阻滯腺苷A2A受體抑制膠質瘤細胞干性特征并誘導保護性自噬

鄧國棋 盛強 邵云香 楊巖 張勖 徐敬軒

【摘要】目的探究阻滯腺苷A2A受體（A2AR）對膠質瘤細胞干性特征與保護性自噬的影響。方法將人膠質瘤U87細胞分為四組：對照組、shNC組、shA2AR組、SCH58261組，分別將shNC、shA2AR轉染至shNC組與shA2AR組細胞中，SCH58261組使用A2AR拮抗劑SCH58261處理細胞，收集處理后的4組U87細胞，應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測細胞中A2AR mRNA表達水平，蛋白質免疫印記（Western Blot）檢測細胞中A2AR 蛋白表達水平，流式細胞術檢測細胞周期分布，細胞腫瘤球形成實驗檢測細胞干性，LC3自噬雙標腺病毒實驗檢測自噬溶酶體與自噬體形成，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western Blot檢測細胞中干細胞標記物巢蛋白（Nestin）、SRY相關高遷移率族盒蛋白2（SOX2）、八聚體結合轉錄因子4（OCT4）以及自噬相關分子微管相關蛋白3（LC3）II/LC3I、Beclin1的蛋白表達水平。 結果與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組U87細胞中A2AR mRNA相對表達量與蛋白相對表達量降低，差異具有統計學意義（P<0.05）；G1期細胞比例增加，差異具有統計學意義（P<0.05）；S期細胞比例減少，差異具有統計學意義（P<0.05）；腫瘤球形成數目減少，差異具有統計學意義（P<0.05）；細胞中紅色斑點代表的自噬溶酶體與黃色斑點代表的自噬體均明顯增多，細胞凋亡率增加，差異具有統計學意義（P<0.05）；細胞中Nestin、SOX2、OCT4蛋白相對表達量減少，差異具有統計學意義（P<0.05）；同時，LC3II/LC3I蛋白比值升高，差異具有統計學意義（P<0.05）；Beclin1蛋白相對表達量也增加，差異具有統計學意義（P<0.05）。結論阻滯A2AR能夠使人膠質瘤U87細胞發生G1期阻滯，抑制腫瘤細胞干性特征，并促進保護性自噬，誘導細胞發生凋亡。

【關鍵詞】膠質瘤；腺苷A2A受體；干性特征；保護性自噬

【中圖分類號】R739.41【文獻標志碼】A【文章編號】1672-7770（2024）01-0031-07

Blocking adenosine A2A receptors inhibits glioma cell stemness and induces protective autophagy DENG Guoqi， SHENG Qiang， SHAO Yunxiang， et al. Department of Neurosurgery， The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China

Corresponding author： XU Jingxuan

Abstract： ObjectiveTo investigate the effects of blocking adenosine A2A receptor（A2AR） on the stemness characteristics and protective autophagy of glioma cells. MethodsHuman glioma U87 cells were divided into four groups， control group， shNC group， shA2AR group and SCH58261 group， shNC and shA2AR cells were transfected into shNC group and shA2AR group， respectively. SCH58261 group was treated with A2AR antagonist SCH58261. Four groups of U87 cells were collected after treatment， real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR） was used to detect A2AR mRNA expression level in cells. Western blot was used to detect A2AR protein expression level in cells. Flow cytometry was used to detect cell cycle distribution. Cell tumor pellet formation assay was used to detect cell dryness. LC3 autophagy double-label adenovirus assay was used to detect the formation of autophagosome and autophagosome. Flow cytometry was used to detect cell apoptosis. Western blot was used to detect the expression levels of stem cell marker Nestin（Nestin）， SRY-associated high mobility group box protein 2（SOX2）， octamer binding transcription factor 4（OCT4） and autophagy related molecules microtubule associated?protein 3（LC3） II/LC3I and Beclin1. ResultsCompared with the control group， the mRNA relative expression level and protein relative expression level of A2AR in U87 cells of shA2AR group and SCH58261 group were decreased. The difference were statistically significant（P<0.05）. The proportion of cells in G1 phase was increased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The proportion of cells in S phase was decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The number of tumor spheres formed was decreased. The difference was statistically significant（P<0.05）. The number of autophagosomes represented by red spots and autophagosomes represented by yellow spots in cells significantly increased， and the apoptosis rate increased， with a statistically significant difference（P<0.05）. The relative expression levels of Nestin， SOX2， and OCT4 proteins in cells decreased with statistical significance（P<0.05）. Meanwhile， the ratio of LC3II/LC3I protein increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The relative expression level of Beclin1 protein also increased， and the difference was statistically significant（P<0.05）. ConclusionBlocking A2AR can induce G1 phase arrest of human glioma U87 cells， inhibit the stemness characteristics of tumor cells， promote protective autophagy， and induce cell apoptosis.

Key words： glioma; adenosine A2A receptor; stemness characteristics; protective autophagy

基金項目：自治區科技支疆項目計劃（指令性）項目（2022E02060）

作者單位：830000 烏魯木齊，新疆醫科大學第二附屬醫院神經外科

通信作者：徐敬軒

膠質瘤是神經上皮起源的惡性腫瘤，常發生在腦和脊髓中，其特征是高侵襲性、高復發率及高死亡率［1］。膠質瘤占所有原發性腦腫瘤的24.7%，占惡性腦腫瘤的74.6%［2］。膠質瘤患者通常接受常規治療，包括手術切除聯合放療和化療。近年來，盡管膠質瘤的診斷和治療取得了一定進展，但接受治療的患者預后仍然較差，迫切需要闡明膠質瘤進展的潛在機制，并開發新的治療策略來靶向腫瘤進展并降低復發率。膠質瘤干細胞被認為是膠質瘤治療期間頻繁復發和持續轉移侵襲的關鍵驅動因素，該干細胞可分化為新的腫瘤細胞，維持腫瘤生長，并且對化療藥物具有抵抗性［3-4］。因此，只有遏制膠質瘤細胞的干性細胞特征才能從根源上控制或治療膠質瘤。

腺苷A2A受體（adenosine A2A receptor，A2AR）是典型的G蛋白偶聯受體，主要與Gs蛋白偶聯，由410個氨基酸組成［5］。A2AR對配體腺苷具有高親和力，在病理條件或外部刺激下，ATP被CD39和CD73依次水解為腺苷，腺苷與A2AR結合后增加了cAMP的濃度，激活一系列下游信號通路，起到免疫抑制和促進腫瘤侵襲的作用［6］。研究表明，阻滯A2AR途徑可以抑制多種實體瘤的發生與進展［7-8］。因此，本研究通過shRNA A2AR與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261以阻滯人膠質瘤U87細胞中A2AR表達，探究其對U87細胞干性特征與保護性自噬的影響，以期為臨床上膠質瘤治療提供新的策略。

1材料與方法

1.1主要材料與試劑人膠質瘤U87細胞購于美國模式菌種收集中心，腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261購于美國Sigma公司，shRNA A2AR與陰性對照shRNA NC交由上海生工生物工程有限公司設計并合成。胎牛血清、青-鏈霉素及DMEM培養基購于美國Gibco公司，LipofectamineTM RNAi MAX和Trizol試劑盒購于美國invitrogen公司，反轉錄試劑RT reagent Kit與SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于日本Takara公司，RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus、PI染液及DAPI染液購于上海碧云天生物研究所，pCMV GFP-RFP-LC3慢病毒購于上海漢恒生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，A2AR、Nestin、SOX2、OCT4、LC3II、LC3I、Beclin1及GAPDH多克隆抗體購于英國Abcam 公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG購自美國ProteinTech公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組處理人膠質瘤U87細胞采用含10%胎牛血清與1%青-鏈霉素的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱內培養。取培養至對數生長期的細胞，分為對照組、shNC組、shA2AR組、SCH58261組，各分組處理如下：（1）對照組，U87細胞正常培養；（2）shNC組，將shRNA NC轉染至U87細胞；（3）shA2AR組，將shRNA A2AR轉染至U87細胞；（4）SCH58261組，使用10 μM SCH58261處理U87細胞48 h。細胞轉染使用LipofectamineTM RNAi MAX 轉染試劑進行，按照說明書配置反應體系進行轉染。轉染結束后換液，收集各處理組的U87細胞。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測細胞A2AR mRNA表達水平Trizol法提取U87細胞總RNA，按照試劑盒說明書操作。取獲得的總RNA，通過反轉錄合成cDNA，再以cDNA為底物，qRT-PCR法檢測A2AR mRNA表達水平，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行擴增反應，程序設定為：95 ℃預變性15 s，循環1次；95 ℃變性5 s、60 ℃退火20 s，循環45次；72 ℃延伸10 s，循環45次。在擴增結束后制作溶解曲線，采用2-ΔΔCt法分析數據，以GAPDH作為內參基因。引物具體序列：A2AR上游序列5′-AGGCAGCAAGAACCTTTCAA-3′，下游序列5′-CTAAGGAGCTCCACGTCTGG-3′，產物236 bp；GAPDH上游序列5′-GGACTCATG-ACCACAGTCCA-3′，下游序列5′-TCAGCTCAGGGA-TGACCTTG-3′，產物157 bp。

1.2.3蛋白質免疫印記（Western Blot）在U87細胞中添加RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。添加上樣緩沖液稀釋蛋白，100 ℃金屬浴煮沸變性，將等量變性后的蛋白依次上樣，通過10%SDS-PAGE分離后轉移至硝酸纖維素膜上，浸于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。TBST洗膜，分別以A2AR、Nestin、SOX2、OCT4、LC3II、LC3I、Beclin1多克隆抗體作為一抗，均按1∶1 000稀釋后，將膜浸入抗體稀釋液中，置于4 ℃過夜。取膜復溫，TBST洗膜，將對應二抗按1∶5 000稀釋，再將膜浸入二抗稀釋液中，室溫孵育2 h，TBST再次洗膜，滴加BeyoECL Plus顯色，根據蛋白條帶顯影情況調整曝光時間，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內參蛋白，計算各個目的蛋白的相對表達量。

1.2.4流式細胞術檢測細胞周期分布采用0.25%胰酶消化U87細胞，以4 000 rpm離心5 min，預冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌沉淀后，加入0.3 mL PBS重懸細胞，再加入0.7 mL乙醇，混合均勻后，置于4 ℃固定12 h，以1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）染液緩沖液，37 ℃避光孵育30 min，結束后離心，加入1 mL PBS重懸沉淀，24 h內通過流式細胞儀分析周期分布。

1.2.5細胞腫瘤球形成實驗檢測細胞干性將U87細胞用成球培養基重懸，調整密度為 1 600個/mL，按每孔800個的密度鋪于低黏附的 24 孔板中，輕輕晃動防止貼壁，并置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱內培養。7 d 后取出，通過光學顯微鏡觀察細胞腫瘤球形成情況并計數。

1.2.6LC3自噬雙標腺病毒實驗將U87細胞按照1×105個/孔的密度接種于6孔板中過夜培養，使用pCMV GFP-RFP-LC3慢病毒轉染細胞，感染復數設為50，感染12 h后，再更換為含5 μg/mL嘌呤霉素的正常培養液培養。將感染后的細胞分組處理后，4%多聚甲醛固定，穿膜打孔后，DAPI染核1 min，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察細胞染色情況并拍照。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡將SU87細胞置于干凈流式檢測管內，0.25%胰酶消化，以4 000 rpm離心10 min，棄上清，PBS洗滌沉淀，再加入500 μL 流式檢測緩沖液重懸細胞，接著避光加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，渦旋混勻，室溫孵育20 min，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.3統計學分析使用GraphPad Prism 7.0分析數據并制作統計圖，計量資料以均數±標準差（x±s）來描述。多組間數據比較采用方差分析，LSD-t檢驗進行兩組間數據比較，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1shRNA轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261處理后U87細胞中A2AR表達變化U87細胞經過shRNA轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261處理后，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組細胞中A2AR mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均減少，差異有統計學意義（均P<0.05），而對照組與shNC組之間差異無統計學意義（均P>0.05），見圖1、表1。

2.2阻滯A2AR對U87細胞周期分布的影響流式細胞術檢測周期分布結果顯示，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組U87細胞G1期細胞比例增加，差異有統計學意義（均P<0.05），S期細胞比例減少差異有統計學意義（均P<0.05）；shNC組細胞G1期、S期、G2期的細胞比例與對照組之間均無顯著差異（均P>0.05），見圖2、表2。

2.3阻滯A2AR對U87細胞腫瘤球形成的影響細胞腫瘤球形成實驗檢測結果顯示，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組細胞腫瘤球形成數目減少，差異有統計學意義（均P<0.05）；shNC組與對照組細胞腫瘤球形成數目無顯著差異（P>0.05），見圖3、表2。

2.4阻滯A2AR對U87細胞自噬水平的影響免疫熒光染色結果顯示，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組U87細胞中紅色斑點代表的自噬溶酶體、黃色斑點代表的自噬體均明顯增多；而與對照組比較，shNC組細胞中紅色斑點代表的自噬溶酶體、黃色斑點代表的自噬體均未發生明顯變化，見圖4。

2.5阻滯A2AR對U87細胞凋亡的影響流式細胞術檢測細胞凋亡結果顯示，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組細胞凋亡率增加，差異有統計學意義（均P<0.05）；而shNC組與對照組細胞凋亡率之間無顯著差異（P>0.05），見圖5、表2。

2.6阻滯A2AR對U87細胞干性特征與自噬相關蛋白表達的影響Western Blot測定結果顯示，與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組Nestin、SOX2、OCT4蛋白相對表達量減少，差異有統計學意義（均P<0.05）；shNC組Nestin、SOX2、OCT4蛋白相對表達量較對照組均無顯著差異（P>0.05），見圖6、表3。與對照組比較，shA2AR組和SCH58261組LC3II/LC3I蛋白比值升高，差異有統計學意義（均P<0.05），Beclin1蛋白相對表達量增加，差異有統計學意義（均P<0.05）；shNC組LC3II/LC3I蛋白比值、Beclin1蛋白相對表達量較對照組均無顯著差異（P>0.05），見圖7、表3。

3討論

A2AR的激活導致免疫抑制和腫瘤轉移，并抵抗腫瘤細胞凋亡，從而促進腫瘤進程。最新一項研究表明，A2AR的高表達與膠質瘤男性患者的生存率降低有關；此外，A2AR還與主要富集于局灶黏著和細胞外基質相互作用的基因密切相關，并誘導上皮間充質轉化、血管生成和膠質瘤生長［9］。由此提示，A2AR可能是膠質瘤有希望的治療靶點。目前，使用A2AR拮抗劑或A2AR敲除技術阻滯A2AR途徑可顯著提高抗腫瘤效果，例如，A2AR拮抗劑Ciforadenant（CPI-444）在腎細胞癌患者中可以安全地阻斷體內腺苷信號傳導，發揮抗腫瘤活性作用［10］。使用負載siRNA A2AR的納米顆粒治療結腸癌CT26細胞和乳腺癌4T1細胞構建的移植瘤小鼠，不僅能抑制腫瘤生長，而且增加了抗腫瘤免疫應答反應和小鼠存活時間［11］。本研究采用shRNA A2AR轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261處理人膠質瘤U87細胞后，檢測結果顯示，兩種作用下細胞中A2AR mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均減少，提示shRNA A2AR轉染或使用腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261均能夠阻滯U87細胞中A2AR的表達水平。

腫瘤細胞的異質性長期以來備受重視，腫瘤干細胞是膠質瘤的重要組成部分。腫瘤干細胞可由常見的干細胞標志物標記，如CD133、CD44、Nestin、SOX2、OCT4等，這些標記分子可以與免疫生態位因子及細胞微環境共同作用，調節膠質瘤的腫瘤發生和進展［12］。在膠質母細胞瘤中，Nestin不僅是腫瘤細胞干性特征的標志物，還是評估患者預后的重要指標［13］。SOX2和OCT4是控制腫瘤細胞干性和發育的轉錄因子，SOX2是SRY相關HMG-box（SOX）轉錄因子家族的成員，通過與其他干細胞標志物如NANOG和OCT4復合，刺激成體細胞重編程為多能干細胞，并在腫瘤細胞中維持干細胞樣特性［14］。OCT4屬于POU（Pit-Oct-Unc）轉錄因子家族，其在腫瘤干細胞樣細胞中通過調控其靶基因參與腫瘤細胞自我更新和腫瘤發生［15］。本研究結果顯示，經過shRNA A2AR轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261處理人膠質瘤U87細胞后，腫瘤球形成數目減少，細胞中Nestin、SOX2、OCT4蛋白相對表達量也減少，該結果說明阻滯A2AR能夠抑制U87細胞的干性特征。

自噬可以去除受損或衰老的細胞器，在調節腫瘤進展和腫瘤治療反應中起重要作用。自噬在腫瘤中的作用相對復雜，主要取決于腫瘤類型、分期和遺傳背景，其可以通過防止受損蛋白質和細胞器的積累而起到腫瘤抑制作用，也可以通過提供代謝底物促進細胞內循環從而有助于腫瘤生長［16-18］。而響應抗腫瘤治療而觸發的自噬可能與細胞死亡有關，可導致腫瘤細胞中促死亡信號通路的激活［19］。在自噬體形成過程中，胞質LC3I與磷脂酰乙醇胺結合，轉化為其酶促LC3II對應物，并聚集在自噬體膜上，因此LC3II/LC3I是衡量自噬水平的重要指標［20］。Beclin1是磷脂酰肌醇3-激酶復合物的組成部分，作為酵母ATG6的哺乳動物直系同源物，在自噬中起核心作用［21］。本研究結果顯示，經過shRNA轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261處理人膠質瘤U87細胞后，自噬溶酶體與自噬體均明顯增多，LC3II/LC3I蛋白比值升高，Beclin1蛋白相對表達量增加，同時，細胞凋亡率也增加，由此說明，阻滯A2AR能夠誘導U87細胞的保護性自噬，促進細胞凋亡的發生。

綜上所述，利用shRNA A2AR轉染與腺苷A2A受體阻斷劑SCH58261阻滯U87細胞中A2AR表達后，能夠使U87細胞發生G1期阻滯，減少腫瘤球形成數目，抑制干性標記物Nestin、SOX2、OCT4蛋白表達，并促進自噬溶酶體與自噬體形成，提高LC3II/LC3I蛋白比值及Beclin1蛋白表達，進而誘導細胞凋亡。本研究為靶向A2AR治療膠質瘤提供了新的參考依據，但作用機制尚未明確，有待后續深入探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 考 ?文 ?獻］

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（收稿2023-06-06修回2023-09-10）