淫羊藿活性成分抗卵巢癌作用機制研究進展

李敏，劉芳媛，丁丹妮，韓鳳娟?

（1. 黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040；2. 黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

卵巢癌是威脅女性健康最常見的三大婦科惡性腫瘤之一［1］。流行病學調查顯示，卵巢癌發病率占所有女性惡性腫瘤的2.5%［2］，但由于早期階段患者未見明顯的臨床癥狀，超過70%的女性首診即為卵巢癌晚期（Ⅲ期和Ⅳ期）［3］，因此其病死率高，是婦科癌癥死亡的首要原因［4］。關于卵巢癌的治療一直是國際范圍內的熱點問題，雖然手術治療、鉑類藥物化療和靶向治療等手段不斷發展［5］，但在治療過程中均會出現不同程度的藥物不良反應，且患者五年生存率在40%左右，未見明顯改善［6］，其病死率呈上升趨勢［7］。中醫藥能夠增強卵巢癌放化療療效，減少不良反應，延長患者生存期，提高生存質量［8］，為晚期卵巢癌患者提供了更多選擇。

淫羊藿味辛、甘，性溫，歸肝、腎經，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕之效。本研究團隊認為“腎陽虛衰，血瘀于胞”是卵巢癌的發病機制，其中陽氣虛衰是卵巢癌發病的根本原因［9］。淫羊藿溫煦腎陽、扶助相火，以達到治療卵巢癌的目的。黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院王秀霞教授創制的驗方“理沖生髓飲”中重用淫羊藿，實驗研究發現理沖生髓飲能夠抑制卵巢癌細胞的增殖、侵襲和轉移［10-11］。

目前從淫羊藿中提取到出明確具有抗卵巢癌活性的有效成分有淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ［12-14］。本文就淫羊藿主要活性成分淫羊藿苷、淫羊藿素和淫羊藿次苷Ⅱ的抗卵巢癌研究現狀和作用機制進行綜述，以期為其治療卵巢癌的深入研究提供參考依據。

1 促進卵巢癌細胞凋亡

細胞凋亡是由多種基因嚴格控制，多條信號通路協同參與的一種細胞死亡方式，是機體維持自身新陳代謝有序進行的重要生理機制。內源性線粒體凋亡是細胞凋亡發生的重要途徑之一。當細胞內部受到信號刺激時（如細胞氧化應激、DNA 損傷、細胞生長因子缺失等），Bcl-2 家族蛋白通過改變線粒體外膜通透孔，通過控制線粒體通透性調節細胞凋亡［15］，如Bax 通過在線粒體膜上打孔增加線粒體膜通透性，是促凋亡因子；而Bcl-2 插入線粒體膜減少線粒體膜通透性，是抑凋亡因子。當線粒體膜通透性改變，線粒體中Cyt C的釋放及Caspase級聯反應，促使Caspase-9的活化和進一步激活Caspase-3 或Caspase-7，從而引起細胞凋亡［16］。

LI等［14］采用流式細胞術和Caspase-3比色法觀察在0、13、25、50 μmol/L 淫羊藿苷作用下的卵巢癌A2780 細胞凋亡情況，結果發現A2780 細胞發生明顯凋亡且呈劑量依賴性，其凋亡的機制可能通過抑制Bcl-2蛋白表達，誘導了Caspase-3的活性，啟動細胞凋亡的內在途徑來實現。淫羊藿苷可抑制多種人卵巢癌細胞系的增殖，如A2780 細胞、SKOV3 細胞和SKVCR 細胞，通過下調Bcl-2 水平，上調Caspase-3表達誘導卵巢癌細胞的凋亡［17-18］。研究發現，淫羊藿素可以同時調控促凋亡因子Bax和抑凋亡因子Bcl-2，發揮線粒體途徑凋亡的作用［19］。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路是卵巢癌患者腫瘤組織中異常活躍的信號通路，也是抑制卵巢癌細胞凋亡的關鍵通道之一［20］，參與卵巢癌線粒體途徑凋亡。PI3K 接受上游信號如多種生長因子和信號傳導復合物被激活，被激活的PI3K 產生第二信使PIP3，促使Akt 蛋白磷酸化［21］。活化后的Akt 導致下游的一系列反應，如調節Bcl-2 蛋白的活性，抑制卵巢癌細胞線粒體途徑凋亡［22］。同時Akt 直接或間接磷酸化mTOR。而mTOR 是負責細胞內核糖體生成的重要調控因子，在細胞增殖中發揮關鍵作用［23］。

PTEN 是PIP3-磷酸酶，通過將PIP3 去磷酸化發揮與PI3K 相反的功能［22］，是PI3K/Akt信號通路的負調控因子，被稱為“抑癌基因”。侯科名等［24］將人卵巢癌細胞SKOV3 細胞接種于6 孔板，37 ℃培養過夜，之后以5、10、20 μmol/L 濃度的淫羊藿素處理48 h，通過流式細胞術檢測發現不同濃度淫羊藿素組SKOV3 細胞凋亡率較空白對照組顯著上升。同時，利用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法進行檢測，結果表明淫羊藿素處理過的SKOV3細胞中PTEN 基因表達較空白組明顯上升，而PI3K、Akt 基因表達與之相反，且呈濃度相關性下降，蛋白印跡（Western blot）實驗結果也予以佐證。淫羊藿素可以通過抑制PTEN 表達的方式調控PI3K/Akt信號通路，從而達到促進細胞凋亡的目的。

野生型p53 是重要的卵巢癌抑制基因［25］，與Akt/mTOR信號通路密切相關。p53可與Akt/mTOR 信號通路中蛋白結合，激活Akt活性［26］。淫羊藿素在40 μmol/L濃度下可以誘導卵巢癌順鉑敏感細胞OV2008、C13*和卵巢癌順鉑耐藥細胞A2780 的凋亡，并且以時間依賴的方式增加卵巢癌細胞中p53 的磷酸化，抑制Akt 和mTOR 的磷酸化，以上研究表明淫羊藿素介導的卵巢癌細胞凋亡與p53的激活和Akt/mTOR的抑制有關［27］。

2 影響卵巢癌細胞的侵襲與轉移

卵巢癌細胞向周圍組織侵襲和遠處組織轉移的惡性行為，是其與良性腫瘤的主要區別，直接影響卵巢癌預后的重要因素。淫羊藿苷通過抑制癌細胞的侵襲和轉移，從而可以控制卵巢癌細胞的生長［28］。

2.1 抑制卵巢癌EMT

癌細胞借助上皮-間葉細胞轉化（EMT）過程獲得侵襲性和轉移性，是腫瘤組織轉移的關鍵渠道［29］。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）作為一種鈣依賴型跨膜蛋白，其水平下降可以導致細胞的黏附力降低，中斷細胞間的相互作用，使癌細胞獲得易于侵襲和轉移的特性［30］。N-鈣黏蛋白（N-cadherin）是典型的成纖維細胞標志物。研究顯示，術后病理組織中N-cadherin 高表達的卵巢癌患者更易觸發癌細胞侵襲，在5 年的隨訪中臨床復發率大約是N-cadherin 低表達患者的兩倍［31］。波形蛋白（Vimentin）主要存在于各種間充質細胞內。作為間質細胞的標志物，Vimentin 增加意味著間質細胞表型的高表達。在EMT 過程中，Vimentin 與Snail、Slug、Twist 和ZEB1/2 等EMT 誘導劑的基因以及關鍵的表觀遺傳因子密切相關［32］。

李秋瑞等［33］經劃痕實驗及Transwell侵襲遷移實驗發現，予以淫羊藿素5、10、20 μmol/L處理48 h后的卵巢癌細胞A2780 侵襲遷移數量和侵襲遷移率明顯減少。與此同時，Western blot 與PCR 結果顯示，E-cadherin 的蛋白和mRNA表達上升，N-cadherin、Vimentin表達水平總體下降。該研究提示淫羊藿素可通過阻止卵巢癌細胞EMT 的進程，減弱其遷移、侵襲能力，該作用呈濃度依賴性。在EMT 過程中，Akt/mTOR 信號通路已被證實發揮著不可忽視的誘導作用。Akt/mTOR 信號通路的磷酸化，激活EMT 誘導劑因子Snail、Slug、Twist 等在細胞核中的聚集，導致E-cadherin 表達下降［34］。淫羊藿素可以抑制Akt/mTOR 信號通路的磷酸化，增加E-cadherin 的表達，降低Vimentin 的表達，對順鉑敏感的卵巢癌細胞和順鉑耐藥的卵巢癌細胞的遷移與侵襲具有明顯的抑制作用［35］。

2.2 抑制卵巢癌侵襲與轉移相關蛋白酶

基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）被認為是癌細胞的侵襲與轉移過程中重要的蛋白水解酶。腫瘤細胞的細胞外基質（ECM）與癌細胞基底共同構成腫瘤侵襲與轉移的第一道生物屏障［36］。MMPs 能夠降解ECM 中大部分蛋白成分的蛋白酶，影響細胞間黏附因子的效力，從而促進腫瘤細胞突破癌細胞基底和ECM，完成侵襲和轉移［37］。MMPs有20多種，目前研究對MMP-2、MMP-9較為深入。MMP-2和MMP-9在水解ECM 這一物理屏障的同時，使得ECM 內部各種細胞因子（如VEGF、生長因子TGF-β、炎性因子IL-8）得以釋放并活化［38-39］，進一步促進腫瘤血管的新生，為腫瘤組織的侵襲與轉移提供營養支持和代謝通道。

研究發現，卵巢癌病理組織中的MMP-2、MMP-9經免疫組化SABC 三步法檢測，均呈陽性表達，并且與卵巢癌患者的臨床分期存在相關性［40］。進一步的研究顯示，MMP-2 和MMP-9 在卵巢癌細胞中高表達，而敲除MMP-2 和MMP-9 可以減弱卵巢癌細胞的侵襲和遷移［41］。何泉［42］研究發現，淫羊藿苷對卵巢癌細胞SKOV3侵襲與轉移能力的影響呈濃度相關性上升，通過RT-PCR 檢測證明卵巢癌細胞中的MMP-2、MMP-9mRNA 表達隨著淫羊藿苷劑量的增加而下降，因此淫羊藿苷可以通過抑制MMP-2、MMP-9 水平，從而影響卵巢癌細胞的侵襲與轉移。

3 阻滯卵巢癌細胞周期

細胞周期的運行決定細胞增殖的速率，阻滯卵巢癌細胞的細胞周期可以有效地抑制卵巢癌的發展［43］。

3.1 靶向相關蛋白阻滯細胞周期

細胞周期的關鍵調節物質周期蛋白依賴性激酶（CDK）及調節其功能的細胞周期蛋白（Cyclin）共同推動細胞通過G1/S 期檢查點進入DNA 的合成和G2/M期檢查點開始有絲分裂［44-45］。Cyclin D1 和Cyclin E 是細胞周期G1/S期檢查點調控蛋白，Cyclin B1蛋白是G2/M期檢查點調控蛋白，均擔任推動細胞通過檢查點的調控作用［46］。細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CKI，如p21、p16、p53等）與Cyclin相拮抗，抑制CDK的活性，維持細胞周期運行的動態平衡。Cyclin過度激活或抑制CKI活性均會打破了這種動態平衡［47-48］。p53能激活CKI1產生p21蛋白，抑制CDK-Cyclin磷酸化激酶活性，阻滯卵巢癌細胞周期運行［49］。

研究發現，25 μg/mL 的淫羊藿苷可以將SKOV3細胞阻滯在G2/M 期，抑制其增殖［50］。在用淫羊藿苷（1×10-6mol/L）處理過的SKOV3 細胞G1 期百分比上升，G2 期細胞無明顯變化，S 期細胞顯著下降，Cyclin D1 和Cyclin E 的蛋白質和mRNA 水平顯著降低，p21蛋白和mRNA 表達上升，說明淫羊藿苷可以通過提高p21 水平，抑制CDK 和Cyclin 對SKOV3 細胞周期的調控作用，將細胞阻滯在G1期［51］。以20 μmol/L濃度的淫羊藿素處理過的p53野生型C13*細胞株的G1期百分比升高，Cyclin E蛋白表達下降，p53蛋白表達上升［52］，說明淫羊藿素可以靶向激活p53蛋白，使細胞中周期調節蛋白Cyclin表達下降，抑制卵巢癌細胞的生長。

3.2 調節Wnt/β-catenin信號通路阻滯細胞周期

Wnt/β-catenin 信號通路在腫瘤細胞的增殖、分化和轉移中發揮重要作用［53］。通過Wnt/β-catenin 信號通路對下游細胞周期相關靶基因的激活，可促進卵巢癌細胞增殖［54］。β-catenin 是該通路上的核心蛋白分子，將信號從細胞質傳遞到細胞核。細胞外Wnt 配體蛋白與靶細胞膜上的Wnt 受體蛋白結合，從而激活細胞內相關蛋白，β-catenin 降解復合物的降解活性得以抑制，游離狀態的β-catenin 在細胞質中不斷蓄積并最終入核，與轉錄因子結合，刺激下游諸多靶基因，如c-myc、Cyclin D1、survivin 的轉錄［55］。而c-myc、Cyclin D1、survivin 均是細胞增殖和細胞周期的調控因子。淫羊藿苷能夠降低Wnt/β-catenin 通路中β-catenin 的表達，并且能夠抑制其下游c-myc、Cyclin D1 的基因表達和蛋白水平，同時細胞增殖也受到抑制［51，56］。microRNAs是Wnt/β-catenin信號通路的重要調控因子。FU等［57］通過GSEA分析在用淫羊藿苷處理過的卵巢癌SKOV3細胞中，Wnt/β-catenin信號通路被顯著下調，繼而抑制該信號通路下游靶蛋白Cyclin D1 和survivin 的表達，使用miR-1-3p 抑制劑可以逆轉淫羊藿苷對Wnt/β-catenin 通路的抑制，并且在BALB/C 鼠的卵巢癌組織中同樣得以驗證，說明淫羊藿苷通過上調卵巢癌中miR-1-3p 水平抑制Wnt/β-catenin 信號通路，從而阻滯Wnt/β-catenin 信號通路下游蛋白對細胞周期和細胞增殖的調控。

4 誘導卵巢癌細胞自噬

自噬有利于細胞在外界刺激中，通過利用溶酶體降解自身胞內蛋白和受損細胞器，維持自身穩態。自噬缺陷會影響DNA 損傷的正確修復和致癌因子的激活，導致卵巢癌的發生［58］。自噬激活有助于抑制卵巢癌的發生發展。mTOR 是調節自噬的重要因子。當細胞處于生長激素受限，營養缺乏狀態下，Akt 調節mTOR 失能，AMPK 通過磷酸化TSC2，使mTOR 活性受到抑制，其下游的ULK1激活，活化的ULK1將Beclin-1磷酸化［59］，這是誘導自噬的重要條件。Beclin-1 是在哺乳動物中發現的第一個與自噬相關的基因。Beclin-1 和ATG-5 分別與其他蛋白形成復合物，促成自噬體的形成［60］。p62 表達往往與自噬活性呈負相關。在自噬體延伸階段，p62能夠連接LC3（公認的自噬標記物）和聚泛素化蛋白之間的橋梁，與新的自噬體膜結合，參與新的自噬體膜的形成［61］。YUAN 等［19］經Western blot 實驗發現，經60 μmol/L 淫羊藿次苷Ⅱ處理SKOV3 細胞中Akt、mTOR、p62 表達下降，p-AMPKα、Beclin-1、ATG-5 表達較對照組上升，說明淫羊藿次苷Ⅱ激活自噬生成和自噬體的延伸。miRNA 也參與卵巢癌自噬的調節。當淫羊藿次苷Ⅱ與miR-144-3p 抑制劑結合處理SKOV3 細胞時表現出對自噬的抑制［19］。IGF2R 是Akt/mTOR 通路的上游調節因子，miR-144-3p 是IGF2R 的調節靶點。miR-144-3p 通過靶向IGF2R 抑制Akt/mTOR 通路參與自噬的調節。

5 促進卵巢癌細胞焦亡

不同于細胞凋亡的溶解性死亡途徑，細胞焦亡是一種通過細胞不斷膨脹變大致使細胞膜破裂和細胞內容物向細胞外微環境的釋放，由此激發胞外炎癥反應的一種程序性死亡方式［62］。細胞焦亡在惡性腫瘤中扮演著重要角色，參與腫瘤免疫微環境和激發抗卵巢瘤的免疫應答［63-64］。在經典的細胞焦亡途徑中，NLRP3、NLRC4、AIM2、Pyrin 等在細胞內感應到細胞壓力信號（如感染、炎癥、氧化應激等）后被激活，形成炎性小體，并將pro-caspase-1 切割成為具有活性的Caspase-1，Caspase-1 將繼續切割pro-IL-1β，形成有生物活性的IL-1β 并釋放在細胞外，擴大細胞外炎癥反應，激發機體內的免疫應答［65］。

淫羊藿苷對卵巢癌的抗腫瘤作用部分是通過激活細胞焦亡實現的。氧化應激通過產生過多的ROS，破壞線粒體釋放的DNA，激活NLRP3 等炎癥小體，是引發細胞焦亡原因之一［66］。以淫羊藿次苷Ⅱ干預SKOV3細胞6 h后細胞內ROS含量顯著增加。Western blot 實驗發現，ROS 含量增加上調了SKOV3 細胞中NLRP3、Caspase-1 和IL-1β 等蛋白的表達［67］。以上研究證實淫羊藿次苷Ⅱ可以通過誘導卵巢癌氧化應激激活細胞焦亡以此拮抗腫瘤的發展。

6 結語與展望

目前淫羊藿活性成分對卵巢癌的研究主要在實驗階段，通過檢測相關因子的活性、基因表達和蛋白水平，探索淫羊藿苷在促進卵巢癌細胞凋亡、影響卵巢癌細胞的侵襲和轉移、阻滯卵巢癌細胞的細胞周期、誘導卵巢癌細胞自噬和促進卵巢癌細胞焦亡方面的作用機制，表明淫羊藿活性成分具有治療卵巢癌的可能。2023年1月以淫羊藿素為主要成分的中藥制劑淫羊藿素軟膠囊被國家藥監局優先審評批準上市，但其適用范圍尚未涉及卵巢癌。將來在充實實驗數據的同時，應積極開展淫羊藿素軟膠囊治療卵巢癌的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗，拓寬淫羊藿素軟膠囊的適用范圍，發揮中國傳統醫藥在抗卵巢癌治療方面的優勢，為卵巢癌患者的治療提供新的選擇。