山桐子蛋白提取工藝優化及功能特性研究

楊文清, 羅 凱, 陳耀兵

(湖北民族大學生物與食品工程學院1, 恩施 445000)

(湖北民族大學林學園藝學院2,恩施 445000)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim.),別名油葡萄、水冬瓜、椅桐,屬水楊科。山桐子是高大落葉喬木,是一種極具開發利用價值的木本食用油料作物[1]。山桐子果實含油率高達36.71%,亞油酸質量分數超過60%,有“樹上油庫”的美稱,主要分布于湖北、云南、貴州和四川等地[2]。山桐子中的營養成分十分豐富,富含蛋白質、黃酮、多酚和油脂等,并且發現山桐子在不同的生長時期以及不同生長部位的營養成分含量會有所差異[3-5]。

山桐子粕是山桐子榨油后的副產物,其產量為60%以上,常被作為動物飼料和土壤堆肥[6]。山桐子粕脫脂粉中蛋白質量分數超過10.66%,而蛋白質對人體健康發揮著至關重要的作用。已有研究證明不同植物源蛋白具有不同的功能活性,如黑種草蛋白的抗氧化活性和抗糖尿病活性、沙棘籽粕蛋白的抗疲勞活性,辣木籽蛋白有益于抗菌、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病、保肝、抗癌和心臟保護活性,而這些功能活性在生物醫藥、功能性食品等方面具有潛在應用價值[7-9]。目前,植物蛋白的制備研究主要采用堿提酸沉法,不僅具有操作簡單、成本低廉以及產量較高等優點,還能夠最大程度地降低提取過程中蛋白質變性的發生風險[10]。

近年來,國內外對山桐子的研究主要集中在油脂提煉及其營養品質分析[11-14]。關于山桐子蛋白的研究仍停留在果實中蛋白含量的初步測定,并發現山桐子種子中蛋白質含量高于山桐子果肉[15]。因此,為了提高山桐子粕資源的利用率,本實驗采用堿提酸沉法對山桐子粕中蛋白質的提取工藝進行優化并對其功能性質進行研究,以對山桐子的綜合開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山桐子粕(湖北恩施山桐子榨油后的餅粕);正己烷、NaOH、濃鹽酸、磷酸等,均為分析純。

SH220F型石墨消解儀,K9860型凱氏定氮儀,YB-150型粉碎機,DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器,UV-8000H型紫外可見分光光度計,Neofuge15型高速離心機,HZP-T502型pH計,SCIENTZ-100F/A型冷凍干燥機。

1.2 山桐子蛋白的提取工藝

1.2.1 原料預處理

將榨油后的山桐子餅粕用粉碎機粉碎過80目篩,得到山桐子餅粕粉。將山桐子餅粕粉用正己烷以1∶5(g/mL)料液比在磁力攪拌器上脫脂2 h后進行抽濾,取濾渣于通風櫥通風48 h,得到山桐子脫脂粉。

1.2.2 蛋白質提取工藝流程

山桐子蛋白采用堿溶酸沉法進行提取[16,17]。將山桐子脫脂粉與一定濃度的NaOH溶液按照一定比例進行混合,放置于磁力攪拌器中在一定溫度下攪拌一段時間后離心(8 000 r/min,15 min),除去不溶性物質收集上清液,即山桐子蛋白溶液。用考馬斯亮藍法測定上清液中蛋白質的含量并計算蛋白質提取率。用1 mol/L的HCl溶液將得到的山桐子蛋白溶液pH調至3.2進行酸沉,研究確定山桐子蛋白等電點為3.2,室溫下靜置2 h后離心(8 000 r/min,10 min),收集沉淀,用超純水洗滌至中性,再用冷凍干燥機干燥24 h后得到山桐子蛋白。

1.3 蛋白質含量、純度、提取率及得率的測定

山桐子脫脂粉中總蛋白質含量和山桐子蛋白純度的測定按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法進行測定。

提取液中蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法在595 nm處測定吸光度,用牛血清白蛋白制作標準曲線,得到牛血清白蛋白質量濃度與吸光度值之間的標準曲線:y=0.006 8x+0.026 8,R2=0.995,其中y為吸光度值,x為蛋白質量濃度(μg/mL)。蛋白質提取率和得率按照式(1)、式(2)進行計算[18]:

(1)

山桐子蛋白得率=

(2)

1.4 單因素實驗

研究NaOH濃度、溫度、液料比和時間對山桐子蛋白質提取率的影響。NaOH濃度選取0.010、0.025、0.050、0.075、0.100 mol/L;溫度選取35、45、55、65、75 ℃;液料比選取45∶1、50∶1、55∶1、60∶1、65∶1;時間選取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h。

1.5 響應面實驗

在單因素的基礎上采用BOX-Behnken實驗設計,確定響應面的四因素三水平,以蛋白質提取率為響應值,對NaOH濃度、溫度、液料比和時間這4個因素進行優化,以獲取蛋白質提取的最優工藝方案。響應面設計因素及水平見表1。

表1 BOX-Behnken實驗設計因素水平

1.6 山桐子蛋白質等電點測定

參考王標詩等[19]方法,略作修改。將山桐子脫脂粉與0.06 mol/L的NaOH溶液以1∶55料液比進行混合,置于磁力攪拌器中53 ℃提取2 h,冷卻至室溫后離心(8 000r/min,15 min)取上清液。分別取30 mL上清液于8個50 mL的燒杯中,分別用1 mol/L的HCl溶液調節pH為2.4、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8,室溫靜置2 h后,8 000 r/min離心10 min,用考馬斯亮藍法測定上清液蛋白質含量。

1.7 山桐子蛋白性質測定

1.7.1 持水性測定

(3)

式中:m0為樣品質量/g;m1為樣品和離心管的質量/g;m2為吸水后樣品與離心管的質量/g。

1.7.2 持油性測定

參考Das等[21]方法,略作修改。取1 g樣品與20 mL大豆油于離心管中混合均勻,分別放在25、35、45、55、65 ℃的磁力攪拌器中攪拌30 min,待蛋白質充分吸油后離心(4 000 r/min,10 min)。將離心管45°倒置15 min,將沉淀與大豆油分離。根據式(4)計算蛋白質的持油性(OBC)。

(4)

式中:ma為樣品質量/g;mb為樣品和離心管的質量/g;mc為與油結合后樣品與離心管的質量/g。

1.8 山桐子蛋白抗氧化活性測定

1.8.1 DPPH自由基清除率的測定

參考劉晶等[22]方法,略作修改。取2 mL不同質量濃度的蛋白樣品溶液(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL)與2 mL DPPH溶液(0.1 mmol/L DPPH溶于無水乙醇)混合均勻,在室溫條件下,避光放置30 min,在517 nm處測量吸光度為A1。樣品對照組用超純水代替DPPH溶液,測定吸光值為A2;空白組用超純水代替樣品溶液,測定吸光值為A0;以超純水作為調零液,VC作為陽性對照。計算公式為:

(5)

式中:A0為空白組(2 mL超純水+2 mL DPPH溶液)吸光度;A1為樣品組(2 mL蛋白樣品溶液+2 mL DPPH溶液)吸光度;A2為樣品對照組(2 mL蛋白樣品溶液+2 mL超純水)吸光度。

1.8.2 ABTS自由基清除率的測定

參考張子木等[23]方法,略作修改。將7 mmol/L ABTS水溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合,放置4 ℃冰箱過夜16 h,使用時將ABTS混合液用超純水稀釋至吸光度為0.70±0.02。取0.2 mL不同質量濃度的蛋白樣品溶液(40、80、120、160、200、240、280、320、360、400 μg/mL)加入4 mL ABTS稀釋液,避光反應6 min,在734 nm處測定吸光值為A1;樣品對照組用超純水代替ABTS稀釋液,測定吸光度為A2;空白組用超純水代替蛋白樣品溶液測定吸光度為A0。VC作為陽性對照。

(6)

式中:A0為空白組(0.2 mL超純水+4 mL ABTS稀釋液)吸光度;A1為樣品組(0.2 mL蛋白樣品溶液+4 mL ABTS稀釋液)吸光度;A2為樣品對照組(0.2 mL蛋白樣品溶液+4 mL超純水)吸光度。

1.9 數據分析

每組實驗做3組平行,數據均以平均值±標準差表示。采用Design-Expert 13軟件進行響應面設計和統計結果分析,Origin2023b和GraphPad Prism9.0.0進行數據繪圖和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 山桐子蛋白質含量、純度及得率的測定結果

采用凱氏定氮法測得的山桐子粕中蛋白質質量分數為8.5%;山桐子粕脫脂粉中蛋白質質量分數為10.66%;山桐子蛋白的純度為54.81%;采用響應面最優方案得到的山桐子蛋白得率為39.13%。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 NaOH溶液濃度對蛋白質提取率的影響

由圖1可知,當堿液濃度為0.01～0.05 mol/L時,蛋白質提取率隨著堿液濃度升高而顯著增加,當堿液濃度為0.05 mol/L時,蛋白質提取率達到73.27%。這是因為堿液可以破壞蛋白質分子的次級鍵尤其是氫鍵,促使蛋白質分子溶出,使蛋白質提取率增加。而隨著堿液濃度繼續增加,蛋白質提取率呈小幅度升高狀態,這可能是因為過高的堿液濃度會導致蛋白質變性或過度水解,甚至會溶出一些非蛋白類物質(如多糖、水不溶性纖維等)干擾蛋白質的測定,造成的蛋白質提取率虛高[24]。因此堿提法提取蛋白質最佳的堿液濃度應該控制在0.05 mol/L左右。

圖1 單因素實驗結果

2.2.2 溫度對蛋白質提取率的影響

由圖1可知,隨著提取溫度的增加,蛋白質提取率先升高后降低。溫度為35～55 ℃時,山桐子蛋白提取率呈上升趨勢,當提取溫度為55 ℃時,蛋白提取率達到最大值為79.12%。這是因為溫度升高,分子間的運動加劇,增加了分子間的有效碰撞,加快了蛋白質的溶出速率。當提取溫度高于55 ℃時,提取率隨著溫度的增加而逐漸降低,這可能是因為溫度過高達到了某些蛋白質的變性溫度,從而影響了蛋白提取率。因此蛋白質的提取溫度應控制在55 ℃左右。

2.2.3 液料比對蛋白質提取率的影響

由圖1可知,隨著液料比的增加,蛋白質提取率先升高后降低。當液料比為55∶1時,蛋白質提取率達到最高為77.78%,與液料比為40∶1時的提取率有顯著性差異。這是因為當液料比較低時,由于山桐子粕中還含有一些多糖類物質分散在提取液中,導致提取液的黏稠度較大,抑制了蛋白質的溶出速率。隨著液料比的增大,提取液的黏稠度逐漸變小,分子擴散速率增大,進而使得蛋白質的提取率增大。當液料比大于55∶1時,蛋白質溶解量已經達到了一定平衡,過高的浸提液體積不利于蛋白質沉淀的獲取,增加了蛋白質濃縮過程中的困難。因此蛋白質的液料比應控制在55∶1左右。

2.2.4 時間對蛋白質提取率的影響

由圖1可知,隨著提取時間的增加,山桐子蛋白提取率先增加后降低。當提取時間在1.5～2.0 h時,蛋白質提取率顯著增加;當提取時間為2.5 h時,蛋白質提取率達到最大值為76.28%,這可能是因為蛋白質在溶液中的溶解量達到了飽和狀態。當提取時間超過2.5 h時,蛋白質的提取率呈降低的趨勢,蛋白質長時間處于堿性條件可能會導致蛋白質的過度水解和變性,甚至會溶出其他物質(如多糖),降低蛋白質的提取純度。因此,從經濟角度出發,蛋白質的提取時間應控制在2.5 h左右。

2.3 響應面分析法優化山桐子蛋白提取工藝

2.3.1 響應面實驗方案設計及結果分析

以NaOH濃度、溫度、液料比和時間為因素,蛋白提取率為指標,響應面中Box-Behnken實驗方案和結果見表2,對表2的數據經回歸擬合后得到回歸方程:

表2 響應面方案設計及結果

提取率=77.09+5.26A+1.60B+2.01C-0.981 7D-2.78AB-6.78AC+0.845 0AD+8.10BC-0.502 5BD+0.382 5CD-9.51A2-3.66B2-3.16C2+4.46D2

由Design Expert進行回歸分析和方差分析結果如表3所示,由方差分析可知,模型的F=52.28,P<0.000 1,表明實驗模型極顯著,實驗設計方案可靠,具有統計學意義。失擬項P=0.593 9,說明回歸模型失擬項不顯著。模型相關系數R2=0.981 2、Radj=0.962 5說明模型的擬合度好,預測值與實際值有良好的相關性,能夠解釋96.25%響應值的變化,可用于分析預測山桐子蛋白提取的最佳工藝及提取率。對該系數模型回歸檢驗可知:因素A、B和C的P值<0.01,說明NaOH濃度、溫度和液料比對蛋白質提取率的影響是極顯著的。因素D的P值<0.05,說明時間對蛋白質提取率的影響是顯著的。由F值可以看出各因素影響蛋白提取率的主次順序為:A(NaOH濃度)>C(液料比)>B(溫度)>D(時間)。

表3 回歸模型與方差分析結果

2.3.2 響應面分析

通過Design-Expert 13軟件分析得出山桐子蛋白提取的最佳工藝參數為:NaOH濃度0.059 mol/L、溫度53.284 ℃、液料比53.138∶1.000、時間2.026 h,在此條件下,山桐子蛋白理論提取率為82.485%。基于實驗條件的考量,確定最佳工藝優化條件為NaOH濃度為0.06 mol/L、溫度為53 ℃、液料比為55∶1、時間為2.0 h。在該條件下通過3次平行實驗驗證得出山桐子蛋白實際提取率為81.98%,與理論值無顯著性差異,說明該模型可用于預測山桐子蛋白的提取。

2.4 山桐子蛋白等電點

由圖2可看出,山桐子蛋白等電點在2.4～3.8的范圍內,經測定當pH為3.2時,上清液中蛋白含量最低。這是因為溶液中蛋白質分子在酸性條件下相互作用變強并形成聚集體,使蛋白質沉淀,故選用pH=3.2作為山桐子蛋白的等電點。由于等電點代表特定的蛋白質具有最低溶解度的pH值,因此在獲取蛋白質過程中確定蛋白質等電點是至關重要的[25]。

圖2 山桐子蛋白等電點測定

2.5 溫度對山桐子蛋白持水性和持油性的影響結果

2.5.1 溫度對山桐子蛋白持水性的影響

由圖3可知,溫度在25～35 ℃范圍內,山桐子蛋白的持水性隨著溫度升高而升高。當溫度在35 ℃時,山桐子蛋白持水性達到最高為5.21 g/g;當溫度在35～65 ℃范圍內,持水性呈下降趨勢,這可能是因為蛋白質開始發生變性,導致分子構象發生變化,從而導致蛋白質的水合作用減弱。與牡丹籽種子蛋白(3.55 g/g)和大豆蛋白(4.13 g/g)相比,山桐子蛋白表現出更高的持水性[26,27]。蛋白質的持水性主要取決于其氨基酸的類型,極性氨基酸越高,WHC越高,當其應用于食品加工時有助于減少水分的流失,從而改善食物的味道[28,29]。

圖3 溫度對山桐子蛋白持水性和持油性的影響

2.5.2 溫度對山桐子蛋白持油性的影響

由圖3可知,溫度在25～35 ℃的范圍內,山桐子蛋白的吸油能力呈上升趨勢。溫度為35 ℃時,山桐子蛋白的吸油能力達到最高值為1.82 g/g。當溫度為35～65 ℃時,山桐子蛋白的吸油性隨著溫度的升高而降低,這可能是因為油的黏度會隨溫度升高而降低,致使油脂分子的流動性增強,從而導致與蛋白質的結合能力降低。與杏仁蛋白、大豆蛋白和豌豆蛋白相比,山桐子蛋白的持油性較低,與油脂等疏水性物質的相互作用較小[30,31]。

2.6 抗氧化能力測定

2.6.1 DPPH自由基清除能力

DPPH是一種穩定的自由基,與抗氧化物質反應后會由深紫色變成淺黃色,常被用于探索化合物作為自由基清除劑的能力[32]。由圖4a可知,山桐子蛋白的DPPH自由基清除能力隨著蛋白質量濃度的增大而增大,說明山桐子蛋白質量濃度對DPPH自由基清除率的影響較大。當山桐子蛋白質量濃度為2.0 mg/mL時,DPPH自由基清除率達到最大值93.64%;當山桐子蛋白質量濃度為1.2 mg/mL時,DPPH自由基清除率超過50%。與大豆分離蛋白相比,山桐子蛋白顯示出更優異的DPPH自由基清除能力[33]。抗氧化化合物可用于功能食品、化妝品和制藥行業,這是因為它們可以預防和降低多種疾病的發生風險(如心腦血管疾病、神經退行性疾病)[34]。

圖4 山桐子蛋白抗氧化能力的測定

2.6.2 ABTS自由基清除能力

ABTS自由基清除能力常作為抗氧化物質總抗氧化能力的測定指標,測定抗氧化物質的電子轉移能力[35]。ABTS溶液呈藍綠色,當抗氧化劑與ABTS溶液發生反應時,會使ABTS溶液褪色,抗氧化能力越強,ABTS溶液褪色越明顯。由圖4b可知,山桐子蛋白質量濃度與ABTS自由基清除能力呈正相關,隨著山桐子蛋白質量濃度的增加,ABTS自由基清除能力增強。當山桐子蛋白質量濃度為200 μg/mL時,ABTS自由基的清除率達到56.86%。盡管山桐子蛋白的ABTS自由基清除率低于VC,但與其他植物(紫蘇籽粕)蛋白相比,仍顯示出較高的ABTS自由基清除活性,說明山桐子蛋白中含有與ABTS自由基清除相關的活性成分[36]。

3 結論

在單因素的基礎上,利用響應面分析法優化了堿溶酸沉法提取山桐子蛋白的工藝條件。最終確定最佳工藝條件為:NaOH濃度為0.06 mol/L、溫度為53 ℃、液料比為55∶1、時間為2.0 h,此時山桐子蛋白提取率為81.98%,山桐子蛋白得率為39.13%。4個因素對山桐子蛋白提取率的影響為NaOH濃度>液料比>溫度>時間。山桐子蛋白具有良好的持水性和持油性。山桐子蛋白等電點為pH 3.2;山桐子蛋白在35 ℃時的持水性和持油性最好。通過體外抗氧化活性測定發現山桐子蛋白具有良好的抗氧化活性,為未來功能食品的研發以及山桐子蛋白水解產物的探索提供一定的基礎。