茶樹葉片黃化變異相關(guān)的CAB基因家族鑒定及關(guān)鍵基因挖掘

摘要：捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（Light-harvesting chlorophyll a/b binding protein，CAB）基因家族成員在植物葉片黃化變異中具有重要作用。本研究利用鐵觀音（Camellia sinensis Tieguanyin）基因組數(shù)據(jù)對CAB基因家族進行了篩選，并進行了生物信息學(xué)和表達模式分析；進一步以不同黃化、綠葉茶樹品種（系）為材料，通過基因克隆和qRT-PCR，分析CABs基因的表達特性，結(jié)合葉色參數(shù)和葉綠素SPAD值的相關(guān)性分析篩選出與茶樹黃化變異相關(guān)的關(guān)鍵CAB基因。結(jié)果表明，共鑒定到25個CAB基因家族成員，其氨基酸長度為167～337個，蛋白分子質(zhì)量為18.5～37.1 kDa，大部分CAB成員屬于穩(wěn)定性蛋白和疏水性蛋白，并且亞細胞定位預(yù)測在葉綠體上；根據(jù)進化關(guān)系25個CAB家族成員分為13個亞家族，Lhcb1亞族的成員數(shù)量最多；啟動子分析顯示，CAB家族成員啟動子中包含大量的光響應(yīng)元件，還有其他與植物生長發(fā)育、激素和逆境脅迫響應(yīng)相關(guān)的元件。從茶樹中克隆Lhcb1亞家族成員，通過序列比對篩選出CAB1、CAB6和CAB7基因；表達分析顯示，CAB1、CAB6和CAB7基因都具有組織表達特異性，在芽、葉和果實中表達量較高，并能響應(yīng)多種逆境脅迫。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，CAB1、CAB6和CAB7基因在黃、綠茶樹的葉片中具有一致的表達特性：與正常綠葉相比，黃化葉片中的CABs基因表達均顯著下調(diào)；通過與葉色參數(shù)和葉綠素SPAD值的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CAB1、CAB6和CAB7表達量與葉色參數(shù)a、b、L值以及葉綠素SPAD值均呈極顯著相關(guān)（Plt;0.01），其中CAB1的基因表達量與葉色相關(guān)參數(shù)和葉綠素SPAD值的相關(guān)性最顯著；煙草亞細胞定位結(jié)果顯示，CAB1在細胞核、細胞膜和葉綠體上均有分布。以上研究初步解析了茶樹CAB家族成員的基本特征，挖掘出與茶樹葉色變異緊密相關(guān)CAB基因，后續(xù)可作為候選關(guān)鍵基因進行深入研究，以期為茶樹葉色變異的分子調(diào)控機制的研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶樹；捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白；葉色黃化變異；基因克隆；表達分析

中圖分類號：S571.1；S326 " " " " " " "文獻標識碼：A nbsp; " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）02-175-18

Identification of CAB Gene Family and Excavation of

Key Genes Related to Leaf Yellowing Variationin

Tea Plants （Camellia sinensis）

ZHONG Sitong1，2， ZHANG Yazhen2， YOU Xiaomei2， CHEN Zhihui2， KONG Xiangrui2，

LIN Zhenghe2， WU Huini1，2， JIN Shan1*， CHEN Changsong1，2*

1. College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China; 2. Tea Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Branch， National Center for Tea Improvement， Fuzhou 350012， China

Abstract： Members of the light-harvesting chlorophyll a/b binding protein （CAB） gene family play an important role in plant leaf yellowing variation. In this study， the CAB family members were identified from tea plant ‘Tieguanyin’ genomic data. The bioinformatics and expression patterns were analyzed. Furthermore， the expression patterns of the CABs gene were analyzed by gene cloning and qRT-PCR in tea cultivars with different leaf colors. The key CAB genes related to tea yellowing were screened by correlation analysis of leaf color parameters and chlorophyll SPAD values. The results show that 25 members of the CAB gene family were identified， their amino acid length ranged from 167-337 and the protein molecular weight ranged from 18.5-37.1 kDa. Most CAB members were stable and hydrophobic proteins， and distributed in chloroplast by the subcellular localization prediction. According to the evolutionary relationship， CAB family members are divided into 13 subfamilies， and the Lhcb1 subfamily has the most members. Cis-acting element analysis of promoter shows that CAB family members have a lot of light-responsive elements， as well as other elements related to growth and development， hormone response， and adversity stress. The members of Lhcb1 subfamily were cloned from tea plants， CAB1， CAB6， and CAB7 genes were screened by sequence alignment. The expression analysis shows that CAB1， CAB6， and CAB7 genes had tissue expression characteristics with higher expression levels in buds， leaves and fruits， and could respond to various stresses. Finally， the qRT-PCR indicates that the expressions of CAB1， CAB6， and CAB7 genes were consistent in the yellow and green leaves. Compared with green leaves， the expression of CAB genes in yellow leaves were significantly down-regulated. The correlation analysis of gene expressions and related leaf color parameters shows that the gene expressions of CAB1， CAB6， and CAB7 were significantly correlated with leaf color parameters a， b， L， and chlorophyll SPAD values （Plt;0.01）. Among them， the expression of CAB1 shows the highest correlation coefficient. The subcellular localization analysis shows that CAB1 was distributed in the nucleus， cytoplasm， and chloroplasts. The studies analyzed the basic characteristics of CAB family members in tea plants and the key genes related to tea color variation were identified， which provided a theoretical basis for the molecular regulation mechanism of tea color variation.

Keywords： Camellia sinensis， CAB， yellowing variation， gene cloning， expression analysis

光合作用是植物生命活動之一，為植物的生長發(fā)育提供所需的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。葉綠體作為植物進行光合作用的主要場所，依賴類囊體膜上的光系統(tǒng)I（Photosystem I，PSI）、光系統(tǒng)Ⅱ（Photosystem Ⅱ，PSⅡ）以及細胞色素b6f等多個蛋白復(fù)合物協(xié)同作用，進行光能捕獲、吸收和轉(zhuǎn)換等過程[1]。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（Light-harvesting chlorophyll a/b binding protein，CAB）是分布在PSI和PSⅡ上的類囊體膜蛋白，通過與葉綠素、類胡蘿卜素和葉黃素等色素分子結(jié)合，發(fā)揮光能吸收、能量分布，以及維持類囊體結(jié)構(gòu)等作用[2]。根據(jù)結(jié)構(gòu)和進化關(guān)系，高等植物的CAB蛋白家族被分成Lhca（Light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins of photosystem I）和Lhcb（Light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins of photosystem Ⅱ）兩個蛋白亞族，分別由Lhca和Lhcb兩個多基因家族編碼。其中，Lhca又被細分為6個基因亞族Lhca1-6，是編碼PSI中LHCI（Light harvesting complex I）的主要成員；Lhcb分為8個基因亞族Lhcb1-8，參與編碼PSII中的LHCII（Light harvesting complex Ⅱ）[3]。

以往研究表明，CAB基因在植物葉綠體中存在特異表達，并具有葉片優(yōu)先表達模式，對調(diào)控葉片的生長發(fā)育十分關(guān)鍵[4]。在擬南芥中，敲除或下調(diào)Lhcb基因，都會影響植株光合速率和葉綠素含量，從而出現(xiàn)淺綠色或泛白的葉色表型以及生長延遲的現(xiàn)象[5-7]。沉默陸地棉GhLhcb2.3和獼猴桃Lhcb3.1/3.2同樣發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株葉綠素含量降低，尤其是影響葉綠素a的合成[8-9]。反之，過表達SaLhcb2的轉(zhuǎn)基因煙草則能表現(xiàn)出更好的植株生長勢、更高的生物量和葉綠素含量[10]。番茄LeLhcb2和枇杷EjLhc4.1/5/6的轉(zhuǎn)基因植株也有類似地表現(xiàn)，并且在低溫脅迫下也能維持優(yōu)于野生型植株的生長狀態(tài)[11-12]。此外，當植物面對不同的逆境脅迫時，CABs基因的表達水平也會通過上調(diào)或下調(diào)變化作出應(yīng)答，在毛竹、東南景天和水稻等植物中已相繼證明了CAB在植物抗逆方面起著至關(guān)重要的作用[13-15]。

黃化茶樹是一類珍稀的茶樹葉色突變體，更是制茶品質(zhì)優(yōu)異的寶貴種質(zhì)資源，通過開展黃化茶樹的分子機制和代謝機理相關(guān)研究，對改善黃化茶樹品質(zhì)和提高其生產(chǎn)利用具有重要意義。Ma等[16]對英紅九號的黃化突變體的黃葉和綠葉進行蛋白組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CAB蛋白、細胞色素b6f復(fù)合物和F型ATP酶等與光合作用相關(guān)的蛋白差異最顯著。Liu等[17]對勐海黃葉的黃化葉、綠葉和返綠葉研究同樣發(fā)現(xiàn)，與光合作用相關(guān)的基因和與葉綠素合成相關(guān)的基因存在顯著差異表達，其中，編碼CAB蛋白的多個基因在黃化葉中顯著下調(diào)。中黃1號、白葉1號和福黃1號等其他黃化茶樹中也有類似發(fā)現(xiàn)，即CAB基因家族成員在黃化茶樹中的表達量會顯著低于綠葉茶樹[18-20]。上述研究表明，CAB基因表達量的變化與茶樹葉色變異緊密相關(guān)。然而，目前少有研究針對茶樹完整的CAB基因家族成員進行深入分析，并且在以往針對茶樹CAB基因家族成員的克隆研究中，試驗材料通常采用單一綠葉或黃化茶樹，需進一步擴大樣本量，在更多的材料中進行驗證。與茶樹黃化密切相關(guān)的CAB基因家族成員還有待挖掘，關(guān)于茶樹CAB基因的作用機制也有待研究。因此，本研究首先用鐵觀音茶樹基因組篩選出CAB基因家族成員，通過生物信息學(xué)方法對其基因結(jié)構(gòu)、啟動子和系統(tǒng)發(fā)育等方面進行分析。其次，基于前人研究結(jié)果，重點研究與葉色調(diào)控密切相關(guān)的Lhcb1亞家族成員，通過克隆Lhcb1亞家族的CABs基因，研究其在不同黃、綠茶樹品種間的表達模式，并評估CABs基因表達量與葉色參數(shù)和葉綠素含量的相關(guān)性，以期挖掘出與茶樹葉色變異緊密相關(guān)的關(guān)鍵CAB基因，為深入研究茶樹CAB基因的作用機制提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以種植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所的茶樹種質(zhì)資源為試驗材料，于2023年4月（15～27 ℃）選取綠葉茶樹種質(zhì)福鼎大白茶、黃棪、福云6號和白雞冠自然雜交后代0306A、0317D、0309E；黃、白化茶樹種質(zhì)白葉1號、白雞冠及其自然雜交后代0309C、0317L、0317F、0317H、0306E、0306C、0306D的一芽一葉新梢，液氮速凍，置于﹣80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗材料白葉1號采樣期間屬于返綠階段。經(jīng)多年田間性狀調(diào)查0306A、0317D、0309E 3個材料屬于表型穩(wěn)定的綠葉茶樹，而白雞冠及其自然雜交后代的7個黃化株系材料在自然生長狀態(tài)下，一芽一葉新梢也具有穩(wěn)定的黃化表型，無返綠現(xiàn)象。

本氏煙草（Nicotiana benthamiana）種植：播種煙草種子若干于土壤中，在25 ℃、12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)1個月后用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樹CAB基因家族成員鑒定

從鐵觀音茶樹數(shù)據(jù)庫中獲取全基因組蛋白序列文件和基因注釋文件，以擬南芥CAB家族成員的蛋白序列為索引，在鐵觀音基因組中比對出CAB基因家族的候選成員。結(jié)合CAB家族的隱馬可夫模型（http：//pfam.sanger. ac.uk/search）PF00504，以及NCBI中的BLAST結(jié)果共同篩選出CAB家族成員。

1.2.2 茶樹CABs生物信息學(xué)分析

利用ExPASy網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/

protparam）對CAB基因家族成員的理化性質(zhì)進行分析，并利用WoLF PSORT在線網(wǎng)站（https：//wolfpsort.hgc.jp）預(yù)測成員的亞細胞定位；使用MEME軟件（https：//meme-suite.org/meme）在線預(yù)測CAB家族成員的保守基序，保守基序數(shù)量設(shè)置為10；通過NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）分析CAB蛋白的結(jié)構(gòu)域信息；從基因組中獲取CAB家族成員轉(zhuǎn)錄起始位點上游2 000 bp序列，使用PlantCARE網(wǎng)站預(yù)測其啟動子順式作用元件。然后，采用TBtools軟件對候選CABs的系統(tǒng)進化樹、保守基序、啟動子順式作用元件和基因結(jié)構(gòu)進行可視化；根據(jù)基因組注釋文件，用TBtools獲取CAB基因家族成員的染色體位置信息并繪制基因染色體定位圖。

從Phyutozome v13數(shù)據(jù)庫（https：// phyto-zome-next.jgi.doe.gov）中下載蓖麻、番木瓜、水稻和擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)，參照文獻[21-23]篩選出CAB基因家族成員。利用MEGA 7.0軟件中的Muscle完成茶樹CAB基因家族和不同物種CAB基因家族的氨基酸序列比對，并通過鄰接算法（自檢舉1 000次）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 茶樹CABs基因克隆及序列分析

采用RNA提取試劑盒（FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit，南京Vazyme公司）提取茶樹葉片的總RNA，使用BioSpec-nano（島津，日本）紫外分光光度計檢測RNA 濃度，利用1.2%凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，北京Tiangen公司）進行逆轉(zhuǎn)錄，將獲得的cDNA置于﹣20 ℃冰箱保存。

根據(jù)篩選出的候選CABs基因的開放閱讀框（ORF）設(shè)計上、下游引物進行擴增（表1）。PCR擴增體系為50 μL，包括2×Phanta Max Master Mix酶25 μL，ddH2O 19 μL，模板cDNA 2 μL，上、下游引物各2 μL，反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，48 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共進行40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物利用DNA純化回收試劑盒（TIANGEN，北京）回收目的片段，根據(jù)5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit（Vazyme，南京）說明書將目的片段與載體連接后，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

采用DNAMAN 6.0軟件對CABs測序結(jié)果進行多序列比對，并用MOTIFSCAN軟件對CABs蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進行分析。

1.2.4 茶樹CABs基因表達分析

使用NCBI在線軟件設(shè)計茶樹CAB1、CAB6和CAB7的qRT-PCR引物（表1），以GAPDH為內(nèi)參基因，參照Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，南京）試劑盒說明配制反應(yīng)體系。利用CFX Connect熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）進行qRT-PCR反應(yīng)，使用 方法分析3次生物重復(fù)的數(shù)據(jù)。

通過TPIA（http：//tpdb.shengxin.ren）數(shù)據(jù)庫獲取茶樹CAB1、CAB6和CAB7基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，以TPM（Transcripts per million）值評估CAB1、CAB6和CAB7基因在茶樹根、莖、葉、花和果實等組織以及在非生物脅迫下的表達量，利用Tbtools軟件繪制熱圖。

1.2.5 與葉色的相關(guān)性分析

葉片色澤測定：使用色差計（ltraScanVIS1195 HunterLab colorimeter）測定茶樹葉片的L、a和b值。L值表示明亮度，數(shù)值越大越鮮亮；a值表示紅綠色彩程度，正值偏紅，負值偏綠；b值表示黃藍色彩程度，正值偏黃，負值偏藍。使用色差計前用白色標準板校正，并以白色標準板為背景，隨機選取供試茶樹種質(zhì)的10個芽下第二葉進行3次重復(fù)測定，記錄和計算葉片的L、a和b數(shù)值。

葉綠素SPAD值測定：使用葉綠素計SPAD-502Plus測定茶樹資源的葉綠素含量，選取茶樹芽下的第三葉進行測定，避開葉脈，10次重復(fù)，取平均值。

采用SPSS軟件的Pearson評估CABs基因的表達量與茶樹葉片色澤和葉綠素含量的相關(guān)性。

1.2.6 亞細胞定位

根據(jù)CAB1的基因全長序列設(shè)計帶有酶切位點的引物，具體序列見表1。參照BioRun Seamless Cloning Kit（#RDA01）試劑盒（武漢伯遠公司）說明書將CAB1酶切后的DNA片段連接到pBWA（V）BS-ccdb-linker-gfp載體上，進行酶切鑒定和測序驗證。將構(gòu)建好35S：：CAB1：GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，30 ℃擴大培養(yǎng)2 d，將重懸菌液注射至生長狀況良好的煙草葉片下表皮，弱光培養(yǎng)2 d。取農(nóng)桿菌注射的煙草葉片，制作成玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CAB家族基因鑒定及理化性質(zhì)分析

通過BLATSP和HMMER共同檢索，在茶樹中篩選出25個CAB基因家族成員（表2）。CAB家族編碼167～337個氨基酸，多數(shù)家族成員編碼250～270個氨基酸；CAB家族蛋白相對分子質(zhì)量范圍為18.5～37.1 kDa；等電點為5～8.54，等電點大于7的成員只有TGY022607.t1、TGY067398.t1、TGY031151.t1、TGY043134.t1和TGY031987.t1，說明CAB家族成員大多為酸性蛋白；平均親水性為0.03208，除TGY091686.t1、TGY001087.t1、TGY050556.t1、TGY043134.t1、TGY014634.t1和TGY125121.t1這6個CAB成員是親水性蛋白外，其余成員都是疏水性蛋白；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)在16.35～49.16，大部分CAB成員都屬于穩(wěn)定性蛋白，只有TGY067398.t1、TGY031151.t1、TGY001087.t1、TGY125121.t1和TGY020806.t1不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定性蛋白；亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，只有TGY067398.t1和TGY031151.t1分布在細胞膜上，其余CAB家族成員都分布在葉綠體上。

2.2 茶樹CAB基因家族生物信息學(xué)分析

對25個茶樹CAB基因家族成員進行生物信息學(xué)分析（圖1），蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)果顯示（圖1B），CAB家族成員都具有捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白功能域，且蛋白保守結(jié)構(gòu)域包含的氨基酸序列長度占總長度的80%以上；基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)（圖1C），茶樹CAB基因家族成員的外顯子有1～2個，內(nèi)含子有1～6個；通過保守基序預(yù)測發(fā)現(xiàn)（圖1D），CAB家族成員的基序分布整體偏向于N端，其中基序motif2和motif8的保守性校強，在25個CAB成員中均有出現(xiàn)，其次是motif3、motif7和motif10，而motif4、motif6和motif9只分布在部分CAB成員。結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析（圖1A），發(fā)現(xiàn)聚為一類群的CAB成員都具有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序，說明不同CAB亞家族之間可能因為存在基因結(jié)構(gòu)和基序種類的差異而具有不同的生物學(xué)功能。進一步通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，茶樹CAB家族成員在染色體上分布不均勻。如圖2所示，25個CAB基因分布在12條染色體上，其中，有7個成員定位在第8號染色體，4個成員定位在第7號染色體，第2號、4號、5號和10號染色體上均有2個CAB基因分布，其余染色體上只有1個CAB基因。

利用PlantCARE對茶樹25個CAB基因上游2 000 bp序列的啟動子區(qū)進行順式作用元件分析，除去一般性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和功能未知元件外，獲得與植物生長發(fā)育、激素及逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件（圖3）。與植物生長發(fā)育相關(guān)的元件有6種，包括大量的光響應(yīng)元件（Box 4、G-Box和TCT-motif等）、晝夜節(jié)律調(diào)控元件（circadian）、分生組織表達（CAT-box）、參與胚乳表達元件（GCN4-motif）、參與葉肉細胞分化元件（HD-Zip 1）和細胞周期調(diào)節(jié)元件（MSA-like）；激素響應(yīng)元件有5種，包括赤霉素（TATC-box、P-box和gibberellin-responsive element，GARE-motif）、生長素（TGA-element和auxin responsiveness，AuxRR-core）、水楊酸（TCA-element）、脫落酸（Abscisic acid responsive element，ABRE）和茉莉酸甲酯（CGTCA-motif）；逆境脅迫響應(yīng)元件有4種，包括低溫（Low temperature responsiveness，LTR）、厭氧誘導(dǎo)（Antioxident response element，ARE）、干旱（MYB binding site involved in drought inducibility，MBS）、防御和脅迫響應(yīng)（TC-rich repeats）。其中，光響應(yīng)元件（Box 4、G-Box和TCT-motif等）數(shù)量最多，普遍存在于每一個CAB基因的啟動子區(qū)，表明茶樹CAB基因主要受光信號調(diào)控，且光響應(yīng)元件可能在CABs基因調(diào)控茶樹葉色方面發(fā)揮著重要作用。脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件的數(shù)量也較多，表明茶樹CAB基因也會受脫落酸和茉莉酸信號調(diào)控。此外，赤霉素響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件和干旱響應(yīng)元件也在大部分CAB基因啟動子中被鑒定到，說明這些元件在茶樹應(yīng)對逆境脅迫方面可能具有重要作用。

為了解茶樹CAB基因家族的分類和進化關(guān)系，利用MEGA 7.0軟件對茶樹、水稻、擬南芥、蓖麻、番木瓜中的CAB家族進行系統(tǒng)發(fā)育分析。如圖4所示，CAB基因家族聚為14個分枝，分別對應(yīng)Lhcb的8個亞家族和Lhca的6個亞家族。茶樹CAB家族的25個成員分布在13個亞家族中，只有Lhcb8亞家族未聚類到茶樹CAB成員。其中，Lhcb1亞家族聚類到的CAB成員數(shù)目最多，茶樹有7個，擬南芥有5個，水稻、蓖麻和番木瓜均有3個。其次是Lhcb2亞家族，包含3個茶樹CAB成員。Lhcb4、Lhcb6、Lhcb7、Lhca2和Lhca4亞家族均包含2個茶樹CAB成員，其余亞家族只含1個CAB成員。此外，茶樹CAB基因家族與蓖麻和番木瓜的CAB基因家族親緣關(guān)系較近，暗示茶樹的CABs可能具有與蓖麻、番木瓜相似的功能。在過往研究中，植物L(fēng)hcb1是CAB家族中研究最廣泛和最深入的亞家族，并且已有研究表明Lhcb1與植物葉色調(diào)控密切相關(guān)，因此，本研究選取Lhcb1亞族的7個CAB基因進行后續(xù)試驗，并依據(jù)基因ID號分別命名為CAB1、CAB2、CAB3、CAB4、CAB5、CAB6、CAB7。

2.3 茶樹CABs基因克隆及序列分析

以鐵觀音基因組中獲得的CAB基因序列為參考，福鼎大白茶新梢葉片的cDNA為模板，設(shè)計全長引物，進行CABs基因克隆。測序結(jié)果如圖5所示，5個CAB基因（CAB1、CAB2、CAB3、CAB4和CAB5）的開放閱讀框序列及其編碼的氨基酸序列高度一致，為同一基因。

進一步對CAB1、CAB6和CAB7的氨基酸序列進行序列相似度及保守結(jié)構(gòu)域分析（圖6），結(jié)果表明，3個基因編碼的氨基酸序列相似度為97.36%；MOTIFSCAN分析結(jié)果顯示，在第64～232位包含一個捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白功能域（Chlorophyll a/b binding domain，CB）；第23～26位有酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點（Casein kinase Ⅱ phosphorylation site，CK2）；第108～113、122～127、150～155、169～174和178～183位為N-肉豆蔻酰位點（N-myristoylation site）；第34～36和234～236位為蛋白激酶C磷酸化位點（Protein kinase C phosphorylation site，Pc）。CAB1、CAB6和CAB7的多個結(jié)構(gòu)域高度保守，說明三者行使的功能存在相似性。

2.4 茶樹CABs表達模式分析

從TPIA數(shù)據(jù)庫中下載CAB1、CAB6和CAB7茶樹不同組織以及不同逆境脅迫下的表達量數(shù)據(jù)，對其表達模式進行分析（圖7）。結(jié)果顯示，CABs在茶樹芽、葉和果實中的表達量較高，莖、根和花中的表達量較低。在葉片不同的生長發(fā)育階段，CAB1和CAB6在嫩葉中的表達量最高，CAB7則在老葉中表達量最高，表明CABs可能在茶樹葉片生長發(fā)育過程中發(fā)揮不同的作用。在4種非生物脅迫處理下CABs的表達水平呈現(xiàn)了相似的變化趨勢，在冷處理下，CABs表達水平均受抑制，在恢復(fù)常溫后表達上調(diào)；在茉莉酸甲酯（MeJA）脅迫中，處理12 h時CABs表達顯著上調(diào)，而后隨著脅迫時間增加表達水平逐漸下降；在鹽處理下，CABs均下調(diào)表達，其中CAB6在處理48 h時表達水平呈先上升后下降趨勢，CAB7則在處理72 h時表達量上升；在干旱處理下，CAB1和CAB7的表達水平均隨處理時間增加而下降，而CAB6的表達水平在處理48 h時，有明顯的上調(diào)。

為驗證茶樹CABs基因在不同黃、綠茶樹品種（系）之間的表達差異，本研究使用qRT-PCR技術(shù)，測定了不同葉色茶樹葉片中的CABs基因表達量。如圖8所示，CAB1在綠葉茶樹0309E中的表達量最高，在黃化茶樹白雞冠中的表達量最低，差異達3倍；而CAB6在綠葉茶樹黃棪的表達量最高，是白雞冠表達量的5.6倍；CAB7則在福鼎大白茶中的表達量

最高，在黃化茶樹0317最低。整體來看，CAB1、CAB6和CAB7在黃、綠葉中的表達水平都具有顯著性差異，與綠色葉片相比，3個基因都在黃化葉片中顯著低表達。

2.5 與葉色的相關(guān)性分析

利用葉片色差計和葉綠素儀對15個黃、綠葉茶樹品種（系）的葉片色澤性狀進行分析。葉片色差值結(jié)果如表3所示，與葉色表型一致，黃葉的明亮度L值均高于綠葉的明亮度，其中，以黃化茶樹0309C的明亮度最高；a值反映葉片綠色程度，黃葉的a值普遍低于綠葉a值；b值反映葉片黃色程度，黃葉b值普遍高于綠葉b值，其中0309C的b值最高。茶樹葉片的色澤與葉片的葉綠素含量是密切相關(guān)的，葉綠素SPAD值結(jié)果顯示（圖9），福6號的SPAD值最高，其次是0309E和0306A，黃化茶樹0306C、0309C和0317L的SPAD值最低。整體來看，綠葉的SPAD值均比黃葉的SPAD值高，與葉片色差參數(shù)反映結(jié)果一致。

進一步利用Pearson評估茶樹CABs基因的表達量與茶樹葉色的相關(guān)性。結(jié)果如表4所示，CAB1、CAB6和CAB7基因表達量與茶樹葉片葉綠素含量（SPAD值）均呈極顯著正相關(guān)，CAB1基因的相關(guān)性系數(shù)最高（0.913**），其次是CAB7，CAB6的相關(guān)性最低。此外，CAB1、CAB6和CAB7表達量與葉片色差值的a、b和L值也都呈極顯著相關(guān)，其中與a值呈正相關(guān)，相關(guān)性表現(xiàn)為CAB1gt; CAB6gt;CAB7；與b值呈負相關(guān)，相關(guān)性表現(xiàn)為CAB1gt;CAB7gt;CAB6；與L值呈負相關(guān)，相關(guān)性表現(xiàn)為CAB7gt; CAB1gt;CAB6。綜合以上結(jié)果，發(fā)現(xiàn)CAB1基因與茶樹葉色性狀的相關(guān)性最為顯著，后續(xù)可作為關(guān)鍵基因進行深入探究。

2.6 茶樹CAB1克隆及亞細胞定位

為進一步探究CAB1基因在不同葉色茶樹品種中是否存在差異，本研究分別以黃棪、白葉1號、白雞冠及其后代黃葉的0306E和綠葉的0306A茶樹cDNA為模板，通過PCR擴增，再次克隆了CAB1基因。經(jīng)測序比對可知（圖10），CAB1在不同黃、綠茶樹品種中的氨基酸序列一致性較高，序列相似度達到99.69%，說明CAB1在不同茶樹品種中高度保守。

為明確CAB1的亞細胞定位模式，構(gòu)建了帶有35 S啟動子及GFP標簽的過表達載體35S：：CAB1：GFP，通過質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，再分別轉(zhuǎn)化至煙草葉片進行瞬時表達，并使用激光共聚焦顯微鏡觀察表達情況。結(jié)果如圖11所示，空載體35S：GFP（對照）的綠色熒光信號分布在煙草的細胞質(zhì)、細胞核和質(zhì)膜中，葉綠體則呈自發(fā)紅色熒光，綠色熒光與紅色熒光無法重疊；而在35S：：CAB1：GFP的綠色熒光能與葉綠體自發(fā)熒光信號重疊，呈現(xiàn)出黃色熒光（圖中白色箭頭標注），結(jié)果與WoLF PSORT的預(yù)測一致，CAB1定位于葉綠體，且在細胞核和細胞膜上也均有表達。

3 討論

目前，已經(jīng)從水稻[21]、蓖麻[22]、擬南芥[24]、木薯[25]和蘋果[26]等植物中分別鑒定出21、17、20、16和27個CAB基因家族成員。本研究通過對鐵觀音的全基因組進行分析，從中篩選出了25個茶樹CAB基因家族成員，其中Lhcb亞家族成員有17個，Lhca亞家族成員有8個，除了Lhcb8亞家族未聚類到茶樹CAB成員外，其他成員在Lhcb1～Lhcb7和Lhca1～Lhcb6亞族中均有分布，這可能是因為Lhcb8是由Lhcb4進化而來，因此Lhcb8亞族與Lhcb4亞族屬于同源，需要進行蛋白質(zhì)水平鑒別才能區(qū)分其是否存在[24，27]。與擬南芥、番木瓜、蓖麻和水稻的CAB家族成員相比，茶樹的Lhcb1和Lhcb3亞家族的成員數(shù)目最多，這種不同物種的CAB家族成員數(shù)量差異，與CAB基因進化過程中不同亞基因組內(nèi)所發(fā)生基因復(fù)制事件有關(guān)，從而導(dǎo)致同源基因?qū)Τ霈F(xiàn)拷貝數(shù)的擴增[28]。Ye等[29]利用舒茶早和龍井43茶樹數(shù)據(jù)庫篩選出了20個Lhcb亞家族成員，比本研究多2個CAB家族成員，數(shù)量差異主要出現(xiàn)在Lhcb1和Lhcb3亞族中，該研究鑒定到Lhcb1亞族有4個CAB成員，Lhcb3有7個CAB成員。Luo等[9]對兩個獼猴桃品種（Actinidia chinensis和A. eriantha）的CAB基因家族進行研究，同樣發(fā)現(xiàn)兩個品種的CAB家族成員數(shù)存在差異。CAB基因在鐵觀音茶樹基因組上分布較為廣泛，遍布12條染色體，且在第7、8號染色體上分布數(shù)目較多，這與CAB家族在舒茶早和龍井43基因組染色體上分布情況一致，表明第7、8號染色體上存在CAB基因簇且這些基因可能為連鎖遺傳。

CAB蛋白是植物葉綠體內(nèi)含量最為豐富的一類膜蛋白，約占總?cè)~綠體膜蛋白的1/3，其結(jié)合了類囊體膜上50%的色素[30]。因此，CAB基因?qū)儆谂c葉綠體發(fā)育密切相關(guān)的功能基因，在植物光合作用中發(fā)揮著重要作用。本研究對茶樹CAB基因家族進行了亞細胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示大部分CAB家族成員都定位于葉綠體上，且茶樹CAB基因家族成員的啟動子區(qū)域都包含有大量與光響應(yīng)相關(guān)的作用元件，如Box II、I-box、Box 4、GT1-box和G-box等，說明CAB基因在茶樹光合作用中的重要性以及在調(diào)控葉色方面具有重要作用。在眾多光響應(yīng)元件中，Box 4和G-box元件的數(shù)量較多。研究表明，G-box元件的核心序列ACGT在CAB基因中高度保守，能與HY5、GBF2和PIF3等轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合，調(diào)控CAB基因的表達[31]。水稻的mEmBP-1a轉(zhuǎn)錄因子也能直接結(jié)合到G-box結(jié)構(gòu)域上促進CAB基因的表達，進而提高水稻光合作用和產(chǎn)量[32]。Liu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹CsHY5能直接與CsLhcb的G-box（位于ATG上游﹣750 bp）結(jié)合，在綠葉中促進Lhcb表達，在黃葉中則抑制Lhcb表達，從而影響黃魁的季節(jié)性返綠。還有MYB家族的CsRVE1轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合到CsLhcb的G-box區(qū)域，在黃魁返綠過程中，CsRVE1通過過表達能激活CsLhcb，促進葉綠素的積累[34]。可見，G-box是CAB基因發(fā)揮作用的重要元件，本研究篩選的CABs基因也可能通過G-box元件受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，參與調(diào)控茶樹葉色變異。此外，茶樹CAB基因啟動子區(qū)還包含響應(yīng)植物激素、干旱和冷害等非生物脅迫的順式作用元件，說明CAB基因也可能在茶樹抗逆過程中發(fā)揮重要作用。Li等[35]對茶樹Lhcb2和Lhcb5亞家族基因進行克隆，發(fā)現(xiàn)各CAB成員在脫落酸、茉莉酸甲酯、機械損傷和冷脅迫等處理中具有不同的表達調(diào)控模式，Lhcb5亞族成員普遍受抑制。還有研究同樣通過克隆茶樹CAB基因，發(fā)現(xiàn)其參與茶樹低溫和干旱脅迫過程[36-37]。

Lhcb1蛋白是目前結(jié)構(gòu)和功能研究最為深入的色素結(jié)合蛋白，其成員數(shù)最多，含量最為豐富，可以結(jié)合12個葉綠素（包含7個葉綠素a，5個葉綠素b）和2個葉黃素分子[30]。已有大量研究表明，Lhcb1亞家族成員的表達水平能直接反映葉綠素的含量及葉綠體的功能狀態(tài)，如橡膠樹HbCAB1在衰老期葉片中的表達量顯著降低，與葉片葉綠素含量的減少呈正相關(guān)[38]；紫薇無葉綠素顯型突變體葉片的黃化也與CAB1基因表達量降低有關(guān)[39]；敲除擬南芥編碼Lhcb1蛋白的AtLhcb1.1～1.5 5個基因，其他Lhcb成員雖然會積累，但不能完全取代Lhcb1的作用以及挽救葉綠素的損失，最終導(dǎo)致植株葉片黃化和生長延遲[40]。根據(jù)前人研究結(jié)果，推測茶樹Lhcb1亞族基因也在調(diào)控葉色方面具有重要作用，因此本研究選取Lhcb1亞家族的7個CABs基因進一步深入研究。首先，從福鼎大白茶中克隆了Lhcb1亞家族的7個CAB基因，通過核酸序列比對發(fā)現(xiàn)有5個CAB基因的核酸序列完全一致，其他亞族成員是否存在同樣情況有待驗證。然后，從中篩選出CAB1、CAB6和CAB7基因進行氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)這3個基因氨基酸序列一致性較高。最后，通過茶樹不同組織部位的基因表達特性分析發(fā)現(xiàn)，這3個基因在茶樹芽和葉中均大量表達，在莖、根和花中的表達量則較低，與馬尾松[41]和苧麻[42]的CAB基因表達模式相似。此外，CAB1、CAB6和CAB7基因可能在抵御逆境脅迫過程中起重要作用，3個基因能對激素、干旱、低溫和鹽脅迫有不同程度的應(yīng)答，并在同一脅迫下三者的表達水平呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，推測CAB1、CAB6和CAB7基因可能具有相似的功能。

為明確CAB1、CAB6和CAB7基因在不同葉色茶樹中的表達差異，分析了3個基因在9個黃化茶樹材料和5個綠葉茶樹材料中的表達水平，發(fā)現(xiàn)3個基因在黃葉中的表達量均顯著低于在綠葉中的表達量，表達量差異達到3～9.6倍。隨后測定了黃、綠茶樹品種（系）的葉色相關(guān)參數(shù)和葉綠素SPAD值，結(jié)果與葉色表型一致，黃化茶樹的葉色參數(shù)a、b、L值和葉綠素SPAD值都與綠葉茶樹有顯著性差異。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CAB1、CAB6和CAB7基因表達量與葉色參數(shù)L、a、b和葉綠素SPAD值都呈極顯著相關(guān)，其中以CAB1的相關(guān)性最為顯著，說明CAB1基因的表達與茶樹葉色性狀密切相關(guān)。

為了探究CAB1基因編碼區(qū)序列在黃化葉與綠色葉片中是否存在差異，進一步以2種綠葉茶樹和3種黃化茶樹為材料，再次克隆了CAB1基因，發(fā)現(xiàn)CAB1基因在黃、綠茶樹品種中只存在個別單核苷酸位點差異，翻譯后的氨基酸序列呈現(xiàn)高度一致。這與Ye等[29]以2個綠葉茶樹和5個溫度敏感型白化茶樹為材料克隆的Lhcb1亞族基因的結(jié)果相同，說明Lhcb1亞族的CAB基因成員在不同葉色茶樹中的氨基酸序列高度保守。進一步通過煙草亞細胞定位分析，證實了CAB1在葉綠體中的分布。茶樹葉色的變異往往涉及葉綠體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，特別是體現(xiàn)在葉綠體的超微結(jié)構(gòu)上。前人通過對茶樹黃化葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，與綠色正常葉色相比，黃化葉片中葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為基粒片層堆疊減少，類囊體結(jié)構(gòu)被破壞，甚至消失[43-45]。結(jié)合本研究的試驗數(shù)據(jù)及CAB1的亞細胞定位結(jié)果，推測可能是由于黃化葉片中CAB1表達受抑制，使CAB1蛋白無法與葉綠素結(jié)合，難以形成穩(wěn)定的類囊體膜結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致葉色黃化變異。

本研究首次對鐵觀音基因組中的CAB基因家族進行鑒定和分析，豐富了茶樹CAB家族基因庫資源。在25個CAB家族成員的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了大量的光響應(yīng)元件以及激素響應(yīng)、逆境脅迫相關(guān)的作用元件，暗示CAB基因家族在茶樹的光合作用和抗逆方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)CAB1、CAB6和CAB7表達量與葉色參數(shù)a、b、L值以及葉綠素SPAD值均呈極顯著相關(guān)（Plt;0.01），其中以CAB1相關(guān)性最為顯著。煙草亞細胞定位結(jié)果顯示，CAB1在細胞膜、細胞核和葉綠體上均有分布。以上結(jié)果表明，CAB1與茶樹葉色黃化變異緊密相關(guān)，后續(xù)可作為關(guān)鍵基因進行深入探究。

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