線粒體編碼基因Nad5、Nad6和Atp6參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成

陳二虎，袁國慶，陳艷，陳夢秋，孫晟源，唐培安

線粒體編碼基因、和參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成

陳二虎，袁國慶，陳艷，陳夢秋，孫晟源，唐培安

南京財經大學食品科學與工程學院/江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心/江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，南京 210023

【背景】銹赤扁谷盜（）是重要儲糧害蟲，其對磷化氫（phosphine）抗性問題尤為突出。線粒體是生物體的重要細胞器，是昆蟲進行呼吸代謝反應的核心場所，其中線粒體編碼基因參與調節昆蟲呼吸速率、能量代謝以及細胞信號轉導等生理過程。【目的】明確線粒體編碼基因在銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成過程中的作用。【方法】通過CO2檢測儀測定銹赤扁谷盜不同磷化氫抗性種群試蟲的呼吸速率；利用RT-qPCR技術解析線粒體編碼基因在磷化氫抗性水平和呼吸速率均差異最大的銹赤扁谷盜太倉和上海種群試蟲中的表達模式，并進行線粒體復合體I和V的活性測定；通過RT-qPCR技術研究關鍵線粒體編碼基因和對磷化氫脅迫響應的表達模式以及脅迫后線粒體復合體I和V的活性變化。利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術沉默銹赤扁谷盜線粒體編碼基因和，同時分析上述基因被有效沉默后試蟲呼吸速率和磷化氫敏感性變化情況。【結果】銹赤扁谷盜呼吸速率與磷化氫抗性水平呈負相關關系，即害蟲呼吸速率均隨磷化氫抗性倍數增加而顯著下降。RT-qPCR結果表明線粒體編碼基因在銹赤扁谷盜磷化氫極高抗種群（太倉種群，RR=1 906.8）表達量顯著低于相對敏感種群（上海種群，RR=1.4），且線粒體復合體I和V的酶活性與線粒體基因表達模式相一致。銹赤扁谷盜經磷化氫熏蒸脅迫后，關鍵線粒體編碼基因和被顯著抑制，線粒體復合體I和V的酶活性均顯著降低。注射dsRNA有效沉默關鍵線粒體編碼基因和后，銹赤扁谷盜呼吸速率顯著降低，磷化氫敏感性顯著下降。【結論】線粒體編碼基因參與銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成。

銹赤扁谷盜；儲糧害蟲；磷化氫抗性；線粒體；RNA干擾

0 引言

【研究意義】銹赤扁谷盜（）是世界范圍內危害最嚴重的儲糧害蟲之一，其一旦局部暴發便可在糧食儲運過程中引發嚴重的經濟損失[1-4]。磷化氫（PH3）作為一種高活性的小分子氣體熏蒸劑，具備使用成本低、穿透性強、殺蟲效果好、殘留低等優點，已成為使用最為廣泛的儲糧熏蒸劑[5-6]。然而，由于糧食倉儲行業對磷化氫的長期依賴以及磷化氫熏蒸的頻繁使用導致包括赤擬谷盜（）、谷蠹（）、玉米象（）等多種害蟲對磷化氫產生抗性[6-9]。其中銹赤扁谷盜磷化氫抗性問題尤為突出，該害蟲磷化氫抗性發展速度及對磷化氫的耐受能力均高于其他儲糧害蟲[10-12]。鑒于目前尚未發現能有效替代磷化氫的熏蒸劑，為避免和延緩磷化氫抗性的進一步發展，磷化氫抗性機制的研究尤為重要[13]。【前人研究進展】當前，儲糧害蟲磷化氫抗性形成機制研究主要集中于解毒代謝、表皮穿透和靶標抗性方面。谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase）、細胞色素P450、羧酸酯酶（carboxylesterase）等解毒代謝相關基因在抗性害蟲中顯著高表達或可被磷化氫誘導表達。通過RNAi技術有效沉默赤擬谷盜和，可顯著提高對磷化氫的敏感性，表明解毒代謝反應在昆蟲對磷化氫抗性形成中起著關鍵作用[14-16]。另外，研究發現眾多表皮相關基因在儲糧害蟲磷化氫抗性品系中顯著高表達，有效沉默上述關鍵表皮蛋白基因后，試蟲磷化氫抗性水平顯著下降[17-18]。磷化氫在昆蟲體內的靶標位點是線粒體，藥劑通過降低線粒體膜電位，顯著提升蟲體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，從而引起氧化損傷，最終致使害蟲死亡。研究發現昆蟲線粒體重要的二聚體酶基因——二氫硫辛酰胺脫氫酶（dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD）基因的突變介導了昆蟲對磷化氫高抗性[19-20]。昆蟲線粒體基因組編碼了共13種蛋白質亞基，包括7種NADH脫氫酶亞基（和）、1種細胞色素b（）、3種細胞色素c氧化酶亞基（和）以及2種Atp合成酶亞基（和）[21]。【本研究切入點】線粒體編碼基因轉錄水平的變化與昆蟲生長發育、藥劑抗性、極端溫度等環境適應性間存在著密切關聯[22-23]，然而其是否參與磷化氫抗性形成尚屬未知。【擬解決的關鍵問題】闡釋線粒體編碼基因在銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成中的重要作用，為解決糧食倉儲行業的磷化氫抗性問題打下理論基礎。

1 材料與方法

試驗于2021年1月至2023年10月在南京財經大學食品科學與工程學院儲糧害蟲防治實驗室完成。

1.1 供試昆蟲

根據聯合國糧農組織FAO推薦值并依據其抗性調查數據，確定銹赤扁谷盜敏感品系致死中濃度（LC50）為0.011 mg·L-1，其中昆蟲抗性倍數（RR）=測定品系的LC50/敏感品系的LC50，且抗性倍數1—5倍為無抗性或敏感；5—10倍為低抗性；10—40倍為中等抗性；40—160倍為高抗性；160倍以上則屬于極高抗性。供試4個地理種群銹赤扁谷盜分別采自上海（Shanghai，SH）、湘陰（Xiangyin，XY）、懷化（Huaihua，HH）和太倉（Taicang，TC），磷化氫抗性倍數分別為1.4（LC50=0.0154 mg·L-1，低抗性）、29.6（LC50=0.3256 mg·L-1，中等抗性）、362.7（LC50=3.9897 mg·L-1，極高抗性）和1 906.8（LC50=20.9748 mg·L-1，極高抗性）。上述試蟲均在實驗室內連續飼養20代以上，飼養環境為恒溫（30±1）℃、相對濕度（75±5）%、無光照。

1.2 呼吸速率測定

挑選不同儲糧害蟲2周齡成蟲10頭，置于50 ml的玻璃蟲室中，確保其氣密性，在恒溫30 ℃、相對濕度（75±5）%、無光照的環境下使用便攜式CO2檢測儀（B1010，深圳市沃賽特科技有限公司）監測密閉蟲室內的CO2含量，杯口配置一個剛好適合且厚度約為8 mm橡皮塞，橡皮塞上扎一小孔，將CO2探測器伸入蟲室，并在橡皮塞與杯口的交接處繞上封口膜，每組生物學重復的測量時間為30 min，每隔3 min記錄一次數據，重復3次，試蟲放入氣室后需要10 min左右才能進入穩定的呼吸狀態。呼吸速率：以每頭試蟲每分鐘釋放的CO2（μL·L-1·min-1）表示[24]。共設置3次生物學重復。

1.3 線粒體編碼基因表達量測定

為了分析銹赤扁谷盜太倉種群（極高抗性）和上海種群（低抗性）的線粒體編碼基因表達模式，選取上述2個地理種群30頭2周齡的成蟲作為樣本。使用Trizol法提取樣本的總RNA（濃度500—600 ng·μl-1），并用RQ1 RNase-Free DNase去除基因組DNA。然后，通過核酸濃度測定儀檢測RNA的濃度和純度，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳來評估RNA的完整性。利用HiScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技有限公司，中國）從樣本中合成第一鏈cDNA，隨后將獲得的目標產物保存于-20 ℃冰箱。

基于銹赤扁谷盜完整的線粒體基因組（GenBank登錄號：MH475917），獲得13個線粒體編碼基因的序列[25]，使用Primer Premier軟件設計用于RT-qPCR的特異性引物（表1）。以和作為內參基因[26]。使用ChamQTMSYBR? qPCR Master Mix（Low Rox Premixed）712試劑盒和ABI 7500 PCR系統（Applied Biosystems，USA）進行RT-qPCR反應，以分析線粒體編碼基因的相對表達量。每個樣品設置3次生物學重復和3次技術性重復，使用2-??CT方法對數據進行定量分析[27]。

1.4 線粒體復合體活性檢測

選取銹赤扁谷盜太倉種群（極高抗性）和上海種群（低抗性）試蟲進行線粒體復合體活性測定。將30頭2周齡銹赤扁谷盜成蟲加入1.5 ml勻漿介質（0.9%的生理鹽水）中，使用組織研磨儀以25 Hz的條件研磨組織樣本5 min。隨后，樣本以6 000 r/min的速度離心10—15 min，以分離上清液。然后，采用BCA方法測定上清液中總蛋白的含量。線粒體復合體I和V的活性通過南京建成生物工程研究所生產的線粒體呼吸鏈復合物I試劑盒（A089-1-1）和線粒體呼吸鏈復合物V試劑盒（A089-5-1）進行檢測。依據官網（http://www.njjcbio.com）公布的詳細操作說明完成試驗。共設置3次生物學重復，每個重復均包含30頭銹赤扁谷盜試蟲。

1.5 磷化氫脅迫下線粒體基因表達量和復合體活性測定

選取銹赤扁谷盜上海種群2周齡成蟲開展磷化氫脅迫試驗。參照聯合國糧農組織（1975）推薦的方法，將50頭試蟲放入熏蒸瓶中，用凡士林把熏蒸瓶與玻璃旋塞密封，使用磷化氫氣體檢測儀（MS400-PH3，北京佳糧科貿有限公司，中國）檢測磷化氫濃度，使用氣密性注射器（Hamilton 7000，北京英偉達科技有限公司，中國）抽取所需濃度的磷化氫氣體（LC30=0.0122 mg·L-1作為磷化氫熏蒸濃度）注入熏蒸瓶搖勻，用燭油密閉注射孔，放入溫度（30±1）℃、相對濕度（75±5）%的培養箱中，熏蒸處理12 h后快速挑取存活的試蟲進行后續試驗。隨后，為與檢測的線粒體復合體相對應，從銹赤扁谷盜13個線粒體基因中選取編碼線粒體復合體I的關鍵基因、和編碼線粒體復合體V的關鍵基因進行后續基因表達模式和RNA干擾的功能研究。參照1.3節方法進行總RNA提取、cDNA合成和RT-qPCR試驗，參照1.4節進行線粒體復合體I和V活性檢測。共設置3個生物學重復，每個重復均包含50頭試蟲。

表1 本研究RT-qPCR所用引物序列

1.6 線粒體基因沉默后試蟲磷化氫敏感性和呼吸速率檢測

選取3個線粒體編碼基因、和進行功能驗證，使用Primer Premier軟件設計雙鏈RNA（dsRNA）片段的合成引物（表2），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。dsRNA的合成利用Promega公司的T7 RiboMAXTMExpress RNA試劑盒完成，dsRNA引物和所得產物均通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。參照HUANG等[15]的方法，將約300 ng（濃度約1 000 ng·μL-1，體積為300 nL）dsRNA注射到銹赤扁谷盜（上海種群）蛹內（注射位置為蛹的腹側第1節或第2節），注射RNase-free water（南京諾唯贊生物技術有限公司，中國）視為空白對照，注射ds視為陰性對照。注射后，將試蟲放入培養箱中正常飼養，取2周齡成蟲并參照1.3節的方法進行基因的沉默效率檢測。最后，、和被沉默后，參照1.2節方法進行銹赤扁谷盜呼吸速率變化檢測；參照聯合國糧農組織（1975）推薦的方法進行磷化氫敏感性變化的檢測，選取2周齡成蟲，并以磷化氫的亞致死濃度（LC30= 0.0122 mg·L-1）對試蟲進行處理（密閉熏蒸20 h），待氣體散去后統計試蟲死亡數量，連續統計14 d（毛筆輕觸蟲體尾部，附肢無反應即為死亡）。上述試驗均設置3次生物學重復，每次重復均包含30頭銹赤扁谷盜試蟲。

表2 本研究所用dsRNA引物序列

1.7 數據統計與分析

使用SPSS 26.0分析試驗數據，兩組以上的數據采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行均值多重比較，并利用圖基檢驗法（Tukey’s test）進行顯著性分析（＜0.05）。兩組數據采用獨立樣本檢驗進行差異顯著性分析（*＜0.05，**＜0.01，***＜0.001）。采用Origin 2021作圖。

2 結果

2.1 不同磷化氫抗性種群試蟲的呼吸速率

4個磷化氫抗性種群銹赤扁谷盜（SH、XY、HH和TC）的呼吸速率見圖1。結果顯示，不同磷化氫抗性種群銹赤扁谷盜呼吸速率均與磷化氫抗性倍數呈負相關關系，銹赤扁谷盜TC種群（RR=1 906.8）和HH種群（RR=362.7）試蟲的呼吸速率顯著低于XY種群（RR=29.6）和SH種群（RR=1.4）。

圖中數據為平均值±標準差，柱上標有不同小寫字母表示樣品間差異顯著（P＜0.05，Tukey’s test）Data are mean±SD, and different lowercases on the bars indicate the significant difference among samples (P＜0.05, Tukey’s test)。圖6—圖8同The same as Fig. 6-Fig. 8

2.2 線粒體編碼基因在銹赤扁谷盜不同磷化氫抗性種群中的表達模式

13個線粒體編碼基因的表達水平在低抗種群（SH）和極高抗種群（TC）試蟲中均存在顯著差異（＜0.01），且在SH種群試蟲的表達量顯著高于TC種群。SH種群銹赤扁谷盜線粒體編碼基因和的表達量分別為TC種群的1.76、1.82、1.63、1.78、2.40、1.93、1.81、1.81、1.92、1.90、1.73、1.93和1.97倍（圖2）。

2.3 不同磷化氫抗性種群試蟲的線粒體復合體活性

線粒體復合體I和V活性在銹赤扁谷盜磷化氫低抗種群（SH）和極高抗種群（TC）試蟲中的變化如圖3所示，兩個種群試蟲的線粒體復合體I（圖3-A）和V（圖3-B）的活性之間均存在顯著差異（＜0.01），SH種群銹赤扁谷盜線粒體復合體I和V的活性分別為TC種群的1.95和1.83倍。

2.4 磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體編碼基因的表達水平

測定了銹赤扁谷盜SH種群試蟲經LC30濃度磷化氫熏蒸脅迫12 h后，關鍵線粒體編碼基因和的表達水平變化（圖4）。結果顯示，經磷化氫熏蒸脅迫后和表達水平顯著下調（＜0.05），分別降低47.00%、33.00%和73.00%。

圖中數據為平均值±標準差，采用獨立樣本t檢驗分析差異顯著性Data are mean±SD, and independent sample t test was used to analyze the significance of the difference (* P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001)。圖3—圖5同The same as Fig. 3-Fig. 5

圖3 銹赤扁谷盜TC和SH種群試蟲線粒體復合體活性差異

A: Nad5; B: Nad6; C: Atp6

2.5 磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體復合體活性

銹赤扁谷盜SH種群試蟲經LC30濃度磷化氫熏蒸脅迫12 h后，線粒體復合體I和V的活性變化如圖5所示，經磷化氫熏蒸脅迫后，線粒體復合體I和V的活性顯著降低（＜0.001），分別降低68.46%（圖5-A）和68.81%（圖5-B）。

圖5 磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體復合體活性變化

2.6 注射dsRNA后線粒體編碼基因的表達水平變化

銹赤扁谷盜SH種群試蟲注射特異性dsds和ds后，目標線粒體編碼基因的表達水平變化如圖6所示，陰性對照組（ds）目標基因表達水平與空白對照組（RNase-free water）相比無顯著差異，處理組目標線粒體編碼基因被有效沉默，表達水平與陰性對照組相比呈顯著下調（＜0.05），基因沉默效率分別達到56.6%（圖6-A）、60.7%（圖6-B）和57.4%（圖6-C）。

2.7 RNA干擾后銹赤扁谷盜呼吸速率變化

銹赤扁谷盜SH種群試蟲注射特異性dsds和ds后，呼吸速率的變化如圖7所示，目標線粒體編碼基因被有效沉默后，與陰性對照組（ds）相比處理組試蟲呼吸速率顯著降低（＜0.05），分別降低17.67%（圖7-A）、21.40%（圖7-B）和22.33%（圖7-C）。

2.8 RNA干擾后銹赤扁谷盜磷化氫敏感性變化

銹赤扁谷盜SH種群試蟲注射特異性dsds和ds后，再經磷化氫（LC30=0.0122 mg·L-1）熏蒸20 h后死亡率的變化如圖8所示，線粒體基因被有效沉默后，試蟲的死亡率與對照組（ds）相比顯著降低（＜0.05），即銹赤扁谷盜對磷化氫敏感性顯著下降，死亡率分別降低33.33%（圖8-A）、41.10%（圖8-B）和47.78%（圖8-C）。

圖6 RNA干擾后銹赤扁谷盜線粒體編碼基因表達水平變化

圖7 RNA干擾后銹赤扁谷盜呼吸速率變化

圖8 RNA干擾后銹赤扁谷盜磷化氫敏感性變化

3 討論

3.1 不同磷化氫抗性種群銹赤扁谷盜的呼吸速率

線粒體是細胞內負責能量生產的重要器官，其能量轉換效率直接影響細胞及整個生物體的能量代謝和功能狀態，呼吸速率則是線粒體功能的重要指標，反映線粒體在氧化磷酸化過程中的能量轉換效率[28-29]。研究發現，呼吸作用是昆蟲吸收磷化氫的主要途徑，昆蟲對磷化氫敏感程度與其自身呼吸速率密切相關，即害蟲增強呼吸速率可提升其藥劑敏感性，而抑制昆蟲呼吸速率則可增強其磷化氫耐受性，表明昆蟲呼吸速率會伴隨試蟲磷化氫抗性水平變化而呈現動態變化[30-33]。類似地，本研究發現不同地理種群的銹赤扁谷盜呼吸速率與試蟲磷化氫抗性水平呈負相關關系，即隨著磷化氫抗性水平增加儲糧害蟲呼吸速率顯著降低（圖1）。

3.2 不同磷化氫抗性種群和磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體編碼基因表達變化

線粒體是磷化氫在昆蟲體內的主要靶標位點，該熏蒸劑直接作用于線粒體的電子傳遞鏈，通過降低線粒體膜電位，顯著提升蟲體內活性氧（ROS）水平，從而引起氧化損傷，最終致使害蟲死亡。線粒體編碼基因直接參與形成線粒體電子傳遞鏈的多個組分，這些基因的轉錄和翻譯水平影響線粒體復合體的量和質，從而調節整個電子傳遞鏈的活性[34-35]。SCHLIPALIUS等研究表明，昆蟲線粒體編碼基因的表達水平下降，會導致線粒體的功能改變，進而影響昆蟲呼吸速率，導致害蟲對磷化氫的敏感性顯著降低[19-20]。與之相似，本研究發現銹赤扁谷盜13個線粒體編碼基因在不同地理種群試蟲中的表達水平與呼吸速率變化模式相一致，即基因在抗性種群試蟲中表達水平被顯著抑制（圖2）。隨后，選取線粒體復合體I中2個線粒體基因（和）和線粒體復合體V中的線粒體基因進行后續磷化氫脅迫和RNA干擾的功能研究。磷化氫脅迫試驗顯示，經熏蒸劑處理12 h，上述3個關鍵線粒體基因表達水平顯著下降（圖4），表明磷化氫脅迫條件下可引起關鍵線粒體基因的應激反應，即磷化氫可以抑制線粒體呼吸鏈上關鍵基因的表達，進而可能影響昆蟲正常呼吸速率，從而降低磷化氫通過呼吸反應進入銹赤扁谷盜體內的量，暗示銹赤扁谷盜磷化氫抗性形成與線粒體編碼基因間可能存在密切聯系。同樣，對三色書虱（）和玉米象的研究發現經辣根素熏蒸處理后，眾多線粒體編碼基因包括等的表達水平均被顯著抑制[36-37]。

3.3 不同磷化氫抗性種群和磷化氫脅迫下銹赤扁谷盜線粒體復合體活性變化

線粒體復合體的活性是電子傳遞和質子泵動力的核心，這些復合體的活性高低直接影響到跨線粒體內膜的質子梯度建立及ATP合酶的ATP合成效率[38]。TAUBER等研究發現，線粒體編碼基因的表達水平發生變化會相應地改變復合體蛋白的合成，進而影響到ETC的效能和呼吸速率[39]。例如，編碼復合體I亞基的基因表達增強會增加復合體I的裝配和活性，從而提高呼吸速率，而這種調控可能通過反饋機制影響其他線粒體復合體的活性[40-43]。本研究發現在不同磷化氫抗性種群試蟲和磷化氫脅迫處理條件下，銹赤扁谷盜線粒體復合體I和V的活性變化與相應線粒體編碼基因的表達模式相一致，即在抗性試蟲和磷化氫脅迫下酶的活性均顯著降低（圖3、圖5）。同樣，針對玉米象的研究揭示了磷化氫熏蒸對玉米象線粒體復合體I和V活性的抑制效果[44]，且辣根素熏蒸處理顯著降低玉米象線粒體復合體I和IV酶的活性[37,45]。此外，線粒體復合體活性的降低與磷化氫抗性增強相關[46]，如線粒體編碼基因表達水平的下調導致秀麗隱桿線蟲（）的磷化氫抗性增加，當線粒體復合體活性被抑制時，也會增強對磷化氫的抗性[33]。根據以上研究可以看出磷化氫等熏蒸劑對線粒體編碼基因和復合體活性的影響是顯著的，磷化氫熏蒸導致線粒體編碼基因的表達水平顯著下調，這可能會影響線粒體復合體的組裝和活性，進一步暗示線粒體編碼基因與磷化氫抗性間的密切關系。

3.4 沉默線粒體編碼基因顯著降低銹赤扁谷盜磷化氫敏感性

采用RNA干擾技術開展進一步的功能研究，線粒體編碼基因和被有效沉默后，發現銹赤扁谷盜呼吸速率顯著降低（圖7），且試蟲經磷化氫熏蒸處理后銹赤扁谷盜的死亡率顯著降低，表明該害蟲磷化氫敏感性顯著降低（圖8）。銹赤扁谷盜呼吸速率的降低可能歸因于關鍵線粒體編碼基因被沉默后，試蟲電子傳遞鏈蛋白質的合成受到影響，進而降低線粒體復合體酶的活性水平。同時推測，昆蟲呼吸速率降低會減少磷化氫的攝入量，從而降低磷化氫對電子傳遞鏈的影響，使得害蟲能夠更有效地承受磷化氫的毒性壓力，增強銹赤扁谷盜對磷化氫適應性，最終導致昆蟲對磷化氫敏感性顯著降低。類似地，玉米象線粒體編碼基因被有效沉默后，試蟲對辣根素的敏感性顯著下降[43]。有研究證實磷化氫可直接作用于線粒體，線粒體功能的直接改變可能與昆蟲磷化氫抗性形成有關，并發現沉默線粒體呼吸鏈基因可導致高達10倍的磷化氫抗性增加[33]。此外，基于RNA干擾技術，沉默線蟲中21個線粒體呼吸鏈基因，可導致線蟲的呼吸速率降低，磷化氫敏感性顯著降低，揭示了磷化氫抗性的產生可能與線粒體呼吸鏈的相關基因有關[47]。基于上述研究，可以推測線粒體編碼基因表達水平的變化及線粒體復合體活性改變是儲糧害蟲適應磷化氫脅迫和抗性形成的重要機制之一。即銹赤扁谷盜線粒體編碼基因表達量和復合體酶活性的降低，導致電子傳遞鏈的效率下降，從而降低試蟲呼吸速率而減少磷化氫的吸收，最終增強害蟲對磷化氫的耐受性。

4 結論

銹赤扁谷盜的呼吸速率均隨試蟲磷化氫抗性倍數的增加而顯著下降，表明具有較低呼吸速率的害蟲群體對磷化氫展現出更高的耐受性。銹赤扁谷盜線粒體編碼基因的表達水平以及線粒體復合體的活性均與其磷化氫抗性水平呈負相關關系；且在磷化氫熏蒸處理條件下，銹赤扁谷盜關鍵線粒體編碼基因和表達水平以及線粒體復合體活性均被顯著抑制。通過RNA干擾技術有效沉默和，銹赤扁谷盜呼吸速率顯著降低，且試蟲對磷化氫敏感性顯著降低。綜上，推測銹赤扁谷盜可通過抑制線粒體編碼基因表達，進而降低呼吸速率而增強害蟲磷化氫抗性水平，表明線粒體編碼基因與儲糧害蟲磷化氫抗性形成密切相關。

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Mitochondrial Protein-Coding Genes,andare Involved in Phosphine Resistance of

CHEH ErHu, YUAN GuoQing, CHEN Yan, CHEN MengQiu, SUN ShengYuan, TANG PeiAn

College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety of Jiangsu Province/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing of Jiangsu Province, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023

【Background】is one of the most economically important stored-grain pests, and its phosphine resistance is particularly prominent. Mitochondria are important organelles in living organisms, which are the core site for insects to undergo respiratory metabolic reactions. Mitochondrial protein-coding genes (PCGs) are involved in regulating physiological processes of insects, such as respiratory rate, energy metabolism, and cell signal transduction.【Objective】The objective of this study is to clarify the roles of mitochondrial PCGs in phosphine resistance of.【Method】The respiratory rates of different phosphine resistant populations ofwere measured by using a CO2detector. The Taicang and Shanghai populations ofwith greatest differences in phosphine resistance levels and respiratory rates were selected to analyze the expression patterns of mitochondrial PCGs by using RT-qPCR technology, and the activities of mitochondrial complexes I and V were measured as well. The expression levels of three key mitochondrial PCGs including,and, and the activities of mitochondrial complex I and V were determined after phosphine fumigation treatments in. RNA interference (RNAi) was used to silence,and, and then the changes of respiratory rate and phosphine sensitivity ofwere analyzed.【Result】There was a negative correlation between the respiratory rate and phosphine resistance levels of,that is, the respiratory rates significantly decreased with the increase of phosphine resistance levels. The RT-qPCR results showed that the expression levels of mitochondrial PCGs in the highly phosphine resistant population (Taicang population, RR=1 906.8) ofwere significantly lower than those in the relatively sensitive population (Shanghai population, RR=1.4), and the enzyme activities of mitochondrial complexes I and V were consistent with the expression patterns of mitochondrial PCGs. The expression levels of three key mitochondrial PCGs,,and, and the activities of mitochondrial complexes I and V were significantly inhibited after phosphine fumigation treatments in. The key mitochondrial PCGs,,andwere silenced by injecting dsRNA, which resulted in a significant decrease in respiratory rate and phosphine sensitivity of.【Conclusion】The mitochondrial PCGs are involved in phosphine resistance of.

; stored-grain pest; phosphine resistance; mitochondria; RNA interference (RNAi)

10.3864/j.issn.0578-1752.2024.09.008

2023-12-13；

2024-01-16

國家重點研發計劃（2023YFD1701203，2021YFD2100604）、江蘇省重點研發計劃（BE2022377）、國家自然科學基金（32001915，32272388）、江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（YXK2103）

陳二虎，E-mail：erhuchen1104@163.com。通信作者唐培安，E-mail：tangpeian@163.com

（責任編輯 岳梅）