山藥顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因DaGBSS的克隆與分析

王培龍, 徐 婉, 楊燕萍, 付雙彬, 應(yīng) 震, 楊周祥, 姚麗娟, 周 莊

(浙江省亞熱帶作物研究所1,溫州 325005)

(瑞安市自然資源和規(guī)劃局2,瑞安 325200)

山藥為薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)具有雙子葉植物特征的一年生或多年生纏繞性藤本植物[1,2],其塊莖是主要的食用部位,有長(zhǎng)、扁、圓3種不同形態(tài)[3]。山藥地下塊莖因含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、氨基酸、薯蕷皂苷及其他對(duì)人體有益的微量元素,具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老和抗氧化等功效,具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥用價(jià)值,在我國(guó)被廣泛用作菜用鮮食和藥材加工的原材料。因其塊莖中的淀粉及蛋白質(zhì)含量與谷物相當(dāng),又被視為糧食作物,是一種有著廣闊前景的經(jīng)濟(jì)作物[4-8]。我國(guó)的山藥栽培分布非常廣,且地區(qū)間自然環(huán)境和氣候差異較大,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然適應(yīng)和人工選擇,在全國(guó)范圍內(nèi)形成多個(gè)栽培區(qū)域[9]。以長(zhǎng)江為界,我國(guó)的山藥栽培區(qū)域分為南方栽培區(qū)和北方栽培區(qū)[10],北方栽培地區(qū)的主要山藥品種為薯蕷(D.opposite),即山藥分類中的普通山藥,包括許多品質(zhì)優(yōu)良的地方特色品種,如鐵棍山藥、嘉祥細(xì)毛長(zhǎng)山藥和西施種子等。南方地區(qū)不僅栽培薯蕷,同時(shí)也種植山薯(D.fordi)、參薯(D.alata)、日本薯蕷(D.japonica)和褐苞薯蕷(D.persirnilis)等。不同種類的山藥因其基因表達(dá)、激素含量等不同從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律,且地區(qū)間環(huán)境的差異對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程也有顯著的影響。山藥的種植地域遼闊,溫度、水分和光照條件等差異大,在長(zhǎng)期的栽培過(guò)程中形成了華南、華中、東北、西北和華北5個(gè)主要栽培區(qū)域,各區(qū)域所產(chǎn)山藥的品質(zhì)也各有差異[11]。

淀粉是山藥的主要儲(chǔ)藏物質(zhì),其性質(zhì)和組成與山藥的食用和加工品質(zhì)有著密切關(guān)系[12]。大部分山藥品種的淀粉組成以直鏈淀粉含量為主,口感上表現(xiàn)出粉性,如淮山藥等;而部分種質(zhì)則以支鏈淀粉為主,表現(xiàn)出極具特色的糯性口感。顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)在直鏈淀粉的合成中起關(guān)鍵作用,GBSS通過(guò)α-1,4糖苷鍵將ADPG中的葡萄糖殘基添加到葡聚糖的非還原端上,來(lái)延長(zhǎng)葡聚糖的直鏈[13]。GBSS包括GBSSI(也稱為GBSS1)和GBSSII(也稱為GBSS2)2種同工酶,GBSSI主要控制儲(chǔ)藏器官中直鏈淀粉的合成,GBSSII主要控制非儲(chǔ)藏器官中直鏈淀粉的合成[14]。

Wang等[15]報(bào)道了水稻GBSSI基因(又稱蠟質(zhì)基因或Wx基因)的全序列,該基因與玉米、小麥等單子葉植物的Wx基因相比,第1內(nèi)含子較大,水稻GBSSII與GBSSI的結(jié)構(gòu)相似,二者在氨基酸序列水平的一致性達(dá)到了66%[16]。在谷物中,GBSSI由Wx基因編碼,在花粉、胚乳和胚囊中控制直鏈淀粉的合成,具有組織特異性,而GBSSII基因在葉、莖、根、果皮等非儲(chǔ)藏組織中表達(dá)[17,18]。在栽培稻中,Wxa主要存在于秈稻中,Wxb則主要存在于粳稻中,并且純合Wxa水稻胚乳內(nèi)的蠟質(zhì)蛋白表達(dá)量高于Wxb水稻蠟質(zhì)蛋白,導(dǎo)致秈稻直鏈淀粉含量高于粳稻[19,20]。趙雨欣[21]對(duì)水稻OsGBSSI基因的啟動(dòng)子進(jìn)行多靶向位點(diǎn)編輯,發(fā)現(xiàn)突變植株的直鏈淀粉含量出現(xiàn)了不同程度的降低,且突變株的直鏈淀粉含量隨OsGBSSI基因表達(dá)量的下降而降低。沈革志等[22]將反義Wx基因和含潮霉素抗性的基因?qū)胨?篩選出直鏈淀粉含量降低而無(wú)潮霉素抗性基因的植株。Chen等[23]將反義Wx基因轉(zhuǎn)入水稻,發(fā)現(xiàn)部分水稻胚乳的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低,最低可達(dá)7.02%,比野生型低72.4%。玉米GBSSI和GBSSIIa參與玉米籽粒中直鏈淀粉的合成,GBSS基因在授粉15 d的胚乳中表達(dá)量較高,在根和葉中表達(dá)量較低[24,25]。高直鏈玉米比普通玉米具有更高的直鏈淀粉含量、更低的相對(duì)結(jié)晶度,可能是由于GBSSI和PUL基因的高表達(dá)量、SBEIIa基因和SBEIIb基因的低表達(dá)量導(dǎo)致的[26]。糯玉米中的GBSSI基因發(fā)生突變,會(huì)形成高支鏈淀粉[27]。

小麥中編碼GBSS蛋白的基因?yàn)閃x基因,小麥Wx蛋白由Wx-A1、Wx-B1、Wx-D1編碼,小麥籽粒中缺失不同Wx蛋白對(duì)GBSSI基因的相對(duì)表達(dá)量、GBSS活性、直鏈淀粉的積累量產(chǎn)生影響[28]。在小麥中高溫脅迫使GBSSI基因的表達(dá)量提前到達(dá)頂峰[29]。在灌漿過(guò)程中大麥GBSSI主要負(fù)責(zé)直鏈淀粉的合成[30]。高粱籽粒中缺失GBSSI會(huì)導(dǎo)致其支鏈淀粉含量增加[31]。

在薯類作物中,劉玉匯等[32]從馬鈴薯塊莖中克隆出GBSSI基因的cDNA序列,編碼607個(gè)氨基酸,具有3個(gè)保守功能區(qū)域。馬鈴薯塊莖形成過(guò)程中GBSS活性、GBSSI基因的表達(dá)量降低,淀粉黏度和回生值降低,直鏈淀粉含量增加,總淀粉含量減少[33]。通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)馬鈴薯的GBSS進(jìn)行基因編輯,使馬鈴薯GBSS酶的功能完全喪失[34]。Veillet等[35]通過(guò)敲除優(yōu)良四倍體馬鈴薯品種中產(chǎn)生直鏈淀粉的GBSSI基因,產(chǎn)生了直鏈淀粉生物合成受損的四等位基因突變馬鈴薯,也證實(shí)了GBSSI蛋白的功能。文成糯山藥Wx基因的表達(dá)量降低,導(dǎo)致山藥的直鏈淀粉含量減少[36]。

在其他物種中,關(guān)于GBSS基因也有相關(guān)報(bào)道。在離體百合鱗莖發(fā)育過(guò)程中,LohGBSSI基因在小鱗莖膨大初期(15 d時(shí))表達(dá)量最高,在鱗莖和葉中的表達(dá)顯著高于莖段和根,表明百合鱗莖直鏈淀粉合成的主要的部位是鱗莖和葉[37]。在豌豆胚胎發(fā)育過(guò)程中GBSSII的表達(dá)高峰在GBSSI前,GBSSII在植物的各個(gè)組織中都有表達(dá),而GBSSI在根、托葉或花中不表達(dá)[38]。王前等[39]克隆了芡實(shí)GBSSI基因,編碼528個(gè)氨基酸,為穩(wěn)定的親水性蛋白。

在一些水果中也鑒定到了GBSS基因,從蘋(píng)果、桃子和橘子3種水果中分離并鑒定了3、2、2個(gè)GBSS基因,它們?cè)谌~、花、果實(shí)發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá),具有組織表達(dá)特異性[40]。從天寶蕉中克隆出了MaGBSSI[41],在巴西蕉中分離并鑒定了6個(gè)GBSS基因,且能通過(guò)影響香蕉果實(shí)發(fā)育和儲(chǔ)藏過(guò)程中GBSS的水平變化、淀粉顆粒的數(shù)量和大小來(lái)調(diào)節(jié)直鏈淀粉代謝[42]。荸薺EdGBSS基因在球莖、匍匐莖、葉狀莖和分株芽組織中均有表達(dá),但在球莖中的表達(dá)量最高,在分株芽中表達(dá)量最低[43]。從蓮藕美人紅和z9中克隆出NnGBSS基因,發(fā)現(xiàn)隨著蓮藕根狀莖的發(fā)育,其總淀粉與直鏈淀粉含量不斷增加,且NnGBSS基因的表達(dá)量越高,直鏈淀粉的含量也越高[13]。

隨著消費(fèi)者對(duì)食品口感和營(yíng)養(yǎng)保健功能需求的不斷提高,糯性山藥因其獨(dú)特的口感和藥用價(jià)值而成為市場(chǎng)的新寵,其中以產(chǎn)自浙南地區(qū)的糯米山藥為代表。糯米山藥為參薯(D.alata)的一個(gè)地方傳統(tǒng)栽種品種,由于市場(chǎng)影響力不斷擴(kuò)大,得到了越來(lái)越多育種專家的關(guān)注。但是目前對(duì)糯米山藥的研究仍處于起步階段,在山藥淀粉代謝及淀粉特性、山藥糯性品質(zhì)形成機(jī)制、通過(guò)分子手段對(duì)與山藥生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)差異表達(dá)基因的研究均鮮有報(bào)道,鮮見(jiàn)通過(guò)準(zhǔn)確調(diào)控淀粉含量、組成等技術(shù)開(kāi)展山藥新品種選育,影響了山藥產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。鑒于此,本研究采用分子克隆的方法對(duì)山藥顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因DaGBSS進(jìn)行克隆并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析,同時(shí)通過(guò)qRT-PCR對(duì)該基因在糯米山藥不同部位的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行探究,相關(guān)酶活進(jìn)行測(cè)定,以期在分子水平上,為研究糯米山藥塊根在直鏈淀粉合成相關(guān)酶的表達(dá)與調(diào)控、糯米山藥塊莖發(fā)育過(guò)程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成與積累的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

糯米山藥樣本為浙江省文成縣采挖15 d的山藥根莖,將樣本按照生長(zhǎng)部位從上至下分為4個(gè)部分,去皮處理后放入液氮中速凍,之后凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及cDNA的合成

采用CTAB法對(duì)獲得的山藥樣品進(jìn)行總RNA提取,具體操作步驟參考胡根海等[44]方法。分別采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanovue微型光度計(jì)對(duì)獲得的RNA提取質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。RNA反轉(zhuǎn)錄和cDNA合成采用蘭博利德All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix (with dsDNase),具體操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將反轉(zhuǎn)錄獲得的山藥cDNA稀釋10倍后用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR和基因克隆。

1.3 DaGBSS基因的查找與克隆

以“granule-bound starch synthase”為關(guān)鍵詞,對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期獲得的糯米山藥轉(zhuǎn)錄組Unigenes進(jìn)行查找,獲得的GBSS基因cDNA序列,運(yùn)用BioEdit軟件對(duì)比篩選,去除序列相同的基因,進(jìn)而通過(guò)BLASTX(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)篩選具有完整ORF的基因序列。以DaGBSS-F:ATGGCTGCTGTTACGGCTTCCCAT;DaGBSS-R:TCATGCAG-TGGCTGGTACTTTCT為引物,以糯米山藥cDNA為模板進(jìn)行DaGBSS基因的RT-PCR克隆,反應(yīng)體系為:dNTP Mix(10 mmol/L)0.4 μL,10×LA Taq PCR buffer 2 μL,LA Taq(5 U/μL)0.3 μL,基因上下游引物各1 μL,模板2 μL,無(wú)菌水補(bǔ)充至20 μL;反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min, 95 ℃變性30 s, 61 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min 10 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。將獲得的RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳,取片段大小正確的基因片段使用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。之后將膠回收產(chǎn)物與T載體連接,進(jìn)而將連接產(chǎn)物通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10中,并涂布于含有50 mg/L氨芐青霉素(Amp)的固體LB培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)8 h。挑取單克隆菌落,用載體引物和基因引物分別進(jìn)行PCR驗(yàn)證,選取條帶大小正確的菌株進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 DaGBSS基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)DaGBSS基因序列利用ExPASy軟件中的ProtParam程序(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)推導(dǎo)其編碼蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及理論等電點(diǎn);利用ProtComp 9.0 (http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcomppl&group= programs&subgroup=proloc&example=example1)在線工具對(duì)DaGBSS蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析;利用InterProscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)在線工具對(duì)山藥DaGBSS蛋白所屬的家族和存在的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。應(yīng)用ExPASy的ProtScale程序(https://web.expasy.org/protscale/)計(jì)算山藥DaGBSS蛋白的疏水性圖譜。利用在線分析軟件SignalP 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-4.1)對(duì)DaGBSS蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè);根據(jù)ExPASy提供的軟件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/ service.php?TMHMM-2.0)對(duì)DaGBSS蛋白的跨膜區(qū)和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);運(yùn)用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)軟件預(yù)測(cè)DaGBSS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu),使用Swissmodel軟件(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)DaGBSS蛋白的三維結(jié)構(gòu)。

利用NCBI中的BLASTP程序?qū)aGBSS的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),搜索10種同源性較高的植物的GBSS氨基酸序列,包括圓形薯蕷亞種(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)、油棕(Elaeisguineensis)、檬果(Mangiferaindica)、龍舌蘭(Agavetequilana)、海棗(Phoenixdactylifera)、尖頭芭蕉亞種(Musaacuminatasubsp.malaccensis)、阿月渾子(Pistaciavera)、澳洲堅(jiān)果(Macadamiaintegrifolia)、香蕉(MusaacuminataAAA Group)、karat香蕉(Musatroglodytarum)。利用Clustalx1.83軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析。此外,根據(jù)選取的10個(gè)物種的GBSS蛋白氨基酸序列,使用MEGA5.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析。

1.5 qRT-PCR分析

以糯米山藥不同部位cDNA為模板,用糯米山藥DaGBSS基因定量引物(表1)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。選擇山藥CKI-2基因作為內(nèi)參基因[45]。qRT-PCR的反應(yīng)體系為:SYBR 10 μL,正反向引物(10 μmol/L)各1 μL,cDNA 2.0 μL,ddH2O補(bǔ)充到20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,58 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,80 ℃ 1 s,讀版,45個(gè)循環(huán)。使用QuantStudioTM6 and 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔ(Ct)方法分析[46]。

表1 DaGBSS基因克隆和qRT-PCR引物序列

1.6 GBSS和直鏈淀粉含量測(cè)定分析

對(duì)山藥樣品采用酶聯(lián)免疫分析中的雙抗體夾心法進(jìn)行GBSS含量測(cè)定,詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法為:用純化的植物結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入GBSS,再與HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GBSS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值),通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中GBSS活性[47]。同時(shí)采用碘結(jié)合比色法對(duì)樣品的直鏈淀粉含量進(jìn)行測(cè)定[48]。

2 結(jié)果與分析

2.1 糯米山藥DaGBSS基因的克隆

以糯米山藥cDNA為模板,以DaGBSS-F和DaGBSS-R為上下游引物,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到一條特異條帶(圖1b)。純化回收后連接到pMD18-T克隆載體上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,將菌液PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行測(cè)序,得到1條具有完整ORF的DaGBSS基因。

圖2 DaGBSS蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)

圖3 DaGBSS蛋白的疏水性、跨膜區(qū)和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)

圖5 山藥DaGBSS蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2 DaGBSS蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)測(cè)序分析,得到一個(gè)完整的山藥DaGBSS基因ORF序列,長(zhǎng)度為1 845 bp,編碼614個(gè)氨基酸,通過(guò)BLASTp對(duì)DaGBSS氨基酸序列分析得到DaGBSS蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)圖(圖 2)。ProtParam預(yù)測(cè)DaGBSS蛋白的分子質(zhì)量為67.87 ku,理論等電點(diǎn)PI為6.27,為一酸性蛋白,其中含有72個(gè)帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu),67個(gè)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys),N-末端含硫類的蛋氨酸M(MET)序列,在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。DaGBSS蛋白的不穩(wěn)定值數(shù)為(II)29.59,屬于穩(wěn)定蛋白。

利用ProtComp9.0在線工具對(duì)DaGBSS的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,DaGBSS蛋白的定位在葉綠體的分值為8.57。利用InterProscan在線工具預(yù)測(cè),結(jié)果表明DaGBSS蛋白屬于植物糖原合酶(IPR011835),含有1個(gè)淀粉合酶催化結(jié)構(gòu)域(IPR013534,90-348)和1個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶1類結(jié)構(gòu)域(IPR001296,404-532)。用ExPASy的ProtScale程序計(jì)算山藥DaGBSS蛋白的疏水性,結(jié)果表明DaGBSS蛋白的疏水曲線在143、144、407、408、409位附近氨基酸疏水性較強(qiáng),而在71、72、73、131、132位附近氨基酸親水性較強(qiáng),疏水性系數(shù)為-102.18,屬于親水性蛋白(圖 3a)。利用ExPASy提供的在線跨膜區(qū)預(yù)測(cè)軟件TMHMM對(duì)DaGBSS蛋白的跨膜區(qū)和跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示該蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)(圖 3b),屬于非跨膜蛋白。利用在線分析軟件SignalP 4.1預(yù)測(cè)DaGBSS蛋白信號(hào)肽,結(jié)果顯示無(wú)信號(hào)肽存在(圖 3c)。

運(yùn)用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA軟件對(duì)DaGBSS蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲占主要部分,分別占39.74%和40.55%,片層結(jié)構(gòu)和β轉(zhuǎn)角占14.50%和5.21%(圖 4)。

進(jìn)一步通過(guò)SWISS-MODEL對(duì)DaGBSS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示,共匹配到4個(gè)可能的模型圖(圖 5),分別為顆粒結(jié)合淀粉合酶1,糖原磷酸化酶,糖原(淀粉)合酶、麥芽糖糊精磷酸化酶,其得分依次為0.75、0.31、0.32、0.36,且顆粒結(jié)合淀粉合酶1的模型匹配度高達(dá)68.63%,說(shuō)明DaGBSS蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)最有可能為模型A。

2.3 山藥DaGBSS蛋白的序列相似性及進(jìn)化分析

DaGBSS、10個(gè)不同物種的GBSS氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,DaGBSS與所選物種的氨基酸序列之間具有較高的同源性(相似性為70.03%～95.28%),都含有典型的淀粉合酶催化結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移酶1類結(jié)構(gòu)域。為進(jìn)一步分析山藥DaGBSS蛋白的進(jìn)化關(guān)系,將選擇的10個(gè)GBSS氨基酸序列與山藥DaGBSS氨基酸序列一起,使用MEGA 5.0中的Neighbor-joining構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明,DaGBSS蛋白與圓形薯蕷亞種(Dioscoreacayenensissubsp.rotundata)的物種進(jìn)化親緣關(guān)系更近(圖6)。

圖6 DaGBSS蛋白與其他物種GBSS蛋白的進(jìn)化分析

2.4 山藥DaGBSS基因的時(shí)空表達(dá)分析

為了初步分析DaGBSS基因的表達(dá)能力,利用實(shí)時(shí)定量qRT-PCR分析了在糯米山藥塊根不同組織部位(圖7)DaGBSS基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示(圖8):與S1部位相比,DaGBSS基因在S2、S3、S4的表達(dá)量明顯升高,分別是S1的9.13、7.73、11.44倍,尤其是在S4部位表達(dá)量達(dá)到最高值。進(jìn)一步對(duì)4個(gè)部位的顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)、直鏈淀粉含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示,4個(gè)部位的GBSS含量均在2.5 U/g左右,其中與S1部位相比,S2和S3部位的含量稍低,而S4部位的GBSS含量最高,是S1的1.17倍;而直鏈淀粉在4個(gè)部位的含量與DaGBSS基因的表達(dá)趨勢(shì)一致,在S1部位最低,在S4部位最高。綜合三者結(jié)果,說(shuō)明DaGBSS基因在山藥根部的表達(dá)存在差異性,這些表達(dá)差異會(huì)引起山藥根部不同位置顆粒結(jié)合型淀粉合成酶合成量的不同,從而導(dǎo)致不同部位直鏈淀粉含量差異。

圖7 取樣部分示意圖

圖8 DaGBSS基因在山藥根部不同部位的表達(dá)分析

3 討論

山藥的塊莖作為食用和藥用的主要部分,其組成對(duì)其食用和藥用的效果有重要影響,了解其營(yíng)養(yǎng)成分的含量和作用,可以更好地使糯米山藥的塊莖在飲食和健康管理中發(fā)揮作用。淀粉是高等植物光合產(chǎn)物主要的儲(chǔ)存形式,可分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。淀粉也是山藥地下塊莖的重要組成成分,直鏈淀粉和支鏈淀粉的相對(duì)含量可以影響山藥的口感、黏性、糊化性、回生性等特性[49]。在山藥中有多種酶參與淀粉的合成,其中顆粒結(jié)合淀粉合成酶在直鏈淀粉的延長(zhǎng)中扮演重要角色[50]。GBSS蛋白不能正常表達(dá)或活性下降是禾谷類作物糯性形成的根本原因。例如,糯稻中GBSSI基因堿基片段的突變或插入,會(huì)引起前體mRNA的不能正常剪切,從而導(dǎo)致GBSSI表達(dá)量減少[51];在糯玉米中,GBSSI基因缺失突變體Wx-D7和Wx-D10的GBSSI蛋白功能喪失[52,53];編碼小麥GBSS蛋白表達(dá)的Wx基因發(fā)生突變會(huì)影響小麥的糯性[54]。在馬鈴薯中,4個(gè)經(jīng)CRISPR/Cas9基因編輯的GBSS基因形成的突變體則完全缺失直鏈淀粉的合成能力[55]。

研究通過(guò)對(duì)山藥轉(zhuǎn)錄組分析、同源克隆得到一個(gè)擁有完整開(kāi)放閱讀框的糯米山藥顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因,cDNA片段長(zhǎng)度為1 845 bp,編碼614個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示DaGBSS蛋白為酸性穩(wěn)定蛋白,含有淀粉合酶催化和糖基轉(zhuǎn)移酶2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示:糯米山藥DaGBSS蛋白與所選的物種具有較高的同源性,在70.03%以上,且含有典型的功能結(jié)構(gòu)域。無(wú)根進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示DaGBSS蛋白與圓形薯蕷亞種的物種進(jìn)化親緣關(guān)系更近,說(shuō)明該基因在同屬內(nèi)具有較強(qiáng)的保守性。通qRT-PCR對(duì)該基因在糯米山藥塊莖不同部位的表達(dá)分析結(jié)果表明:DaGBSS基因在山藥塊莖的表達(dá)存在明顯的差異性,DaGBSS基因在S2、S3、S4的表達(dá)量分別是S1的9.13、7.73、11.44倍。進(jìn)一步對(duì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明,GBSS和直鏈淀粉在不同部位的含量存在差異性,且直鏈淀粉的含量變化趨勢(shì)與DaGBSS基因的表達(dá)趨勢(shì)一致,由此推測(cè)DaGBSS基因的組織表達(dá)差異性可能會(huì)引起山藥塊莖顆粒結(jié)合型淀粉合成酶合成的差異,從而導(dǎo)致山藥塊莖不同位置直鏈淀粉含量的差異,最終影響食用口感和效果。

通過(guò)對(duì)DaGBSS基因的結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、在山藥塊莖不同部位的表達(dá)進(jìn)行解析,為山藥的分子育種提供重要的基因資源,同時(shí)為糯米山藥塊莖發(fā)育過(guò)程中直鏈淀粉和支鏈淀粉的生物合成與積累的研究提供參考。研究?jī)H對(duì)DaGBSS基因的結(jié)構(gòu)及相關(guān)表達(dá)進(jìn)行了探究,關(guān)于DaGBSS基因的基本分子生物學(xué)功能、與如何在山藥塊莖的淀粉合成途徑中發(fā)揮功能將在未來(lái)的研究中進(jìn)行詳細(xì)的探究。

4 結(jié)論

研究從山藥中克隆得到1個(gè)顆粒結(jié)合型淀粉合成酶基因DaGBSS,ORF全長(zhǎng)1 845 bp,編碼614個(gè)氨基酸,為酸性穩(wěn)定親水性蛋白,含有典型的淀粉合酶催化結(jié)構(gòu)域和糖基轉(zhuǎn)移酶1類結(jié)構(gòu)域,且與圓形薯蕷亞種的物種進(jìn)化親緣關(guān)系最近。通過(guò)對(duì)采收15 d山藥塊莖進(jìn)行RNA提取、qRT-PCR分析,結(jié)果表明,DaGBSS基因的表達(dá)具有時(shí)空表達(dá)特異性,且在距離地表位置最遠(yuǎn)的部位DaGBSS基因的表達(dá)量、GBSS和直鏈淀粉的含量均為最高。研究通過(guò)對(duì)山藥塊莖淀粉合成的早期階段進(jìn)行分析,克隆出淀粉合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子,為淀粉合成的調(diào)控、農(nóng)作物品種改良和能源植物的培育提供參考。