巨噬細(xì)胞M1/M2型極化對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)程的影響及相關(guān)性分析

王愛(ài)軍 周俊 夏常杰

作者簡(jiǎn)介：王愛(ài)軍，大學(xué)本科，主管技師，研究方向：臨床檢驗(yàn)免疫學(xué)。

【摘要】目的 分析巨噬細(xì)胞（M?）M1/M2型極化對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）進(jìn)程的影響，為臨床治療提供參考。方法 選取2020年6月至2022年7月南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的97例DR患者（研究組）及同期105例單純糖尿病（DM）患者（對(duì)照組）為研究對(duì)象，比較兩組患者臨床資料，分析M?表型檢測(cè)的診斷價(jià)值，以及M1/M2型M?與炎癥因子、血糖水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物、DR進(jìn)程的關(guān)系。結(jié)果 研究組患者M(jìn)1型、M1/M2型M?占比均大于對(duì)照組，M2型M?占比小于對(duì)照組（均P<0.05）；M1/M2型M?>7.275時(shí)診斷DM患者發(fā)生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，曲線下面積（AUC）為0.8655（P<0.05）；研究組患者白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、超氧化物歧化酶（SOD）水平均低于對(duì)照組，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、丙二醛（MDA）水平均高于對(duì)照組（P<0.05）；研究組患者M(jìn)1/M2型M?與IL-4、TGF-β、SOD水平均呈負(fù)相關(guān)，與TNF-α、iNOS、空腹血糖（FBP）、餐后2 h血糖（2 hBP）、MDA水平呈正相關(guān)（均P<0.05）。結(jié)論 DR患者M(jìn)?由M2型向M1型極化過(guò)程中炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，升高血糖水平，加速DR的惡性病理發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】巨噬細(xì)胞M1/M2型極化；糖尿病視網(wǎng)膜病變；氧化應(yīng)激反應(yīng)

【中圖分類號(hào)】R774.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.05.0083.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.05.028

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是目前全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的慢性疾病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，2021年中國(guó)DM患者為1.409億，居全球首位[1]。目前，臨床無(wú)法治愈DM，需采用終身降糖治療方法[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）發(fā)生率約占DM并發(fā)癥的20%～30%，其早期通常無(wú)自覺(jué)癥狀，多被忽視或誤診，后期可能導(dǎo)致視力嚴(yán)重下降甚至失明[3]。巨噬細(xì)胞（Macrophages，M?）根據(jù)微環(huán)境改變表型，使自身發(fā)揮出多樣功能的過(guò)程被稱為M?極化，根據(jù)信號(hào)傳導(dǎo)差異極化為M1/M2表型[4]。 研究表明，阻斷M?中白細(xì)胞介素-17A（IL-17A）與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激間的相互作用可抑制DR中新生血管的形成[5]。由此可見(jiàn)，M?極化過(guò)程可能與DR的病理變化相關(guān)。基于此，本研究分析M? M1/M2型極化對(duì)DR進(jìn)程的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年6月至2022年7月南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的97例DR患者（研究組）及同期105例單純DM患者（對(duì)照組）為研究對(duì)象。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），組間具有可比性，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《中國(guó)2型糖尿病防治診南（2020版）》[6]中DR的診斷標(biāo)準(zhǔn)；⑵年齡>18歲；⑶臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴入院前接受過(guò)抗生素類藥物、手術(shù)治療；⑵存在其他DM病變；⑶存在肝、腎功能障礙；

⑷凝血功能異常；⑸妊娠及哺乳期女性。

1.2 檢測(cè)方法 ⑴單核細(xì)胞分離。入院時(shí)采集患者外周靜脈血1 mL，采用血糖分析儀（青島市三凱醫(yī)學(xué)科技有限公司，魯械注準(zhǔn)20192220549，型號(hào)：SK-Ⅱ）檢測(cè)空腹血糖（FBP）、餐后2 h血糖（2 hBP）、糖化血紅蛋白（HbA1c）。同方法采集患者外周靜脈血1 mL加入等體積磷酸鹽緩沖液稀釋后滴加至淋巴細(xì)胞分離液中，以

3 000 r/min轉(zhuǎn)速、10 cm半徑，離心10 min后吸取下層細(xì)胞并將其置于培養(yǎng)皿中，37 ℃、5%CO2環(huán)境下恒溫培養(yǎng)24 h，細(xì)胞貼壁后吸除懸浮細(xì)胞，獲得外周血中的單核細(xì)胞。⑵M?檢測(cè)。預(yù)冷的PBS洗滌單核細(xì)胞3次，后分裝至兩個(gè)離心管中，一管加入PE抗人CD68抗體檢測(cè)M1型M?，一管加入APC抗人CD206抗體檢測(cè)M2型M?。檢測(cè)儀器為流式細(xì)胞儀[美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特，國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2012第2402288號(hào)，型號(hào)：CyFlow（r） Counter]。⑶酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法實(shí)驗(yàn)。入院時(shí)采集患者外周靜脈血于促凝管中，室溫下靜置30～50 min，以3 000 r/min轉(zhuǎn)速、10 cm半徑，離心10 min后分離血清。ELISA檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素-4（IL-4）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）水平，試劑盒均購(gòu)自江西艾博因生物科技有限公司。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析M?表型檢測(cè)的診斷價(jià)值。⑵使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析兩組患者M(jìn)1/M2型M?與血糖、炎癥因子、氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物的關(guān)系。⑶M?與DR進(jìn)程的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較使用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x）表示，組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析及最小顯著差異法（LSD）組內(nèi)檢驗(yàn)；診斷價(jià)值使用ROC曲線分析；相關(guān)性使用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M?表型檢測(cè)診斷效能 研究組患者中M1型M?、M1/M2型M?占比均高于對(duì)照組，M2型M?占比低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表2。ROC曲線分析結(jié)果顯示，當(dāng)M1/M2型M?>7.265時(shí)，診斷DM患者發(fā)生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，曲線下面積（AUC）為0.8655，見(jiàn)圖1。

圖1 M1/M2型M?診斷DR的ROC曲線

2.2 兩組患者M(jìn)1/M2型M?與炎癥因子的關(guān)系 研究組患者中IL-4、TGF-β水平均低于對(duì)照組，TNF-α、iNOS均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表3。Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示：研究組患者M(jìn)1/M2型M?與IL-4、TGF-β水平均呈負(fù)相關(guān)，與TNF-α、iNOS水平呈正相關(guān)（均P<0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 DR患者M(jìn)1/M2型M?與炎癥因子的關(guān)系

注：IL-4：白細(xì)胞介素-4；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。

表2 M?表型檢測(cè)結(jié)果比較（%，x）

例數(shù) M1型M? M2型M? M1/M2型M?

研究組 97 38.24±5.94 4.32±0.73 9.12±2.13

對(duì)照組 105 32.48±6.36 5.34±0.76 6.23±1.63

t值 6.638 9.712 10.880

P值 <0.001 <0.001 <0.001

表3 兩組患者炎癥因子檢測(cè)結(jié)果比較（x）

例數(shù) IL-4（ng/L） TGF-β（ng/L） TNF-α（ng/L） iNOS（U/mL）

研究組 97 30.42±6.01 604.88±84.35 1.50±0.32 4.11±0.64

對(duì)照組 105 36.76±3.83 664.97±91.47 1.07±0.24 2.99±0.52

t值 8.044 4.842 10.860 13.700

P值 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

注：IL-4：白細(xì)胞介素-4；TGF-β：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；iNOS：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶。

2.3 兩組患者M(jìn)1/M2型M?與血糖的關(guān)系 Pearson相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示：研究組患者M(jìn)1/M2型M?與FBP、2 hBP均呈正相關(guān)（均P<0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 DR患者M(jìn)1/M2型M?與血糖的關(guān)系

注：FBP：空腹血糖；2 hBP：餐后2 h血糖。

2.4 兩組患者M(jìn)1/M2型M?與氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物的關(guān)系 研究組患者SOD水平低于對(duì)照組，MDA水平高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見(jiàn)表4。研究組患者M(jìn)1/M2型M?與SOD水平呈負(fù)相關(guān)，與MDA水平呈正相關(guān)（均P<0.05），見(jiàn)圖4。

表4 氧化應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果（x）

例數(shù) SOD（μg/L） MDA（μmol/L）

研究組 97 141.94±35.37 8.67±2.11

對(duì)照組 105 161.52±28.59 6.21±1.42

t值 4.342 2.721

P值 <0.001 0.007

注：SOP：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

圖4 DR患者M(jìn)1/M2型M?與氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)系

注：SOP：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛。

2.5 M?與DR進(jìn)程的關(guān)系 研究組患者中Ⅰ期患者M(jìn)1/M2型M?占比最低，并隨著病理進(jìn)程逐漸升高，Ⅵ期患者M(jìn)1/M2型M?占比最高（P<0.05），表5。

表5 M?與DR進(jìn)程的關(guān)系

分期 例數(shù) M1/M2型M?

Ⅰ期 8 5.90±0.83

Ⅱ期 28 7.62±0.91a

Ⅲ期 22 ? 8.62±0.72ab

Ⅳ期 16 ? ?9.75±0.52abc

Ⅴ期 14 ? ?11.28±1.04abcd

Ⅵ期 9 ? ? 13.00±1.57abcde

F值 88.170

P值 <0.001

注：與Ⅰ期患者比較，aP<0.05，；與Ⅱ期患者比較，bP<0.05；與Ⅲ期患者比較，cP<0.05；與Ⅳ期患者比較，dP<0.05；與Ⅴ期患者比較，eP<0.05；MQ：巨噬細(xì)胞；DR：糖尿病視網(wǎng)膜病變。

3 討論

DM作為目前全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高的慢性疾病，已嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量[7]。DR作為DM中的并發(fā)癥，其發(fā)病率隨DM患者的增多不斷升高[8]。炎癥反應(yīng)在DR的病理過(guò)程中具有重要意義，且現(xiàn)代臨床治療中抗炎藥物是DR治療的關(guān)鍵之一。

M?不僅是人體免疫細(xì)胞，還對(duì)炎癥反應(yīng)調(diào)控有重要影響。現(xiàn)代臨床研究中指出，M?向M2方向極化可促進(jìn)視神經(jīng)功能恢復(fù)，調(diào)節(jié)M?極化可促進(jìn)實(shí)驗(yàn)性脈絡(luò)膜新生血管的形成[9]。本研究結(jié)果顯示，DR患者中M1型M?增加，而M2型M?減少，M1/M2型M?比例升高，提示DR患者中M?由M2型向M1型極化，與既往研究結(jié)果一致[10]。本研究結(jié)果還顯示，當(dāng)M1/M2型MQ>7.265時(shí)，診斷DM患者發(fā)生DR的靈敏度為83.51%，特異度為77.14%，AOC為0.8655，提示M1/M2型M?占比同作為DR潛在病情評(píng)估指標(biāo)。研究組患者IL-4、TGF-β水平均降低，而TNF-α、iNOS水平升高，提示患者存在明顯的炎性反應(yīng)，與既往DR的病理研究結(jié)果相符[11]。研究組患者中M1/M2型M?與 IL-4、TGF-β水平呈負(fù)相關(guān)，而與TNF-α、iNOS水平呈正相關(guān)，這也驗(yàn)證了M?極化與炎癥反應(yīng)的關(guān)系。同時(shí)，研究組患者血糖水平更高，且與M1/M2型M?成正比，證明M?極化與DR進(jìn)展密切相關(guān)。

此外，M1型M?可通過(guò)介導(dǎo)活性氧的生成加速組織再生的氧化應(yīng)激損傷并延緩創(chuàng)傷的愈合[7]。M2型M?則具有清除碎片、凋亡細(xì)胞的能力，可促進(jìn)機(jī)體內(nèi)過(guò)氧化物的分解，促進(jìn)組織損傷修復(fù) [12]。可見(jiàn)，M?極化對(duì)于細(xì)胞與組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)也有極為重要的影響。DR病變的過(guò)程中，氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇所致的視網(wǎng)膜微血管基底膜增厚、缺血性損傷等，這已是臨床公認(rèn)的病理機(jī)制[13]。本研究結(jié)果顯示，研究組患者SOD水平降低，MDA水平升高，提示M?極化過(guò)程存在明顯氧化應(yīng)激損傷，而M1/M2型M?與SOD呈負(fù)相關(guān)、與MDA呈正相關(guān)也提示M?極化對(duì)DR患者氧化應(yīng)激損傷的影響。研究發(fā)現(xiàn)隨著DR分期的增加，M1/M2型M?占比呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，可見(jiàn)隨著M?由M2向M1的極化程度的增加，DR的病情發(fā)展也會(huì)不斷加重。

綜上所述，DR患者中M?由M2型向M1型極化過(guò)程中炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激反應(yīng)加重，血糖水平升高，加速DR的惡性病理發(fā)展。

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