基于黑曲霉固態發酵的綠豆皮降解及理化特性提升機理

趙一帆, 羅 磊, 馬 瀟, 劉浩宇

(河南科技大學食品與生物工程學院,洛陽 471023)

綠豆在我國有2000余年的種植史,種植地區非常廣泛[1]。綠豆皮是綠豆加工過程中的主要副產物,綠豆皮中含有大量的膳食纖維及各種活性成分[2-7]。但綠豆皮中纖維素的含量較高[8]、難以粉碎至口感較好的程度,導致綠豆皮本身的良好保健功能難以表現,大部分綠豆皮被棄置或用于牲畜飼料[9],這大大浪費了其價值。傳統的制粉方法主要采用螺桿擠壓、超微粉碎、高溫高壓等方法來破壞綠豆皮結構,但都存在需求大型設備、耗能較高、成本較高等問題。

微生物法具有能耗低、成本低廉等優勢。且微生物本身分泌的多種酶類能夠有效破壞綠豆皮的植物細胞壁[10]。使用微生物法來改善高纖維作物加工產品有較好的作用。徐安民[11]使用白腐菌固態發酵麥麩中的木質纖維素來改善小麥麩皮面條的粗糙口感,Wu等[12]使用米曲根瘤菌改善麥麩風味的同時也增加了其淀粉消化率,裴曾薇[13]對香菇柄膳食纖維使用黑曲霉改性后持水力、持油力、葡萄糖吸附能力等理化特性均得到提升。黑曲霉作為一種常見發酵曲霉,已廣泛應用于工業生產中,其能產生多種酶如纖維素酶、木聚糖酶、糖化酶等,且不產生真菌毒素[14]。

本研究用黑曲霉對綠豆皮進行固態發酵,并以體積平均徑、比表面積為指標,考察制粉特性的改善,持水力、持油力、膨脹力、溶解性、膽酸鈉吸附能力、陽離子交換能力及葡萄糖吸附能力為指標,考察綠豆原皮(GY)與黑曲霉固態發酵后綠豆皮(GH)的理化特性提升。采用掃描電鏡、X射線衍射及紅外光譜法考察黑曲霉固態發酵對綠豆皮微觀結構與化學鍵的影響,初步探究綠豆皮被降解的機理,以期為提高綠豆皮利用率以及擴寬其應用面提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與樣品

黑曲霉(Aspergillusniger),為本實驗室保藏菌種;綠豆皮,洛陽產。

1.2 試劑與設備

PDA營養瓊脂、LB肉湯、LB營養瓊脂,生物試劑(BR);葡萄糖、凡士林、石蠟油、氯化鈉、溴化鉀,分析純(AR);牛膽酸鈉,化學純(CP)。

SW-CJ-1D型單人凈化工作臺,DHP9272電熱恒溫培養箱,YXQ-LS-50S自動高壓滅菌鍋,T6紫外可見分光光度計,BJ-150多功能粉碎機,TM3030Plus臺式掃描電鏡,VERTEX70傅里葉變換中遠紅外光譜儀,Xstress3000(G2)X射線衍射儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程

取清洗、烘干后的綠豆皮50 g于1 L錐形瓶中,用透氣膜封口,于全自動高壓鍋121 ℃下滅菌20 min后進行固態發酵。取經過菌種分解的綠豆皮,攤開后放入55 ℃鼓風干燥箱烘干過夜。然后使用萬能粉碎機對綠豆皮進行粉碎后過125 μm篩網,粉碎時間為2 min。收集粉末,放置在干燥器中于4 ℃冰箱保藏。

1.3.2 菌種活化及種子液的制備

黑曲霉孢子懸浮液的制備:參考吳紅影等[15]的方法并稍作修改。

1.3.3 綠豆皮發酵

在接種黑曲霉孢子量2×107個、溫度36 ℃、時間7 d、料液比1∶3的條件下進行固態發酵。

1.3.4 綠豆皮制粉特性的測定

粒徑分布及比表面積測定:取相同條件粉碎后的適量綠豆皮粉于燒杯,倒入激光粒度分布儀進行測定,物質折射率為1.52,介質為水,折射率為1.33。為方便描述將綠豆原皮用GY表示,黑曲霉固態發酵后綠豆皮用GH表示,余同。

1.3.5 綠豆皮理化特性測定

1.3.5.1 持水力測定

參照Tian等[16]的方法并稍作修改,計算持水力。

(1)

式中:WH為綠豆皮粉的持水力/g/g;m0為干燥樣品質量/g;m1為離心管質量/g;m2為離心管和沉淀質量/g。

1.3.5.2 溶解性測定

參照王萍等[17]的方法并稍作修改,計算溶解性。

(2)

式中:WS為綠豆皮粉的溶解性/%;m0為樣品質量/g;m1為平皿質量/g;m2為烘干后的上清液和平皿質量/g。

1.3.5.3 膨脹力測定

參照Oluwatoyin等[18]的方法并稍作修改,計算膨脹力。

(3)

式中:PL為綠豆皮粉的膨脹力/mL/g;V1為初始體積/mL;V2為溶脹后體積/mL;m0為樣品質量/g。

1.3.5.4 持油力測定

參照Kurek[19]的方法并稍作修改,計算持油力。

(4)

式中:OH為綠豆皮粉的持油力/g/g;m2為離心管和樣品質量/g;m1為離心管質量/g;m0為樣品質量/g。

1.3.5.5 陽離子交換能力測定

參照Wei等[20]的方法稍作修改。

1.3.5.6 膽酸鈉吸附能力分析

膽酸鈉吸附能力測定:參照王雅琪[4]的方法稍作修改。

1.3.5.7 葡萄糖吸附能力分析

葡萄糖吸附能力測定:參照Peerajit等[21]的方法稍作修改。

1.3.6 綠豆皮降解機理研究

1.3.6.1 掃描電鏡觀測

將樣品臺放入掃描電鏡,抽真空并觀測。具體條件:加速電壓為 15 kV,模式為“Standard”,圖片掃描倍數為 80～500倍。

1.3.6.2 傅里葉紅外光譜掃描

將制得的樣品壓片在4 cm-1分辨率4 000～400 cm-1區間進行掃描,掃描次數設置為64次,KBr做空白樣品,每個樣品做3次平行實驗。

1.3.6.3 XRD射線衍射表征

對經黑曲霉固態發酵綠豆皮粉和原粉分別進行X-射線衍射檢測,具體條件:Cu 靶、管壓力為 40 kV、電流為 30 mA、掃描速率為2(°)/min、起始角:5°、終止角:90°、采樣步寬 0.05°。

1.3.6.4 綠豆皮主要組分變化

采用Van Soest 洗滌法并參考陳露露[22]的方法稍作修改進行測定。

1.3.7 數據處理

每組樣品做3次平行實驗,取平均值,實驗數據采用IBM SPSS statistics 26進行數據統計,使用沃勒-鄧肯法進行顯著性分析,利用Origin 2021軟件作圖,利用Design Expert 12軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 黑曲霉固態發酵對綠豆皮制粉特性的影響

GY與GH的粒徑與表面積大小如表1所示,經過黑曲霉固態發酵,在相同粉碎條件下,綠豆皮粉的體積平均徑由391.05 μm顯著縮小到45.46 μm,減少了8.52倍。綠豆皮粉比表面積由8.51 m2/kg顯著提升至279.07 m2/kg,增加了32.46倍。這是由于固態發酵破壞了綠豆皮的結構,使其易被粉碎為粒徑更小的粉體。更小粒徑的綠豆皮粉末,會帶來更好的口感,改善綠豆皮制粉特性。

表1 綠豆皮粉的粒徑及比表面積

2.2 黑曲霉固態發酵對綠豆皮理化特性的影響

2.2.1 水合特性

經過黑曲霉固態發酵的綠豆皮,溶解性得到顯著提升(表2),增加了11.22倍,可能是因為固態發酵使綠豆皮中的一些大分子長鏈的不溶性成分被降解為小分子短鏈的可溶性成分。而固態發酵后比表面積的增加,使更多小型基團暴露,更易與水和油結合,持水力、膨脹力、持油力與陽離子交換能力得到提升,分別增加了1.07、1.03、1.20倍和1.11倍。溶解性的提升說明有更多的可溶性活性成分產生,而更高的持油力表明有更好的降血脂功能,陽離子交換能力的提高更有助于維持內環境的穩定[23]。

表2 綠豆皮的水合特性

2.2.2 膽酸鈉吸附能力分析

對比吸附后上清液膽酸鈉濃度可以看出,GH中膽酸鈉溶液濃度要明顯低于GY(圖1),反應120 min時測得GY膽酸鈉質量濃度為0.59 mg/mL,GH中膽酸鈉質量濃度為0.34 mg/mL,吸附能力提升了1.18倍。這可能是因為固態發酵造成比表面積增大,使得更多基團暴露,更易于膽酸鈉結合,同時更疏松的孔隙結構也有利于膽酸鈉的吸附。對膽酸鈉的吸附有利于膽固醇的消化,有助于提升綠豆皮的降血脂作用。

圖1 膽酸鈉濃度變化圖

2.2.3 葡萄糖吸附能力分析

在相同葡萄糖濃度下,GH相較于GY的葡萄糖吸附量更大(圖2),在200 mmol/L的葡萄糖濃度下,GH的葡萄糖吸附能力提升了1.17倍。這說明固態發酵使綠豆皮具有更好的葡萄糖吸附能力。這可能是因為發酵后更高的可溶性膳食纖維形成膠質網狀結構將葡萄糖捕獲[24],同時更加疏松的結構也更易吸附葡萄糖。而更強的降血糖能力,能夠有效預防高血糖與糖尿病等疾病[25],有助于綠豆皮應用在保健食品中。

圖2 不同葡萄糖濃度對GY與GH吸附能力的影響

2.3 綠豆皮降解機理研究

2.3.1 掃描電鏡分析

從電鏡掃描圖可以看到(圖3),綠豆皮發酵前后發生明顯的變化,左側GY表面結構完整均勻,僅有少量褶皺和空隙,而右側GH表面褶皺與孔隙明顯增多,并出現顆粒狀物質。這說明黑曲霉固態發酵對綠豆皮的表面結構造成了明顯破壞,其原因可能是纖維素、半纖維素的降解造成綠豆皮變得疏松多孔,這與符旭棟[26]使用微生物發酵改性檸檬皮渣的研究結論相似。

圖3 綠豆皮的掃描電鏡圖(×500)

2.3.2 傅里葉紅外光譜掃描結果及分析

通過對綠豆皮粉紅外光譜分析可知(圖4),3 330 cm-1出現較寬吸收譜帶是綠豆皮纖維素與半纖維素的O—H伸縮振動產生,2 922 cm-1附近吸收峰為糖類亞甲基中C—H伸縮振動[27],在1 321 cm-1處的吸收峰是木質素組分的拉伸或彎曲特征峰,1 060 cm-1的較寬吸收是纖維素和半纖維素C—O、C—C、C—O—C的拉伸。從圖4中可以看到,GH和GY的紅外光譜基本一致,但GH纖維素、半纖維素及木質素特征峰的吸收明顯減弱,這可能是黑曲霉固態發酵能夠部分破壞纖維素、木質素等的化學鍵,并降解纖維素木質素等不溶性膳食纖維成分造成的。

圖4 綠豆皮的紅外光譜圖

2.3.3 XRD射線衍射表征結構及分析

通過對綠豆皮粉的X射線衍射譜圖的分析,GY與GH出峰位置基本相同(圖5),均在掃描角度為22.62°處出現主衍射峰,15.00°和34.66°出現次衍射峰,呈現出典型的纖維素Ⅰ型晶體結構[28]。但GH峰值明顯低于GY,說明黑曲霉固態發酵后的綠豆皮結晶區所占面積有明顯下降。這可能是固態發酵過程中部分結晶區結構被破壞,向非定性區進行轉化,相對結晶度下降,導致綠豆皮膳食纖維聚合度降低,這與劉鴻鋮等[29]的研究結果是相似的。

圖5 綠豆皮的X射線衍射圖

2.3.4 綠豆皮主要組成變化分析

根據圖6的觀察結果可知,在降解的初期階段,綠豆皮中的木質素和半纖維素的降解速度高于纖維素,在中期階段纖維素的降解速度開始提升,半纖維素的降解速度也隨之提高。說明黑曲霉對綠豆皮成分的降解過程中,先降解包裹在纖維素上的木質素和半纖維素,隨著酶的進一步作用,纖維素才開始降解,而纖維素的降解又會促進附著在其表面的半纖維素的降解。黑曲霉對綠豆皮中纖維素的降解率最高,達到57.71%;其次是半纖維素,降解率為46.00%;最低的是木質素,降解率為43.27%。而李紅亞等[30]對玉米秸稈進行降解,纖維素和半纖維素的降解率僅為30.5%和41.4%。這表明黑曲霉對綠豆皮有較好的降解能力,特別是對綠豆皮中含量最高的纖維素具有有效降解作用。

圖6 纖維素、半纖維素及木質素降解率變化

3 結論

研究黑曲霉固態發酵對綠豆皮特性的影響,并進行了降解機理的探究。結果表明,在制粉特性上,經過黑曲霉固態發酵后綠豆皮的粒徑明顯下降8.53倍、比表面積顯著上升32.46倍,這將有利于綠豆皮粉的加工與利用。在理化特性上,經過黑曲霉固態發酵后綠豆皮的持水力、溶解性、膨脹力、持油力、陽離子交換能力、膽酸鈉吸附能力及葡萄糖吸附能力等均得到明顯提升。在降解機理上,主要通過電鏡掃描、紅外掃描及XRD晶體衍射進行探究。黑曲霉對綠豆皮的降解,先降解木質素與半纖維素,再降解纖維素。主要通過破壞纖維素、半纖維素及木質素的化學鍵,使長鏈結構被降解為短鏈結構,破壞結晶區結構,降低相對結晶度,并轉化纖維素、半纖維素、木質素等主要成分,進而破壞綠豆皮結構,使其變得疏松多孔,讓綠豆皮更易被粉碎為粒徑更小、比表面積更大的粉體,具有更好的物質交換效率,提升綠豆皮的理化特性。