41.9%，4級(jí)（>25～28粒）占19.0%，5級(jí)（>28粒）占14.3%。

單花藥花粉量的變幅為0～15 440粒，平均花粉量為5 411粒，變異系數(shù)為64.58%。單花藥花粉量概率分級(jí)的頻率分布：1級(jí)（＜932粒）占14.29%，2級(jí)（932～3 578粒）占19.05%，3級(jí)（>3 578～7 244粒）占36.19%，4級(jí)（>7 244～9 890粒）占20%，5級(jí)（>9 890粒）占10.48%。

花粉萌發(fā)率的變幅為0～82.74%，平均花粉萌發(fā)率為39.69%，變異系數(shù)為57.58%。花粉萌發(fā)率概率分級(jí)的頻率分布：1級(jí)（＜10.40%）占10.38%，2級(jí)（10.40%～27.70%）占24.68%，3級(jí)（>27.70%～51.68%）占31.29%，4級(jí)（>51.68%～68.98%）占18.18%，5級(jí)（>68.98%）占15.58%。

2.5? 花粉性狀相關(guān)性分析

結(jié)合皮爾遜相關(guān)系數(shù)及散點(diǎn)圖對(duì)單花藥花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果（圖3）表明，單花藥花粉量與花粉萌發(fā)率、花粉管長(zhǎng)度之間均呈弱相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.360和0.252；花粉萌發(fā)率與花粉管長(zhǎng)度之間呈顯著正相關(guān)，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.662。

3? 討論

3.1? 不同梨品種花粉量及花粉活力的差異

花粉質(zhì)量是保證授粉效果的關(guān)鍵，直接影響果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，花粉量主要取決于品種本身的遺傳特性、樹(shù)體營(yíng)養(yǎng)水平及生存環(huán)境^[12]。在對(duì)棗、桃、葡萄和蘋果等果樹(shù)的花粉研究中發(fā)現(xiàn)，不同果樹(shù)或同一果樹(shù)的不同品種間花粉量及花粉活力存在差異^[13-17]。在本研究中，不同梨品種花粉量、花粉萌發(fā)率及花粉管生長(zhǎng)速率差異明顯，與其他果樹(shù)花粉研究結(jié)果類似。花粉活力不僅與花粉自身遺傳特性有關(guān)，而且受外界環(huán)境如溫度、相對(duì)濕度、貯藏介質(zhì)、輻射、光照、空氣質(zhì)量等多重因素影響^[18-19]。因此，在本研究中導(dǎo)致建始早谷、水洞瓜和海棠酥花粉萌發(fā)率為0的因素較多，花粉未萌發(fā)的具體原因有待進(jìn)一步探究。通過(guò)對(duì)梨花粉數(shù)量性狀特征進(jìn)行概率分級(jí)，明確每級(jí)花粉數(shù)量性狀的頻率分布，更加客觀統(tǒng)一地描述、評(píng)價(jià)梨花粉性狀，也證實(shí)花粉數(shù)量性狀具有變異系數(shù)大、變異程度高、多樣性豐富的特點(diǎn)^[11]。單花花藥量、單花藥花粉量和花粉萌發(fā)率符合正態(tài)分布規(guī)律，而花粉管長(zhǎng)度不符合正態(tài)分布規(guī)律，與李芳芳等研究中“花粉量與花粉萌發(fā)率均不符合正態(tài)分布規(guī)律”的結(jié)論^[10]有所不同。

3.2? 花粉量大且活力強(qiáng)的品種篩選

多數(shù)梨品種自花不結(jié)實(shí)或自花結(jié)實(shí)率低、低溫陰雨天氣和品種花期不遇等問(wèn)題均可影響花粉正常發(fā)育，需配置授粉樹(shù)或人工輔助授粉，以保證豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)^[4]。依據(jù)花粉特性對(duì)品種進(jìn)行分類的結(jié)果，可為雜交親本的選擇和授粉樹(shù)的配置提供參考。本研究通過(guò)聚類分析，將供試?yán)嫫贩N劃分為育性不同的六大類群，篩選出白梨系統(tǒng)中的夏半伏梨、陽(yáng)信大鴨梨、龍都大鴨梨、泊頭大鴨梨、新鴨梨、金墜、金花1號(hào)、漢源白梨，砂梨系統(tǒng)中的金水酥、蒼溪六月雪、大洋木梨（莆田）、玉冠，秋子梨系統(tǒng)中的遼陽(yáng)大香水以及地方品種長(zhǎng)泰臺(tái)灣梨、連城石頭梨等15個(gè)花粉量大、花粉萌發(fā)率高且花粉管生長(zhǎng)速率快的品種。花粉質(zhì)量是保證授粉效果的關(guān)鍵，選擇花粉量大、花粉活力強(qiáng)的品種用于授粉，能夠有效解決生產(chǎn)中授粉不良、產(chǎn)量不高等問(wèn)題。由于多數(shù)梨品種自花授粉不結(jié)實(shí)，品種間是否親和、花期是否相近成為梨園配置授粉樹(shù)時(shí)必須考慮的因素，另外，種間遠(yuǎn)緣關(guān)系也會(huì)造成無(wú)法相互授粉或受精率很低。因此，授粉前應(yīng)進(jìn)行S基因型比較，依據(jù)親緣關(guān)系，選擇與主栽品種親和并且花期相近的品種作為授粉樹(shù)，以保證較好的授粉質(zhì)量。

3.3? 雄性不育品種的驗(yàn)證

植物雄性不育現(xiàn)象主要表現(xiàn)為雄蕊發(fā)育異常、不能產(chǎn)生有正常功能的花粉，但雌蕊可正常發(fā)育并能接受花粉而受精結(jié)實(shí)^[20]。雄性不育現(xiàn)象廣泛存在于自然界開(kāi)花植物中，桃、杏、葡萄、柑橘等許多果樹(shù)具有不育品種^[21-24]。部分梨品種也存在雄性不育現(xiàn)象，并推斷為細(xì)胞質(zhì)雄性不育，主要是由絨氈層發(fā)育異常或多重因素共同影響而導(dǎo)致花粉敗育，且敗育時(shí)期集中在單核小孢子晚期。先前有報(bào)道指出，黃金、八里香、夏露、夏清、天皇和新梨7號(hào)花粉敗育^[5，25-27]，與本研究結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，新高芽變、云南黃酸梨和寧霞存在花粉敗育現(xiàn)象，而綿梨、酒泉長(zhǎng)把、綠安久、龍香和六棱梨花粉量極少或無(wú)花粉，花粉是否敗育還有待驗(yàn)證。綿梨、酒泉長(zhǎng)把和綠安久可能由于花器官發(fā)育不完全、花藥較小才未檢測(cè)出花粉；通過(guò)花藥橫截面顯微觀察，發(fā)現(xiàn)龍香和六棱梨的花藥已經(jīng)開(kāi)裂，但散粉少，導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)一步檢測(cè)其花粉萌發(fā)率。因此，這些品種不能完全確定是否花粉敗育。雄性不育品種是種質(zhì)創(chuàng)新的重要材料，在育種過(guò)程中可有效簡(jiǎn)化育種程序、提高育種效率，具有較高的利用價(jià)值。目前，關(guān)于梨樹(shù)雄性不育的報(bào)道主要集中在細(xì)胞學(xué)和生理機(jī)制層面，在分子生物學(xué)方面研究較少，未來(lái)應(yīng)深入探究梨樹(shù)雄性不育機(jī)制，為合理利用梨種質(zhì)資源提供參考。

4? 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，不同梨品種花粉量與花粉活力差異明顯，花粉數(shù)量性狀變異系數(shù)大，花粉變異程度高，具有豐富的遺傳多樣性。篩選出連城石頭梨、龍都大鴨梨和大洋木梨（莆田）等15個(gè)單花藥花粉量大且花粉活力較好的品種，以及新高芽變和云南黃酸梨等9個(gè)存在花粉敗育現(xiàn)象的品種，為梨園授粉樹(shù)配置和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

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