基于網絡藥理學和分子對接探討六君子湯治療胃腸功能障礙的作用機制※

辛交蓮 龍凱澳 鄧 彪，2 李振龍，2▲

胃腸功能障礙（gastrointestinal dysfunction，GID）常出現在危重患者中，且與臨床預后較差相關，是一組涉及胃和腸道的功能性疾病，無明顯的器質性病變，可涵蓋運動和/或吸收障礙、免疫屏障受損、微生物組變化和灌注受損等。GID主要癥狀包括腹痛、腹脹、嘔吐、便秘、腹瀉等，甚者出現腸梗阻、應激性潰瘍伴出血等。GID發生機制尚不明確，可能與神經肌肉活動失調、菌群穩態被破壞、免疫系統等相關，多繼發于嚴重感染、神經功能障礙等[1-2]。在膿毒癥患者中，其發病率約為78.8%，病死率過半[3]。目前，GID 的藥物治療主要包括護胃、抗胃腸痙攣、改善腸道菌群、促進胃動力恢復等對癥治療。根據中醫辨病方法劃分，GID 歸 屬 于 中 醫 學“痞 證”“腹 脹”“胃 痛”“泄 瀉”“痞滿”等范疇，其病機為氣機逆亂、升降失常[4，5]，臨床上以老年人最為多見，危重患者尤甚。該病多為本虛標實之證，其中脾胃氣虛為其發病基礎，疾病早期多以氣滯腑實為標，疾病中期多以瘀熱內結為標，疾病晚期多以濕濁內阻為標，治療上常以補虛為主、瀉實為輔，健脾和胃貫穿治療的始終[6]。六君子湯出自《醫學正傳》，由四君子湯加陳皮、半夏組成，被廣泛用于治療脾胃虛弱所導致的消化不良、食欲不振、腹脹等。本方中以黨參替人參，同樣具有益氣健脾、燥濕化痰的功效，在臨床實踐中已得到療效證實[7-9]。

多靶點作用是中草藥治療疾病的特點，其多成分作用的復雜機制，可通過網絡藥理學研究，構建生物分子信息網絡，更好地詮釋中藥的復雜作用機制。分子對接技術通過模擬相互作用狀態，以預測藥物的活性和作用機制，同時可節省實驗時間和成本。本研究通過結合使用網絡藥理學和分子對接技術，可靈活地實現不同類型中藥成分作用于不同靶點狀態的可視化，探究六君子湯治療GID 可能存在的分子作用機制。

1 方法

1.1 篩選六君子湯藥物活性成分及相關靶點運用R 軟件運行程序于中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCM-SP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索，以口服生物利用度（oral bioavalability，OB）≥30%、分子類藥性（drug like，DL）≥0.18 為限定條件進行篩選，獲得六君子湯中6味中藥的活性成分，并根據所得活性成分在TCM-SP 中找出相應靶點。為便于后續的數據分析，在UniProt 數據庫（https：//www.uniprot.org/）中檢索篩選出的靶點蛋白，即在Uniprot 搜索欄中直接點擊Search，切換界面后于左側邊欄依次點擊“Human”“Reviewed（Swiss-Prot）”，然后在自定義欄目“Customize columns”中加入限定條件“Gene Names（primary）”，最后“Download”所篩選出靶點蛋白的Excel 表格，使用基因名（gene name）將靶點蛋白進行統一轉化，規范命名。

1.2 GID 相關靶點檢索在DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards 數據庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數 據 庫（https：//www.omim.org/）中，以“Gastrointestinal Dysfunction”為關鍵詞檢索，將所得靶點蛋白存入Excel進行合并去重，獲得GID的疾病作用靶點。

1.3 獲取六君子湯-GID 交集靶點通過上述步驟得到藥物靶點與疾病靶點后進行整合，然后導入VENNY 2.1 網 站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny） 獲取交集靶點，可通過繪制韋恩（Venn）圖以實現交集靶點的可視化。

1.4 六君子湯-成分-靶點蛋白-GID 互作網絡圖構建及PPI 網絡分析上述篩選出的藥物活性成分及其靶點，運用Cytoscape 3.10.0 軟件，構建“六君子湯-成分-靶點蛋白-GID”網絡圖，即藥物活性成分-靶點蛋白-疾病互作圖。蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡分析首先由韋恩圖所得靶點上傳至STRING網站后，勾選“最低要求的互動分數（minimum required interaction score）”為“high confidence（0.9）”，其他設置選擇默認，然后進行分析，再導出PPI 互作網絡分析圖及tsv 文件，最后利用Cytoscape 3.10.0中Network Analyzer 分析PPI 網絡，篩選其中的重要靶點。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書通路富集分析利用六君子湯及GID交集靶點，對所得的核心靶點通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進行通路富集分析，將核心靶點上傳至微生信網絡分析平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/），分析后可得分子功能（molecular functions，MF）、細胞組成（cellular components，CC）、生物過程（biological processes，BP）和KEGG 富集通路，導出可視化結果。

1.6 分子對接由pymol 軟件將配體和受體進行修飾，運用AutoDock（一種分子建模模擬軟件）進行半柔性對接，以反向驗證六君子湯藥物活性成分與核心靶點之間的作用關系，以實現計算機的虛擬驗證。此外，分子對接存在虛擬篩選的作用，通過虛擬對接所需的結合能以判斷分子的結合活性。進行分子對接之前，需依據上述所得藥物活性成分、核心共靶點結果，進行再次篩選后方可實行分子對接，在TCM-SP中進行查詢并獲得活性成分的mol 2 結構；在蛋白質結構數據庫（protein data bank，PDB）中檢索核心靶點，選擇并保存其pdb 格式文件。準備對接前的配體和受體，首先由AutoDock 軟件對藥物活性成分進行加氫、計算電荷等操作，處理成配體，接下來用pymol 對核心靶點蛋白結構進行去配體、加氫、去水等操作，處理蛋白成受體，設置Atoms為Assign AD4 type，處理好的文件均保存為pdbqt格式。采用拉馬克遺傳算法準備docking 文件，進行柔性對接，最后用pymol 將所得配體與受體進行分子對接可視化展示。

2 結果

2.1 六君子湯藥物活性成分及靶點蛋白篩選運用R 軟件實現在TCM-SP 中收集六君子湯活性成分，完成篩選后共獲得：黨參活性成分17個，茯苓活性成分6個，白術活性成分4個，陳皮活性成分5個，半夏活性成分11 個，甘草活性成分88 個。將所有活性成分對應靶點進行合并去重，統一基因名后得到潛在靶點蛋白218個。

2.2 GID 相關靶點篩選疾病相關靶點，其中，DisGeNET 中獲得15 個靶點，GeneCards 所得數據在Excel 中經過三次中位數卡值后獲得1362 個靶點，OMIM中經去重后獲得44個靶點，將所有疾病靶點合并去重后得到1376個靶點蛋白。

2.3 六君子湯-成分-靶點蛋白-GID 交集靶點網絡將藥物靶點與疾病靶點輸入Venny2.1.0 網絡平臺，得到交集靶點Venn 圖（見圖1），共108 個交集靶點；用108 個靶點輸入STRING 庫，選擇minimum required interaction score 為0.9，得PPI 圖（見圖2），圖中包含108 個節點、451 條邊，平均節點度值8.35，PPI富集P值＜1.0e-16；由Cytoscape 3.10.0 軟件綜合分析得到六君子湯-成分-靶點蛋白-GID交集靶點網絡圖（見圖3）；導出網絡分析文件，由度值降序排列選取前10 個成分為藥物核心成分，即槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等（見表1）；再由所得PPI 網絡導出tsv 文件，經Cytoscape 3.10.0 中Network Analyzer分析PPI網絡，最終獲得79個關鍵靶點（見圖4A），選取2 次Degree 中位數7、11.5 進行篩選，最終獲得PPI 中28 個靶點作為核心作用靶點（見圖4B），分 別 為：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1、RELA、MAPK14、IL6、TNF、IL10、MYC、MAPK8、ESR1、CREB1、EGFR、HIF1A、CDKN1A、STAT1、VEGFA、RB1、CCND1、CASP3、IL4、IL1B、CAV1、BCL2L1、IL2、BCL2。其中，度值排名靠前的5個靶點作為分子對接目標，分別為：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1。

表1 六君子湯藥物核心活性成分

圖1 六君子湯與GID靶點交集韋恩圖

圖2 六君子湯與GID交集靶點蛋白PPI圖

圖3 六君子湯-成分-核心靶點-GID互作網絡圖

圖4 六君子湯與GID核心交集靶點蛋白PPI網絡優化圖

2.4 富集分析進入微生信網絡分析平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/），選擇GO-KEGG 富集分析，提交79 個關鍵靶點[選擇物種為“人類（Human，has）”]，獲得富集分析圖，根據P值（校正后P值）選取與GID 相關的前10 條。KEGG 富集分析中，主要包括：脂質與粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、前列腺癌（Prostate cancer）、糖尿病并發癥通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相關病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、人巨細胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、膀胱癌（Bladder cancer）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、弓形蟲病（Toxoplasmosis）等（見圖5）。

圖5 六君子湯與GID的KEGG富集分析結果圖

GO功能分析中，生物過程主要包括：細胞對化學應激的反應（cellular response to chemical stress）、外源性凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）、對活性氧的反應（response to reactive oxygen species）、氧化應激反應（response to oxidative stress）等；細胞組成主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微結構域（membrane microdomain）、膜區（membrane region）、小凹（caveola）等；分子功能主要包括：細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結合（phosphatase binding）、DNA 結合轉錄因子結合（DNA-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結合（ubiquitin-like protein ligase binding）等（見圖6）。

圖6 六君子湯與GID的GO功能分析結果圖

2.5 分子對接結果依據“藥物-成分-核心靶點-疾病”網絡中的度（degree）值，選取degree值排名靠前的5個活性成分與核心靶點進行分子對接。根據PPI網絡及“通路-靶點-疾病”網絡篩選核心靶點，本次研究選取槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚分別與STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 靶點蛋白進行分子對接，結合能情況見表2。結果顯示普遍結合能小，結合活性高，結合能均小于-5 kal/mol，其中豆甾醇與核心靶點AKT1對接效果最好；而7-甲氧基-2-甲基異黃酮與核心靶點STAT3對接效果最差。分子對接過程中，選取部分可視化對接結果，見圖7。

表2 六君子湯與GID 分子對接結合能

圖7 六君子湯與GID分子對接部分可視化結果圖

3 討論

六君子湯用于治療危重癥中GID脾虛證患者，具有限制機體炎癥反應、調節免疫功能、改善腸道菌群等臨床療效[9，10]。本次分析結果發現，與治療GID 相關的主要活性成分包括：槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等化合物。其中槲皮素度值最高，表明其參與并作用的靶點最豐富，有研究表明其在機體內可通過調節PTEN/PI3K/AKT 和JUK 信號通路抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）釋放[11，12]；或通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路，改善膿毒癥小鼠心肌炎癥以及氧化應激反應[13，14]；并可促進糖原合成，發揮降糖作用[15]；還可調控MAPK 信號通路，促進修復被破壞的腸道黏膜屏障，增強腸道免疫[16，17]，有效維護機體腸道穩態。由此可見，中藥成分中單一化合物可通過多種途徑實現抗炎、抗感染、促免疫調節等作用，與槲皮素作用靶點多的結果相符合，同樣反映出六君子湯治療GID時作用于多靶點的復雜機制。具有抗炎作用的還有豆甾醇、木犀草素等成分，其中，豆甾醇通過與MAPK3等靶點結合參與抗炎[18]；木犀草素則通過激活SIRT1信號通路，抑制NFκB 相關炎癥反應，改善胃腸道功能[19]。由此可推測，針對GID 相關的炎癥反應，無論炎癥是原因還是結果，六君子湯應用在GID的抗炎治療中具有一定的臨床指導意義。一方面，木犀草素和黃芩素能與CYP1A1 蛋白結合，而CYP1A1 基因的高表達能破壞機體免疫防御能力，其中黃酮類成分能抑制該蛋白活性[20]；黨參中的多糖、黃酮和皂苷等成分已被證明與改善機體免疫相關，是否與調節GID 免疫相關，其機制及療效尚不明確，但卻為后續的免疫相關研究指出了前進方向。另一方面，木犀草素還能通過PI3KAKT、MARK 和TNF 等信號通路，調節胃腸運動相關的神經遞質表達，修復屏障，改善腸動力[21]；同時柚皮素與川陳皮素同樣具有促進胃腸動力的作用[22]，表1顯示，川陳皮素的OB 和DL 均較高，說明口服給藥治療GID 可達到較好的療效。β-谷甾醇作為參與治療GID的主要活性成分，發揮著降低血脂、退熱消炎、抗氧化應激、增強免疫等作用[23，24]。六君子湯在這些化學成分的共同作用下，通過調節不同通路實現治療目的，因此，其成分的探明為新藥的設計提供了新思路。

靶點蛋白中STAT3 是人體細胞中信號傳導和轉錄激活因子，研究表明受STAT3 調節的神經肽，可隨STAT3 的下調，而調節胃腸激素，進一步改善胃腸運動[25]。AKT1 屬于蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛存在于組織細胞中，參與機體細胞的增殖、生長、代謝等過程，是PI3K-AKT 通路中重要的調節分子，具有調控胃腸動力的能力[14]。靶點蛋白的存在使得藥物活性成分能夠準確地配對，知曉其作用位點，將調控信息向下游傳導，以達到治療疾病的效果。

KEGG 富集分析中，糖尿病并發癥通路富集了較多的核心靶點蛋白，同時該信號通路與腸道炎癥相關[26]；卡波西肉瘤相關病毒感染信號通路則表現出促炎性作用，誘導宿主細胞釋放過量的vIL-6、IL-6 和IL-10細胞因子，加重機體免疫反應[27]，由此可推測這兩條信號通路可能是控制GID炎性發展的重要通路，至于藥物成分具體作用于何靶點及如何調節信號通路，可在未來進行進一步的通路分析實驗驗證。

分子對接中，結合能越小說明兩者分子間契合度越高，結構越穩定。分子對接結果顯示，豆甾醇與AKT1結合能最小，結合活性最高，代表二者分子之間結合越緊密和穩定，存在較強的相互作用。結合能最小的結果不是預想中度值排名最靠前的槲皮素和STAT3，抑或是表1 中OB、DL 較高的活性成分，說明分子對接的結果是否良好與上述三個因素相關性不大，而是可能與活性成分分子結構、靶標蛋白結構及分子間作用力相關。由表2可知AKT1與各藥物活性成分結合能普遍較低，因此可推測六君子湯治療GID時主要在改善胃腸動力方面的作用較穩定。

綜上所述，六君子湯可能是通過槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等有效成分，作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 等靶點，參與糖尿病并發癥通路、卡波西肉瘤相關病毒感染等信號通路的調節，發揮改善胃腸動力、抗炎、增強免疫、修復腸道屏障等作用，從而改善GID 患者預后。這符合中草藥經多成分、多靶點、多途徑協同治療疾病的特點。本研究的不足之處在于數據挖掘不夠全面，分子對接屬虛擬驗證層面，藥理作用機制有待進一步的實驗研究進行驗證。