潘 越,李婷婷,吳彩娥
(南京林業大學輕工與食品學院,江蘇 南京 210037)
小白杏(Prunus armeniacaL.)主要生長在中國西北地區,是中國最早栽培和食用的水果之一,因其皮薄、味道甜和營養價值豐富而備受喜愛[1]。小白杏產地偏遠,通常需要通過長途運輸及貯藏才能到達消費市場,運輸和貯藏過程會破壞杏果的細胞結構,加速水分從其組織中流出,導致組織軟化并喪失水分。軟化現象是水果和蔬菜收獲后銷售鏈中的主要品質問題之一,軟化會導致果蔬的耐貯藏性降低、保質期縮短[2]。由于小白杏產地較為偏遠,通常需要長途運輸才能運達銷售地,導致其遭受的機械損傷較多,因此其軟化現象尤其嚴重,造成了巨大的經濟損失[3]。
化學保鮮劑可有效維持采后小白杏品質和降低其軟化發生率,但它們極易造成試劑殘留從而影響人體健康。化學保鮮劑中含有的重金屬或化學成分具有一定毒性,并可導致環境污染。因此化學保鮮劑的使用受到越來越多的限制,研究杏果保藏新技術,開發綠色、環保、無毒的保鮮方法以保證杏果貯藏期間的品質迫在眉睫[4-5]。
近年來,非熱食品處理技術包括低溫等離子體(如介質阻擋低溫等離子體(dielectric barrier discharge cold plasma,DBD))、脈沖光、紫外線輻射、脈沖電場等,引起了研究者的廣泛關注[6-7]。DBD處理是一種很有前途的非熱技術,已被證明可用于實現食品微生物安全和保持果蔬品質。DBD處理通過其高壓放電誘導空氣電離,產生離子、自由電子、自由基和其他反應性化學物質的復雜混合物,并產生紫外線輻射、臭氧和帶電粒子[8-9],這些物質具有高活性和高穿透性,擁有極強的滅菌作用。目前,DBD技術已在果蔬保鮮領域被廣泛研究,國內外研究現狀表明,DBD處理是一種有效抑制鮮切果蔬中微生物生長繁殖、提高其貯藏品質并延長貨架期的殺菌保鮮技術。例如有研究發現,DBD處理可使鮮切獼猴桃片在一定貯藏期內保持良好的保鮮效果,并延長貨架期[10];Silvia等[11]發現DBD處理后,哈密瓜、菊苣切片等樣品的保質期明顯延長,且其品質及外觀變化可忽略不計。此外,有研究表明DBD處理可以改變果蔬細胞中多種酶的靶結構從而使其失活,如多聚半乳糖醛酸酶、多酚氧化酶等,DBD處理可以通過抑制這些酶的活性保持果蔬品質[12-15]。因此可以推斷,這種高度穿透性的處理可能會影響杏果實的表皮成分及細胞壁,進而影響果實對機械損傷的抵抗力及其貯藏期品質。然而DBD調節杏果細胞壁代謝及軟化的研究尚屬空白。
綜上,本研究采用新疆小白杏為實驗材料,研究DBD處理對鮮杏細胞壁代謝、水分代謝和顯微結構的影響,分析DBD處理控制杏果軟化的調控機制,為DBD技術在杏果貯藏保鮮中的應用和完善提供依據。
實驗材料選取新疆小白杏,采取七成熟的果實,并于采收后24 h內運送至實驗室。選取大小均勻、表面無損傷、成熟度一致的果實進行實驗。
三氯乙酸、硫代巴比妥酸、碘化鉀、無水乙醇、氯仿、甲醇、丙酮、乙酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、戊二醛(均為國產分析純)國藥集團化學試劑有限公司。
PG-1000ZD高壓低溫等離子體表面處理機 南京蘇曼等離子科技有限公司;SMP6多功能全自動酶標儀 上海美谷分子公司;MS105DU分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HWM-508恒溫恒濕箱 寧波江南儀器廠;AllegraX-15R臺式冷凍離心機 美國Beckman公司;MesoMR23-060 H-1核磁共振儀 上海紐沃柯電子科技有限公司;JEM 1400透射電子顯微鏡 日本電子株式會社;TA1質構儀 英國勞埃德公司。
1.3.1 DBD處理
通過預實驗初步確定了DBD處理條件。預實驗將低溫等離子體的處理時間(20、40、60、80 s)、處理電壓(70、80、90、100、110、120 kV)作為考察因素,在不同組合條件下對小白杏進行DBD處理。通過未處理組作對照,觀察處理前后杏果表面損傷情況和貯藏期間水分喪失情況,篩選出保鮮效果好且對杏果實特征無影響的處理時間和電壓條件。因高于100 kV的處理電壓會對杏果表皮造成損傷,低于80 kV的電壓對小白杏的保鮮效果不明顯,根據節能原則最終選擇電壓90 kV、處理時間40 s的工作參數對小白杏進行處理。
將果實分裝于塑料保鮮盒中,用塑料薄膜密封,每盒裝250 g(約15 個)杏果實。隨機分成2 組,DBD處理組利用低溫等離子體設備在工作電壓90 kV的條件下處理40 s(工作溫度25 ℃),對照組不進行DBD處理。處理后立即檢測杏果各項指標情況,并將樣品置于4 ℃、相對濕度95%的恒溫恒濕箱中貯藏,每隔7 d取樣檢測各項指標,每組3 次重復。
1.3.2 杏果質量損失率及硬度測定
質量損失率及硬度的測定參考文獻[16]。杏的質量損失率按下式計算:
從每組中隨機選擇6 個杏果進行硬度測量,杏的硬度使用質構分析儀測定,探頭設置為“P/36 R”,測試目標模式設置為“應變”,預測試和測試速率5 mm/s,測試后速率2 mm/s,單位設置為“N”。
1.3.3 水分測定
水遷移情況及水分喪失測試,采用核磁共振儀測量鮮杏的水分狀態[17]。將隨機選取的新鮮水果放入專用試管中進行測定,參數設置如下:頻譜寬度:200 kHz,射頻延遲:0.020 ms,數字增益:20 dB,等待時間:4 000.00 ms,回波時間:0.3 ms,回波數量:17 000。測試時記錄弛豫時間及其相應的水信號面積并捕捉影像。
1.3.4 細胞膜通透性測定
細胞膜通透性用相對電導率表示。將60 g新鮮杏切成薄片(大約5 mm×10 mm)。隨機選擇切片(約2 g),置于超純水中浸泡20 min(25 ℃),之后立即測量溶液的電導率L1/(S/m)。將溶液在沸水中加熱30 min后冷卻至室溫,再次測量溶液的電導率L0/(S/m)。根據電導率測量數據,計算相對電導率ΔEC:
1.3.5 丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定
MDA含量測定[18]:將1 g組織樣品放入5 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液中,并充分研磨,將研磨液置于4 ℃放置20 min后收集上清液。向收集的上清液中加入等體積的硫代巴比妥酸溶液(100 g/L),煮沸30 min后,置于冰水中冷卻。在450、532 nm和600 nm波長處測量溶液的光密度,按照下式計算MDA含量:
1.3.6 H2O2含量測定
H2O2含量測定[2]:將3 g組織樣品加入到6 mL的1% TCA中,在冰浴中冷卻20 min,并離心。將上清液加入到10 mmol/L磷酸鉀緩沖液和1 mol/L碘化鉀的再作用體系中(上清液∶磷酸鉀緩沖溶液∶碘化鉀=1∶1∶2(V/V))。在390 nm波長處測量吸光度,利用不同濃度H2O2建立的標準曲線方程計算H2O2含量。
1.3.7 細胞壁多糖的分離和測定
根據乙醇不溶性殘留物的原理制備細胞壁多糖樣品[19]:從杏果中提取4 種不同的多糖,包括水溶性果膠(water-soluble pectin,WSP)、螯合性果膠(elatesoluble pectin,CSP)、半纖維素和纖維素。將10 g完全研磨的杏樣品添加到50 mL體積分數95%乙醇溶液中,在100 ℃放置20 min,冷卻并過濾以獲得殘留物。在殘留物中依次加入20 mL體積分數85%乙醇、20 mL氯仿-甲醇(1∶1,V/V)和20 mL丙酮洗滌,直到顏色消失,然后過濾。最后,在45 ℃條件下持續干燥48 h,直到質量恒定。取300 mg干燥物在7 mL超純水中提取6 h獲得WSP,將不溶于水的殘留物在10 mL含有50 mmol/L反式-1,2-環己烷二胺四乙酸的乙酸鈉緩沖液中再次提取6 h,獲得CSP。取100 mg干燥物在10 mL 4 mol/L氫氧化鈉(含有100 mmol NaBH4)溶液中振蕩6 h,過濾后上清液為半纖維素。將剩余的殘留物用蒸餾水洗滌至中性以獲得纖維素。以半乳糖醛酸為標準,通過咔唑法測定WSP、CSP含量,以葡萄糖為標準,采用蒽酮法測定半纖維素和纖維素含量。測定結果表示為成分質量與多糖樣品質量的比率,單位表示為g/kg。
1.3.8 細胞壁降解酶的提取與測定
細胞壁降解酶的提取方法如下[1,19]:將1 g杏果樣品置于研缽中,加入4 mL 40 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.2,包含50 g/L聚乙烯吡咯烷酮、2%β-疏基乙醇和0.1 mol/L NaCl),并研磨均勻。勻漿液經15 000×g離心20 min后,上層清液即為粗酶提取液,用以分析多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)、纖維素酶(cellulase,CEL)、果膠甲基酯酶(ctinmethylesterase,PME)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-Gal)活力。整個提取過程在4 ℃條件下完成。
PG活力測定:將1 mL 0.5 mol/L乙酸鈉緩沖液(pH 5.5)、0.5 mL 10 g/L聚半乳糖醛酸溶液和0.5 mL酶提取物混合并在37 ℃水浴中孵育1 h。隨后立即加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸并放置于沸水浴中5 min。之后測定反應體系在540 nm波長處吸光度。以每小時生成1 μg半乳糖醛酸為一個PG活力單位(U),PG活力單位用U/kg表示。
CEL活力測定:將1.5 mL 10 g/L羧甲基纖維素和0.5 mL酶提取物混合。使用與PG活力測定相同的步驟和條件進行測定。一個CEL酶活力單位(U)定義為每小時生成1 個聚半乳糖醛酸的CEL的量,CEL活力單位表示為U/kg。
PME活力測定:將1 mL酶提取物和10 mL 10 g/L柑橘果膠混合,并在37 ℃孵育1 h,然后用氫氧化鈉滴定混合物。一個PME活力單位(U)定義為每分鐘消耗1 μmol NaOH的PME的量,PME活力單位表示為U/kg。
β-Gal活力測定:將0.2 mL酶提取物和2 mL 10 g/L的對硝基苯基-β-D-半乳糖苷混合并在37 ℃孵育30 min,加入2 mL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液終止反應,在400 nm波長處測量吸光度。一個β-Gal活力單位(U)定義為每分鐘消耗1 mmol對硝基苯基-β-D-半乳糖苷的β-Gal的量,β-Gal活力單位表示為U/kg。
1.3.9 杏果細胞顯微結構觀察
通過透射電子顯微鏡觀察杏果的細胞結構[20]:將杏樣品固定在戊二醛固定劑中,并在4 ℃冷藏。將它們在不同體積分數梯度乙醇溶液中脫水15 min,并用100%丙酮洗滌3 次,每次20 min。用包埋劑和丙酮混合物(1∶1,V/V)處理切片1 h,然后用包埋劑和丙酮混合物(3∶1,V/V)再處理3 h。將切片在純包埋劑中放置過夜。滲透處理后,將碎片浸入水中,在70 ℃加熱過夜,然后保存嵌入的碎片。使用超微切片機將切片切割成70~90 nm的切片,并用乙酸鈾酰溶液和檸檬酸鉛雙重染色。最后,用透射電子顯微鏡對樣品進行觀察。
果實硬度在貯藏期間受果實軟化的影響,會隨著細胞壁的變化而降低。兩個處理組的硬度在整個貯藏期內逐漸降低(圖1)。剛采摘的小白杏硬度約為6.2 N,隨著貯藏時間的延長,果實硬度逐漸降低,但處理組降低幅度顯著低于對照組,尤其在貯藏末期,對照組果實發生嚴重的腐爛和軟化,硬度急劇下降,而DBD組果實依然比較堅硬,貯藏42 d時對照組硬度降至1.9 N,比DBD組低29.6%。結果表明,適當條件的DBD處理可以有效抑制杏果軟化。

圖1 DBD處理后杏果貯藏期硬度變化Fig.1 Changes in firmness of apricot fruits undergoing DBD treatment during storage
果實中水分狀態的變化可能導致新鮮產品發生巨大而顯著的變化,并最終影響果實軟化和貯藏質量,質量損失率是反映果實水分狀態的指標之一。如圖2所示,DBD處理組和對照組的果實在整個貯藏過程中質量損失率逐漸增加,但DBD處理的果實質量損失率低于對照組果實。貯藏14 d后,對照組樣品的質量損失急劇增加,到第42天,其質量損失約為DBD處理組的2 倍。

圖2 DBD處理后杏果貯藏期質量損失率變化Fig.2 Changes in mass loss of apricot fruits undergoing DBD treatment during storage
核磁共振和核磁共振成像在測量植物細胞中處于不同結合狀態的水的分布和比例方面具有獨特的優勢。核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)是一種無損檢測,通過記錄弛豫時間(T2i)和其相應的水信號面積可以評估杏果內水分分布情況[21]。因此,它已被廣泛用于分析植物樣品中的水分分布。核磁共振成像(nuclear magnetic resonance imaging,NMRI)可以通過空間收集水的弛豫強度可視化水的分布,并生成2D或3D的圖像,通過該圖像可以描述整個樣品內的水分含量差異。在本研究中,使用1H-NMRI鑒定了小白杏果實中果肉組織的形態學特征,使用NMRI獲得杏果的橫截面質子密度圖像(圖3)。杏果皮的1H-NMRI圖像的像素強度值隨著果實軟化而降低。在貯藏初期,兩組杏果肉組織NMRI像素值幾乎均在40 000~50 000之間,到貯藏末期,對照組大部分果肉組織像素值降低至20 000左右,而DBD組大部分果肉組織像素值均無明顯變化。

圖3 DBD處理對貯藏期杏果水分分布的影響Fig.3 Effect of DBD treatment on water distribution in apricot fruits during storage
1H NMR質子信號可以反映整個杏樣品組織中的含水量信息,通過NMR研究了新鮮杏果在貯藏開始(第0天)、貯藏中期(第21天)和貯藏結束(第42天)時的水分遷移狀況。T2i弛豫曲線顯示貯藏21 d后曲線發生了明顯變化,表明隨著貯藏時間的延長,杏果水分分布發生了變化(圖4)。對照組的峰遷移變化幅度大于DBD處理組,表明貯藏期間對照組杏果水分遷移更明顯,DBD處理有效緩解了杏果實中的水分遷移。在貯藏末期,對照組弛豫曲線的寬度顯示出更寬的形狀分布,這可能是由于貯藏末期對照組杏果的組織發生損傷導致杏果的微觀結構更加不均勻,這為水質子群體創造了不均勻的環境。NMR實驗顯示,DBD處理削弱了杏果細胞間水分的擴散和遷移,從而減少了水分的損失。

圖4 DBD處理對貯藏期杏果水分遷移的影響Fig.4 Effect of DBD treatment on water mobility in apricot fruits during storage
與貯藏0 d相比,兩組杏果的細胞通透性、MDA和H2O2含量在貯藏過程中均有不同程度的增加(圖5)。DBD處理組杏果的細胞通透性在貯藏第7天急劇增加,并高于對照組。然而,在貯藏14 d后,DBD組細胞通透性均低于對照組的水平,DBD處理組杏中的MDA和H2O2含量始終低于對照組,這表明DBD處理抑制了貯藏期間杏果細胞通透性、MDA含量和H2O2含量的增加。

兩組杏果貯藏過程中細胞壁多糖的含量變化如圖6所示。在貯藏過程中,對照組WSP含量總體呈現逐漸增加的趨勢,DBD處理組WSP含量在整個貯藏期間均顯著低于對照組。兩組杏的WSP含量都有不同程度的增加,這可能是因為運輸和貯存過程中搬運引起的振動破壞了杏果細胞,導致可溶性果膠含量增多。實驗數據表明,DBD處理可以抑制杏中WSP含量的增加。

圖6 DBD處理對杏貯藏過程中細胞壁多糖含量的影響Fig.6 Effect of DBD treatment on the contents of cell wall polysaccharides in apricot fruits during storage
在貯藏過程中,DBD處理組的CSP、半纖維素和纖維素含量均呈現先增加后不同程度地減少的趨勢,而對照組除CSP先增加后減少外,半纖維素和纖維素基本呈現逐漸減少的趨勢,且在整個貯藏期間,對照組這3 種物質含量均低于DBD處理組。實驗結果表明,DBD處理抑制了杏果中CSP、半纖維素和纖維素含量的下降。
由圖7可知,在對照組中,PG和CEL活性在貯藏后期持續增加,而在DBD處理組中,在貯藏第7天后它們的活性均顯著低于對照組。兩組杏果在貯藏過程中的PME和β-Gal的活性變化相似,在貯藏第7天后,DBD處理組的酶活性均顯著低于對照組。這表明在杏果貯藏過程中細胞壁降解酶的活性水平有很大變化,DBD處理減少了貯藏期間杏果的損傷,從而抑制了PG、CEL、PME和β-Gal的活性。

圖7 DBD處理對杏貯藏過程中細胞壁降解酶活性的影響Fig.7 Effect of DBD treatment on the activities of cell wall-degrading enzymes in apricot fruits during storage
用透射電子顯微鏡觀察杏果的細胞壁結構和細胞內物質。如圖8所示,杏果肉的細胞壁只有初級壁,沒有次級壁,兩個相鄰細胞的細胞壁由細胞間層連接。對照組杏果的細胞壁彎曲變形,部分細胞壁圖像模糊,細胞間層已分解,明暗分區不明顯,細胞呈現膠質液化,細胞壁之間形成中空空間,細胞之間的黏附喪失,大量細胞質和內含物消失,出現細胞質裂解及明顯的質壁分離現象,細胞內液泡明顯損壞。DBD處理組的杏果肉細胞壁結構仍然均勻完整。

圖8 杏貯藏晚期組織透射電子顯微鏡圖像Fig.8 TEM images of apricot tissues during the late storage period
實驗結果表明,DBD處理可以減緩杏果硬度下降、降低采后杏膜脂質過氧化,緩解采后杏果丙二醛含量和膜透性的增加,保持杏果細胞膜的穩定性。這些結果表明,DBD處理延遲了采后杏果實的軟化并調節細胞代謝。可能是DBD處理后產生的多種活性基團和粒子(如自由基、臭氧、自由電子、活性氧(active oxygen,ROS)等)會導致沖擊能量的增加,從而增強了細胞壁對杏果運輸和貯藏期間所受損傷的耐受性[22]。這種高度穿透性的處理可能使得杏果實表皮成分發生變化,進而激活果實的內在保護機制,從而促進果實對運輸損傷產生更高的抵抗力。
水分損失是影響杏品質劣化的主要內在因素。果實軟化現象的出現與細胞壁活性有關,植物衰老的特點之一是細胞壁組成成分降解導致水分損失,并通過胞漿分離等現象損害表皮細胞、增加細胞內容物泄漏,導致杏果水分流失加速。在正常情況下,水果在運輸和貯藏過程中會發生水分損失,這嚴重影響了水果的質量特征,包括外觀、鮮質量和硬度[23-25]。在小白杏運輸和貯藏期間,自由水的損失導致果實表面發生收縮,因而NMR實驗觀察到不均勻的水信號。對照組的水果發生水分損失,嚴重影響了它們的品質特性,而處理組杏果到貯藏末期依然保持飽滿的水分狀態,說明DBD處理可以維持杏果水分,減緩水分喪失。
在果實貯藏過程中,外界不良環境如高溫、機械損傷和微生物侵染等逆境會對其造成脅迫作用,破壞果實細胞內的ROS代謝動態平衡,導致ROS積累過多,產生有毒有害的MDA,使細胞膜發生膜脂過氧化現象,加速細胞的衰老,加快果實的腐敗變質[26]。ROS對細胞引起的干擾可通過ROS清除酶系統清除,ROS清除酶系統主要包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和過氧化物酶(peroxidase,POD),其可直接清除細胞內產生的或外界進入細胞中的多余ROS,在先前的研究中已證實DBD處理可以有效激活小白杏SOD、CAT和POD活性,提高其抗氧化代謝能力[27]。這與王卓等[28]研究發現DBD處理會導致藍莓細胞內SOD和POD活力增加的結果一致。本實驗顯示,DBD處理可以減緩H2O2和MDA的積累,有效緩解采后小白杏細胞膜相對電導率的上升,維持正常的細胞膜通透性。可能是因為DBD處理時產生的活性物質誘導了SOD、CAT和POD的活力,調節杏果細胞內ROS濃度,從而激發了杏果組織中的抗氧化機制,抑制了杏果細胞膜的氧化損傷、延緩了采后杏果衰老和軟化。
細胞壁多糖(果膠、纖維素和半纖維素)在果實軟化方面發揮著重要作用。它們的聚合和溶解將導致細胞組織結構發生變化[25]。果膠溶解后,在體外細胞壁材料吸脹實驗中可以觀察到明顯的吸脹現象[29-30]。許多研究分析了果實成熟和軟化的過程,它與WSP含量的增加以及CSP含量的減少高度相關[31]。果實軟化過程中細胞壁成分降解的另一個原因是纖維素、半纖維素結構的松動[29-30]。這些研究與本實驗結果一致(圖6),隨著WSP含量的增加,杏果實軟化,而CSP、纖維素和半纖維素含量逐漸降低。另一方面,果膠的降解增加了細胞壁交聯網絡的孔徑,導致細胞壁膨脹,使底物更容易被酶接觸。隨著果實軟化,各種細胞壁酶作用于果膠、纖維素等細胞壁組成物質,進一步改變其結構。參與這一過程的酶包括PG、CEL、PME和β-Gal。這些酶可以作用于果膠主鏈、阿拉伯糖支鏈、半乳糖醛酸酯化基和半乳聚糖,分解細胞壁的結構,導致果實軟化。在本研究中,與對照組相比,DBD處理降低了杏果細胞壁降解酶活性,并伴有更高的細胞壁多糖水平。這與先前的研究一致,如潘雅雯[32]在研究DBD處理對藍莓細胞壁代謝的影響時發現,處理后藍莓的PG、β-Gal和PME的活力分別降低了15.7%、18.3%和27.9%,且細胞壁結構比對照組更加完整。細胞壁的超微結構變化會導致細胞組織功能減弱甚至喪失,這些變化會引起果實質地的變化,從而進一步加速細胞衰老和解體。杏果實硬度下降的主要原因之一是運輸和貯藏中產生的損傷破壞了果實的細胞結構[33]。細胞壁中的果膠、纖維素等多糖在細胞壁降解酶的作用下被大量水解,這導致細胞壁網絡的解體,從而促進果實的軟化[34-35]。同時,這些損傷還會破壞細胞膜的結構并增加細胞膜的滲透性。本研究通過果肉細胞的超微結構研究了杏果軟化的機理,透射電子顯微鏡結果表明,DBD處理抑制了細胞壁的松動和解聚,減少了細胞膜的破壞,有助于維持杏的細胞結構,這與果實硬度的變化相一致。
DBD處理能夠抑制小白杏細胞壁降解酶活性、增加細胞壁結構性多糖含量、延緩果實硬度的下降和水分的喪失,從而延緩杏果實軟化。本研究表明,DBD技術是減少小白杏在運輸和貯藏過程中品質損失的有效手段。