灌胃牙齦卟啉單胞菌對2型糖尿病小鼠結腸機械屏障及免疫屏障影響的研究

【摘要】背景 牙齦卟啉單胞菌（Pg.）是牙周炎的主要致病菌，研究發現Pg.能夠通過口腔-腸道途徑對2型糖尿病（T2DM）在內的全身疾病產生影響，而其具體機制尚不完全明確。目的探究Pg.是否通過改變腸道機械屏障及免疫屏障對T2DM產生影響。方法 40只SPF級小鼠，隨機挑選24只構建T2DM模型，建模成功小鼠中挑選16只分為模型組（DM組，n=8）和模型+Pg.組（PD組，n=8），其余16只小鼠分為空白對照組（N組，n=8）和Pg.組（n=8）。建模后觀察小鼠體質量和空腹血糖（FPG），第5周進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT），繪制OGTT曲線并計算曲線下面積（AUC）。第7周起Pg.組和PD組灌飼Pg.菌液，連續灌飼5周。采用酶聯免疫吸附測定脂多糖（LPS），實時熒光定量PCR檢測結腸緊密連接蛋白及炎癥因子，蘇木素-伊紅（HE）染色觀察小鼠結腸組織病變。采用Pearson相關性或Spearman秩相關分析探究小鼠FPG與結腸緊密連接蛋白mRNA表達及血清LPS含量的關系。結果 灌胃前第2～6周DM組體質量高于N組、Pg.組，PD組體質量高于N組，第3～6周PD組體質量高于Pg.組（Plt;0.05）。第9～11周N組、Pg.組體質量高于DM組、PD組，第11周PD組體質量低于DM組（Plt;0.05）。第3～6周PD組FPG高于N組、Pg.組，第4～6周DM組高于N組、Pg.組（Plt;0.05）。第7～11周Pg.組FPG低于DM組、PD組，PD組高于N組，第10、11周PD組高于Pg.組（Plt;0.05）。DM組AUC高于N組、Pg.組，PD組高于N組、DM組、Pg.組，PD組LPS高于N組、DM組（Plt;0.05）。PD組緊密連接蛋白1（ZO-1）低于N組，DM組閉合蛋白低于N組，PD組閉合蛋白低于N組、DM組、Pg.組，PD組白介素（IL）-17A低于N組、Pg.組，N組IL-10高于DM組、Pg.組、PD組，PD組腫瘤壞死因子α高于N組、DM組、Pg.組，Pg.組、PD組Toll樣受體4高于N組（Plt;0.05）。相關性分析結果表明，FPG與LPS呈正相關，與閉合蛋白、ZO-1呈負相關（Plt;0.05）。病理結果顯示Pg.組和DM組固有層可見結締組織增生，伴淋巴細胞灶性浸潤，PD組固有層伴淋巴細胞灶性浸潤。結論 Pg.可能通過破壞腸道機械屏障及免疫屏障導致LPS入血，加重T2DM小鼠糖代謝紊亂。

【關鍵詞】 糖尿病，2型；葡萄糖代謝障礙；牙齦卟啉單胞菌；腸道緊密連接蛋白；腸道免疫

【中圖分類號】 R 587.1 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0386

Effects of Irrigation of Porphyromonas Gingivalis on Colonic Mechanical and Immune Barriers in Type 2 Diabetic Mice

LI Xiaowen1，YAN Fuhua2，CHEN Wenwen1，HUANG Mingkun1，MO Chaolun3，ZHANG Junmei1*

1.College of Stomatolgy of Guizhou Medical University，Guiyang 550001，China

2.Nanjing University，Nanjing 210008，China

3.Stomatology Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550001，China

*Corresponding author：ZHANG Junmei，Chief physician/Professor；E-mail：zjm46688@126.com

【Abstract】 Background Porphyromonas gingivalis（Pg.）is the main pathogen of periodontitis. Studies have found that Pg. can affect systemic diseases including type 2 diabetes mellitus （T2DM）through oral-intestinal pathway，but its specific mechanism remains unclear. Objective To explore whether Pg. has an effect on T2DM by changing intestinal mechanical and immune barriers. Methods A total of 24 among 40 SPF mice were randomly selected to construct T2DM models，among the successful models，16 mice were selected to be divided into the model group（DM group，n=8）and model+Pg. group（PD group，n=8），and the other 16 mice were divided into the control group（N group，n=8）and Pg. group（n=8）. After modeling，body mass and fasting plasma glucose（FPG）of mice were observed，and oral glucose tolerance test（OGTT）was performed at the 5th week，OGTT curve was plotted and the area under the curve（AUC）was calculated. Pg. group and PD group were gavaged with Pg. bacterial solution from the 7th week for 5 consecutive weeks. Lipopolysaccharide（LPS）was determined by enzyme-related immunosorbent assay（ELISA），colonic tight-junction protein and inflammatory factors were detected by real-time fluorescence quantitative PCR，and colonic tissue lesions were observed by hematoxylin-eosin（HE）staining. Pearson correlation or Spearman correlation analysis was used to investigate the relationship of FPG with colonic tight junction protein mRNA expression and serum LPS levels in mice. Results Body weight of DM group was higher than that of N group and Pg. group at 2nd to 6th weeks before irrigation（Plt;0.05），and body weight of PD group was higher than that of N group and body weight of PD group was higher than that of Pg. group at 3rd to 6th weeks before irrigation（Plt;0.05）. The body weight of N group and Pg group was higher than that of DM group and PD group at 9th to 11th weeks，and the body weight of PD group was lower than that of DM group at 11th week（Plt;0.05）. FPG in PD group was higher than that in the N and Pg. groups at 3rd to 6th weeks，and FPG in the DM group at 4th to 6th weeks was higher than that in N and Pg. groups. FPG of Pg. group was lower than that of the DM group and PD group at 7th to 11th weeks，PD group was higher than that of the N group，and PD group at week 10 and 11 was higher than the Pg. group（Plt;0.05）. AUC in the DM group was higher than that in the N group and Pg. group，and PD group was higher than that in the N group，DM group and Pg. group（Plt;0.05）. LPS of PD group was higher than that of N group and DM group（Plt;0.05）. Tight junction protein 1（ZO-1）in the PD group was lower than that in the N group，occludin in the DM group was lower than that in the N group，occludin in the PD group was lower than that in the N group，DM group and Pg. group（Plt;0.05）. The interleukin（IL）-17A in the PD group was lower than that in the N group and Pg. group，and IL-10 in the N group was higher than that in the DM group and Pg. group（Plt;0.05）. Tumor necrosis factor α in the PD group was higher than that in the N group，DM group and Pg. group（Plt;0.05）. Toll-like receptor 4 in the Pg. group and PD group was higher than that in N group（Plt;0.05）. Correlation analysis showed that FPG was positively correlated with LPS，and negatively correlated with occludin，ZO-1（Plt;0.05）. The pathological results showed connective tissue hyperplasia with focal lymphocyte infiltration in the lamina propria in the Pg. and DM groups，and the lamina propria with focal lymphocyte infiltration in the PD group. Conclusion Pg. may aggravate the glucose metabolism disorders of T2DM mice by disrupting the intestinal mechanical barrier and immune barrier leading to LPS entry into the bloodstream.

【Key words】 Diabetes Mellitus，type 2；Glucose metabolism disorders；Porphyromonas gingivalis；Intestinal tight junction protein；Intestinal immune

牙周炎是由菌斑微生物感染引起牙周組織的慢性炎癥性疾病，是導致成年人牙列缺損、缺失的重要原因，還與多種代謝性、炎癥性和自身免疫性疾病如2型糖尿病（T2DM）、高脂血癥、動脈粥樣硬化性血管疾病和類風濕關節炎等密切相關［1］。T2DM是發病率增長最快的代謝性疾病［2］，其主要特征是胰島素分泌相對不足和胰島素抵抗，其致死率僅次于心血管疾病和腫瘤。研究發現，牙周炎與T2DM存在相互促進的關系，T2DM是牙周炎的重要危險因素，同時牙周炎也可能影響T2DM的發生發展［3-4］。

近年來，多項研究證實，牙周炎特異性菌群能通過腸道菌群及腸道屏障對全身多器官疾病產生影響，呈現“口-腸-多器官”模式，如結腸炎、關節炎、腦病、糖尿病、高脂血癥等［5-7］。牙齦卟啉單胞菌（Pg.）是牙周炎的主要致病菌，研究發現，其能夠隨吞咽進入腸道，引起腸道微生物區系組成發生改變，導致肝臟、脾臟、腸道等器官出現炎癥反應［8］。結腸黏膜的厭氧和高pH環境更有利于Pg.的黏附［9］，一旦發生菌群失調，有害細菌占據主導地位，會引起宿主腸道免疫狀態以及腸道屏障功能受損，細菌毒素和代謝物等毒性物質可能通過腸道進入體循環中，導致身體遠處各組織和器官受損［10］，進而增加了以低度炎癥為特征的其他系統性疾病的發病風險，而Pg.引起腸道屏障破壞及免疫失衡的具體機制尚不完全明確。

本研究建立T2DM小鼠模型，通過灌胃的方式，模擬牙周炎患者唾液內Pg.隨吞咽動作進入腸道，觀察腸道炎癥及緊密連接蛋白變化，以及其與血糖變化之間的關系，探索Pg.是否通過改變腸道免疫屏障和機械屏障功能影響糖代謝。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：2022年5月—2023年2月，40只6～8周齡C57BL/6J雄性小鼠，SPF級，體質量20～22 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司（動物許可證號：110322220102485742）。實驗小鼠適應性喂養1周后進行實驗，期間12 h光照和12 h黑暗交替循環，溫度（24±1）℃，濕度（60±10）%，小鼠自由攝食、飲水。動物實驗于貴州醫科大學實驗動物中心完成，通過貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準（審批號：2201457）。

1.1.2 主要試劑：鏈脲佐菌素（STZ）（索萊寶科技有限公司，貨號：S8050）；Pg.株（ATCC33277）（北納生物，貨號：BNCC236547）；小鼠脂多糖（LPS）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（華美生物，貨號：CSB-E09308H）；腦心浸液瓊脂（BHI）固體培養基（索萊寶科技有限公司，LA0360）；Trizol（Takara，貨號：9108）；cDNA反轉錄試劑盒（Prime ScriptTM RT masters Mix，Takara，貨號：RR036A）；TB Green Premix Ex Taq（Takara，貨號：RR820A）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號：G1003）。主要儀器：羅氏卓越精采型血糖儀；實時熒光定量PCR儀（Bio-RAD）；Infinite F50經濟型光吸收酶標儀（TECAN）；無菌厭氧箱（AW500TG）（ELECTROTEK）；低溫高速離心機（Thermo Fisher）；高速低溫組織研磨機（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與建模：適應性喂養1周后，采用隨機數字表法隨機選取24只小鼠用于T2DM建模，采用高脂飲食（標準60%脂肪供能純化型飼料）連續飼養4周，期間自由攝食、飲水。其余16只小鼠隨機分為空白對照組（N組，n=8）和Pg.組（n=8），同期給予對照飼料（35%脂肪供能飼料）喂養。建模小鼠腹腔注射30 mg/kg的2% STZ，1周內連續腹腔注射3次，N組腹腔注射相同體積的0.1 mmol/L（pH=4.5）的檸檬酸緩沖液，以2次空腹血糖（FPG）≥11.1 mmol/L或隨機血糖≥16.7 mmol/L為T2DM成模標準，保留成功模型（21只），隨機選取16只分為模型組（DM組，n=8）和模型+Pg.組（PD組，n=8），建模成功后更換為35%脂肪供能飼料繼續飼養。

1.2.2 Pg.株用BHI固體培養板37 ℃厭氧環境（80% N2、10% H2、10% CO2）培養7 d。轉移至BHI液體培養基增菌16～18 h，于細菌生長對數期時，以3 500 r/min

離心5 min（離心半徑8.6 cm），棄上清液。用無菌磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細菌沉淀后，測量細菌懸液吸光度，調整濃度為1×109 CFU/mL。于第7周起Pg.組和PD組灌飼200 μL含1×109 CFU/mL Pg.的菌液，2次/周，DM組和N組灌飼等量無菌PBS，連續灌飼5周。

1.2.3 建模后和灌胃后每日（或者隔1日）觀察小鼠的精神狀態、活動情況、毛發色澤變化、墊料干濕情況等一般狀態。檢測小鼠體質量變化及FPG，1次/周。在5周末進行口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）：隔夜禁食12 h，對小鼠按2 g/kg劑量灌胃25%葡萄糖注射液，在0、30、60、90、120 min時間點尾靜脈采血，使用血糖計測定血糖值。繪制OGTT曲線，計算曲線下面積（AUC）。

1.2.4 灌胃5周后，1.25%阿佛丁（0.2 mL/10 g）腹腔注射麻醉小鼠后心臟取血收集血液，后用5%水合氯醛（0.2 mL/10 g）腹腔注射麻醉處死，收集結腸組織（近盲腸段），取部分置于4%多聚甲醛固定，部分加入RNA穩定液置于-80 ℃冰箱用于后續檢測。

1.2.5 心臟取血收集于1.5 mL離心管中，4 ℃過夜后于2～8 ℃，1 000×g離心15 min，取上清液，按照小鼠LPS ELISA試劑盒說明書步驟加樣，全自動酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD值），繪制標準曲線計算得相應濃度。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測結腸緊密連接蛋白及炎癥因子：稱取0.1 g結腸組織，低溫高速組織研磨機進行研磨，Trizol法提取RNA，超微量核酸分析儀測量總RNA濃度。根據逆轉錄試劑盒，將提取的總RNA反轉錄為cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，使用TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ進行qPCR檢測，每樣本設置3個復孔并計算mRNA的相對表達，引物由生工生物工程股份有限公司提供。引物序列見表1。

1.2.7 取固定好的結腸樣本進行梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋切片，HE染色，于光學顯微鏡下觀察小鼠結腸組織病變。

1.3 統計學分析

采用SPSS 27.0軟件進行數據分析，采用GraphPad Prism 9.0軟件繪圖。符合正態分布的計量資料以（x-±s）表示，多組間均數比較采用重復測量方差分析或單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗或Bonferroni法；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間兩兩比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。采用Pearson相關性或Spearman秩相關分析探究小鼠FPG與結腸緊密連接蛋白mRNA表達及血清LPS含量的關系。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠一般狀態及體質量比較

N組和Pg.組小鼠充滿活力，毛發柔軟有光澤，墊料干燥，DM組和PD組精神低落，運動較少，墊料潮濕，毛發暗淡，有刺激性氣味，飲食及飲水量增加。灌胃前第2～6周小鼠體質量比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；灌胃前第2～6周DM組體質量高于N組、Pg.組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；PD組第2～6周體質量高于N組，第3～6周PD組體質量高于Pg.組，差異有統計學意義（Plt;0.05）。第1周4組小鼠體質量比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），見表2。灌胃后重復測量方差分析結果表明，組別與時間對小鼠體質量存在交互作用（P交互lt;0.01），組別與時間對小鼠體質量主效應均顯著（P組間lt;0.01，P時間lt;0.01）。第9～11周N組、Pg.組體質量高于DM組、PD組，第11周PD組體質量低于DM組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

2.2 4組小鼠血糖情況

灌胃前第3～6周4組小鼠FPG比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），其中第3～6周PD組高于N組、Pg.組，第4～6周DM組高于N組、Pg.組，差異有統計學意義（Plt;0.05），第1～2周4組小鼠FPG比較，差異無統計學意義（Plt;0.05），見表4。灌胃后重復測量方差分析結果表明，組別與時間對小鼠FPG存在交互作用（P交互=0.021），組別與時間對小鼠FPG主效應均顯著（P組間lt;0.01，P時間lt;0.01）。第7～11周Pg.組FPG低于DM組、PD組，PD組高于N組，第10、11周PD組高于Pg.組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表5。

組別與時間對小鼠OGTT試驗各時間點血糖存在交互作用（P交互=0.013），組別與時間對小鼠血糖主效應均顯著（P組間lt;0.01，P時間lt;0.01）。0～120 min DM組高于N組、Pg.組，PD組高于N組、DM組、Pg.組，120 min Pg.組高于N組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表6。4組小鼠OGTT AUC及血清LPS含量比較，差異有統計學意義（Plt;0.01），其中DM組AUC高于N組、Pg.組，PD組高于N組、DM組、Pg.組，PD組LPS高于N組、DM組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表7。

2.3 4組小鼠結腸緊密連接蛋白及炎癥因子mRNA表達水平

4組小鼠緊密連接蛋白1（ZO-1）、閉合蛋白、白介素（IL）-17A、IL-10、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、Toll樣受體（TLR）4比較，差異有統計學意義（Plt;0.05），其中PD組ZO-1低于N組，DM組閉合蛋白低于N組，PD組閉合蛋白低于N組、DM組、Pg.組，PD組IL-17A低于N組、Pg.組，N組IL-10高于DM組、Pg.組、PD組，PD組TNF-α高于N組、DM組、Pg.組，Pg.組、PD組TLR4高于N組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表8。

2.4 FPG與結腸緊密連接蛋白mRNA和血清LPS含量的相關性分析

相關性分析結果表明，FPG與LPS呈正相關（rs=0.635，Plt;0.01），與ZO-1（r=-0.377，P=0.034）、閉合蛋白呈負相關（rs=-0.746，Plt;0.01）。

2.5 4組小鼠結腸組織HE染色結果

結腸HE染色切片顯示，N組結腸隱窩深度及形態結構正常，腸腺數量豐富，未見明顯炎性細胞。Pg.組和DM組固有層可見結締組織增生，伴淋巴細胞灶性浸潤，局部間質也可見少量淋巴細胞浸潤；而PD組固有層伴淋巴細胞灶性浸潤；局部間質可見少量淋巴細胞浸潤；黏膜下層輕度水腫，結締組織排列稀疏，伴少量淋巴細胞浸潤，結腸隱窩深度變淺，部分隱窩形態不典型，見圖1。

3 討論

每人每天可以分泌1.0～1.5 L的唾液。在生理條件下，由于受到胃酸和堿性膽汁的保護，唾液菌群很少到達腸道。然而，牙周炎患者的唾液菌群與口腔健康者明顯不同［11-12］。牙周病患者的唾液中Pg.等有害菌豐度明顯更高［13］。21～23歲重度牙周炎患者每天吞咽1012～1013個Pg.［14］。Pg.由于其抗酸性可能會通過胃酸到達腸道，破壞腸道內環境的平衡［10］。

在腸道內，腸道屏障由微生物屏障、黏液屏障、物理屏障和免疫屏障組成，構成了腸道抵御外部病原體的第一道防線，無論是哪一層腸道屏障的破壞，均可能會導致“腸瘺”的形成，腸道內細菌及代謝產物則可能通過腸道進入血液，加重多種系統的疾病，如關節炎、肝病、腦病、T2DM、炎癥性腸病（IBD）、肥胖等［7，15-17］。本研究發現，Pg.灌胃后，腸道免疫屏障及機械屏障功能受損，T2DM小鼠的血糖調節能力和胰島素敏感性降低，在高血糖的基礎上，糖代謝紊亂進一步加重。

腸道免疫屏障主要由免疫細胞及其細胞因子組成，腸道免疫調節細胞作為腸道菌群與糖尿病之間的“橋梁”，免疫平衡的破壞伴隨T淋巴細胞及細胞因子平衡紊亂，通過影響胰腺、肝臟等其他內分泌器官，對機體免疫狀態、糖脂代謝和胰島素敏感性產生不利影響［18］。CD4+ T輔助細胞（Th）在維持腸道免疫中起著關鍵作用，CD4+ IL-17+Th17細胞和CD4+CD25+Foxp3+ T細胞（Th17/Treg細胞）之間的平衡是免疫穩態的基礎。腸道免疫失衡時常表現為Th17/Treg細胞及相關細胞因子比例失衡，表現為Th17相關促炎因子IL-6、TNF-α、IL-17A和IL-17F濃度增加，而Treg相關抗炎因子轉化生長因子β（TGF-β）、IL-10則相應減少。本研究發現，灌胃Pg.后，T2DM小鼠結腸內促炎因子TNF-α的表達增加，而抗炎因子IL-10的基因表達進一步減少，HE染色結果顯示，PD組結腸固有層及間質內炎癥性病理變化較DM組和Pg.組更為明顯，表明結腸內可能存在Th17/Treg比例失調，腸道免疫穩態破壞更加顯著。其中IL-10不僅在免疫反應中起抗炎作用，近年來多項研究發現，其在糖尿病發展中也發揮一定保護作用。YUAN等［19］發現，T2DM患者外周血中Th17/Treg細胞百分率及相關細胞因子（主要是IL-10和TGF-β）水平顯著降低。STZ誘導的非肥胖型糖尿病小鼠在接受攜帶有編碼IL-4和IL-10質粒的細菌株聯合治療后，可以有效降低高血糖以及胰島的破壞［20］。推測灌胃Pg.后IL-10的減少可能不僅通過影響腸道免疫影響血糖，還有可能是IL-10本身對血糖的直接影響。

腸道Th17/Treg存在免疫失衡時通常伴有IL-17A的增加。在膠原蛋白誘導的關節炎模型中，口服Pg.可誘導腸道免疫模式向Th17優勢方向轉變，并伴隨腸道微生物區系的改變，加重小鼠膠原蛋白誘導的關節炎癥狀［21］。但也有研究發現，IL-17A可在多種組織中具有誘導促炎和抗炎反應兩種作用［22］，在腸道中還可以促進上皮細胞增殖，上調抗菌肽和緊密連接蛋白的表達，從而保護腸黏膜免受各種病原體的感染［23］。應用IL-17A抑制劑或IL-17A受體（IL-17RA）抑制劑可削弱結腸炎小鼠腸道屏障，加重腸道炎癥［24］。此外，有研究發現，高脂飲食小鼠其腸道內Th17/IL-17的減少與體質量增加，糖耐量減少及胰島素抵抗具有相關性［25］。證明胰島素敏感性降低在內的代謝性疾病早期與腸道微生物群多樣性降低，以及IL-17/IL-22下降相關［26］。腸道中除Th17細胞外，自然殺傷細胞（NK細胞）、γδT細胞、CD8+ T細胞等多種細胞也參與IL-17的分泌，本研究中，灌胃Pg.后的糖尿病小鼠結腸IL-17A呈現減少趨勢，并與緊密連接蛋白變化相一致。提示Pg.可能通過影響其他免疫細胞分泌IL-17進而對結腸緊密連接蛋白產生影響，而其具體機制有待進一步探索。

TLR是病原體相關分子模式識別受體，不僅表達在天然免疫細胞和特化抗原提呈細胞表面，也表達在CD4+ T細胞表面。其中TLR4可以識別并結合革蘭氏細菌的LPS，激活核因子κB信號通路，引起腸道Th17/Treg細胞比例失調和胰島素抵抗［27-28］，進而影響糖尿病的發展。

閉合蛋白、ZO-1是構成腸道緊密連接的主要蛋白因子［29］，常作為腸道機械屏障功能的檢測指標。本研究發現，與N組小鼠對比，DM組和PD組結腸閉合蛋白的mRNA表達量均降低，而PD組的兩種緊密連接蛋白的降低更為明顯。表明無論是糖尿病還是單純灌胃Pg.均可能對腸道機械屏障和免疫屏障產生一定影響。而在T2DM基礎上進行Pg.灌胃后，腸道機械屏障和免疫平衡的破壞更為明顯，并且血清內LPS含量顯著增加；小鼠血糖變化與閉合蛋白、ZO-1的mRNA表達呈負相關，與LPS含量變化呈正相關，進一步證明，腸道屏障破壞導致的LPS入血可能是引起血糖變化的關鍵因素。

4 小結

綜上所述，Pg.灌胃處理后，對結腸機械屏障及免疫屏障的破壞，在高血糖背景下更為顯著，可能導致腸道內LPS入血，進一步加重糖尿病小鼠血糖調節及胰島素敏感性受損。體外研究發現，LPS可以通過X盒結合蛋白1調控脂肪細胞胰島素受體底物1、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1、蛋白激酶B信號通路，影響胰島素信號的傳導［30］，因此，LPS可能是Pg.通過腸道引起遠端器官糖脂代謝損害的重要靶點。對于Pg.對腸道屏障的破壞，推測一方面可能是由于灌胃Pg.后引起腸道微生物及代謝物變化的直接作用［31］；另一方面可能與腸道免疫平衡打破，如IL-17A、IL-10減少，TLR4、TNF-α等免疫因子增加有關。本研究進一步驗證了Pg.可以通過口-腸途徑影響糖尿病的發展，而其引起腸道免疫屏障、機械屏障破壞的潛在機制，以及LPS入血后對全身糖脂代謝的具體機制有待進一步探索。

作者貢獻：李蕭紋提出主要研究目標，負責研究的構思與設計，研究的實施，撰寫論文；陳文文、黃明坤進行數據收集與整理，統計學處理，圖、表的繪制與展示；閆福華、莫朝倫進行論文的修訂；李蕭紋、張軍梅負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。

參考文獻

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（本文編輯：鄒琳）

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81970939）；貴州省衛生健康委項目（gzwkj2023-61）

引用本文：李蕭紋，閆福華，陳文文，等. 灌胃牙齦卟啉單胞菌對2型糖尿病小鼠結腸機械屏障及免疫屏障影響的研究［J］. 中國全科醫學，2024，27（18）：2225-2232. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2023.0386. ［www.chinagp.net］

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? Editorial Office of Chinese General Practice. This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 license.

1.550001貴州省貴陽市，貴州醫科大學口腔醫學院

2.210008江蘇省南京市，南京大學

3.550001貴州省貴陽市，貴州醫科大學附屬口腔醫院

*通信作者：張軍梅，主任醫師/教授；E-mail：zjm46688@126.com