亮菌多糖體外模擬消化-酵解特性及其益生作用探究

張煜琛,杜敏如,趙洪玥,楊舒郁,連玲丹,王杰

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院 食品功能微生物實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510642)

多糖作為天然高分子聚合物在自然界中廣泛存在,其活性功能逐漸被證實(shí),包括但不限于抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等。研究表明,非淀粉類天然多糖并不易被哺乳動物唾液降解,在小鼠實(shí)驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)僅有少數(shù)種類多糖會在胃腸消化液作用下降解,且程度較低[1]。深入研究發(fā)現(xiàn),幾乎所有多糖在抵達(dá)大腸時(shí),可被共生細(xì)菌發(fā)酵利用,并產(chǎn)生大量小分子物質(zhì),被宿主吸收影響健康。LAGAMM等[2]研究證實(shí),短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)在人體內(nèi)發(fā)揮重要作用,不僅是腸道上皮細(xì)胞生長的物質(zhì)能量,還可以維持電解質(zhì)平衡,同時(shí)還具有抗炎、預(yù)防肥胖等作用,這也為臨床治療提供重要解決思路。

亮菌(Armillariellatabescens)作為傳統(tǒng)食藥用真菌同樣具有極高的活性利用價(jià)值,如其抗腫瘤生物功能被多位研究人員證實(shí)[3-6]。故探究高活性亮菌多糖在消化進(jìn)程中的活性變化及對機(jī)體潛在的作用方式尤為重要。體外模擬消化及酵解具有操作便捷快速的特點(diǎn),已成為近年來輔助研判食品或藥品體內(nèi)消化吸收過程的常用手段。

因此,本研究將探究在體外模擬消化及酵解過程中,亮菌多糖的變化軌跡以及生物活性改變情況,為探究亮菌多糖在體內(nèi)可能發(fā)生的活性改變進(jìn)行初步驗(yàn)證,同時(shí)為亮菌多糖作為益生元類產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亮菌,中國林業(yè)微生物保藏管理中心(CFCC 872604);雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌,均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品功能微生物團(tuán)隊(duì)保藏。大孔樹脂25A-210,西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶、乙酸、丙酸、丁酸,上海麥克林生化科技有限公司;ABTS試劑盒,索萊寶生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)和過氧化物酶(peroxidase, POD)試劑盒,南京建成生物工程研究所。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;UV-1100紫外光分光光度計(jì),上海美浦達(dá)儀器有限公司;Agilent 7890A/5975c型氣-質(zhì)聯(lián)用分析儀,安捷倫(科技)中國有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亮菌胞外多糖(Armillariellatabescensextracellular polysaccharide, ATEP)提取與純化

PDA培養(yǎng)基180 r/min,25 ℃發(fā)酵亮菌12 d。濃縮發(fā)酵液后1∶4(體積比)混合95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇。4 000 r/min離心20 min,收集沉淀。大孔樹脂浸潤活化[7],沖洗ATEP,收集洗液。Sevag法[8]除蛋白,移出上層溶液-80 ℃真空冷凍干燥保存。多糖得率為ATEP醇沉質(zhì)量與發(fā)酵上清液的比值。

1.3.2 ATEP理化分析

1.3.2.1 分子質(zhì)量

樣品和標(biāo)準(zhǔn)品并配制成5 mg/mL溶液,12 000 r/min離心10 min,0.22 μm濾膜過濾后進(jìn)行高效凝膠滲透色譜(high-performance gel permeation chromatography,HPGPC)分析。色譜條件:BRT105-104-102凝膠柱(8 mm×300 mm);流動相0.05 mol/L NaCl溶液;流速0.6 mL/min,柱溫40 ℃;進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2.2 單糖組成

5 mg樣品加入2 mL 3 mol/L三氟乙酸溶液,120 ℃水解3 h。吸取酸液,N2吹干,加入5 mL H2O混勻,吸50 μL加入950 μL水,12 000 r/min,5 min。上清液進(jìn)行離子色譜(ion chromatography,IC)分析。

色譜條件:Dionex CarbopacTMPA20 (3 mm×150 mm);流動相:A:H2O;B:15 mmol/L NaOHC溶液:15 mmol/L NaOH和100 mmol/L NaOAC溶液;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;柱溫30 ℃;電化學(xué)檢測器。

1.3.2.3 ATEP主要組成成分

參照YANG等[4]苯酚硫酸法檢測總糖含量,KASIRG等[9]二硝基水楊酸法檢測還原糖,SAEED等[10]福林酚法檢測總酚,ZAMEER等[11]Na2NO2-Al(NO3)3-NaOH比色法檢測類黃酮,分別測定490、540、510、760 nm處吸光值,繪制標(biāo)曲(圖1),配制100 mg/mL ATEP檢測后代入方程計(jì)算,所得含量與多糖溶液濃度之比即為質(zhì)量百分比。

a-總糖;b-還原糖;c-總酚;d-總黃酮

1.3.3 體外抗氧化活力

SOD、CAT、POD及ABTS按照試劑盒說明書操作。DPPH參照[12]方法檢測。配制濃度梯度維生素C標(biāo)準(zhǔn)液,反應(yīng)后在517 nm處測定吸光度,計(jì)算如公式(1)所示。

(1)

式中:A1,實(shí)驗(yàn)組測得的吸光值;A0,對照組測得的吸光值;A2,空白組測得的吸光值,同時(shí)維生素C作為陽性對照。

總還原力參照CHEN等[13]的方法。樣品中加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))K3[Fe(CN)6],10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸溶液,等體積H2O和0.1% FeCl3混勻,振蕩后靜置,700 nm處測吸光度,實(shí)驗(yàn)組與對照組差值即為還原力。

1.3.4 “唾-胃-腸”體外模擬消化[14]

經(jīng)口消化:收集志愿者唾液(9男,16女;3個(gè)月內(nèi)未服用任何藥物與酒精飲料),4 ℃離心15 min,上清液與10 mL ATEP等量混合,37 ℃水浴20 min后滅活;其余消化產(chǎn)物調(diào)節(jié)pH值為1.3±0.1,備用。經(jīng)胃消化:將模擬經(jīng)口消化產(chǎn)物1∶1(體積比)混合模擬胃液,37 ℃水浴3 h后滅活。其余消化產(chǎn)物加入NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.8±0.1,備用。經(jīng)腸消化:將模擬經(jīng)胃消化產(chǎn)物3∶1(體積比)混合模擬人工腸液,37 ℃水浴4 h后滅活待測。

1.3.5 益生菌活化及生長曲線測定

參照ZHANG等[15]方法,受試菌種接種于添加有10%(體積分?jǐn)?shù))1 mg/mL ATEP溶液的MRS培養(yǎng)基,37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)0、2、6、12、24、48 h測定OD600與pH值,繪制生長曲線。

1.3.6 體外模擬酵解

收集4名志愿者(2男,2女,3個(gè)月內(nèi)未服用任何藥物)新鮮糞便,等量混勻,厭氧條件1∶10(體積比)加入無菌生理鹽水(含 0.5 g/L的L-鹽酸半胱氨酸溶液),0.8 μm過濾雜質(zhì)。10%比例接種至酵解培養(yǎng)基[16],終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的ATEP溶液,培養(yǎng)24 h和48 h后,立即冷凍離心(10 000×g,10 min),上清液用于分析pH值與SCFAs含量。

1.3.7 SCFAs含量[17]

取酵解產(chǎn)物加入等量乙酸乙酯,渦旋2 min,離心15 min,取600 μL上層液上機(jī)。

GC-MS條件:Agilent DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mmID×0.25 μm),初始溫度90 ℃,10 ℃/min上升到 120 ℃,5 ℃/min上升到150 ℃,25 ℃/min上升到250 ℃保持2 min,He載氣,流速1.0 mL/min,分流比10∶1。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3),計(jì)算ATEP中含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)與檢測重復(fù)3次。SPSS 25.0進(jìn)行比較平均值單因素ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATEP得率與理化性質(zhì)

ATEP胞外多糖含量為724.8 mg/100 mL,提取后ATEP得率為9.03%,其中總糖占43.52%質(zhì)量分?jǐn)?shù),還原糖為0.76%,總酚為0.23%,總黃酮為0.96%。如圖2所示ATEP由兩組分組成,分子質(zhì)量分別為27.0 kDa和8.9 kDa。ATEP的單糖分析顯示(表1),由巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖構(gòu)成,摩爾比為0.036∶0.008∶0.315∶0.522∶0.019∶0.099。

表1 ATEP單糖組成分析結(jié)果Table 1 Monosaccharide compositions of ATEP

圖2 ATEP分子質(zhì)量HPGPC法分析結(jié)果Fig.2 Analysis results of ATEP molecular weight by HPGPC

2.2 ATEP模擬消化過程營養(yǎng)成分變化規(guī)律

如圖3所示,ATEP的總糖、還原糖、總酚、總黃酮在依次經(jīng)歷模擬經(jīng)口、經(jīng)胃、經(jīng)腸消化后,變化量不同。其中總糖和還原糖消化前、消化中、消化后含量未發(fā)生顯著改變(P>0.05)。推測多糖分子無法被人體自泌消化酶降解,經(jīng)口食入至離開小腸時(shí)幾乎未變化,糖苷鍵未發(fā)生明顯斷裂[18]。而總酚含量模擬經(jīng)胃后得到顯著提高(P<0.05)。總黃酮僅在模擬經(jīng)腸后含量顯著升高(P<0.05),可能由于胃液與腸液可少量作用ATEP分子;另外,也可能與ATEP所含雜質(zhì)有關(guān),雜質(zhì)被胃腸消化系統(tǒng)改造,并提升了產(chǎn)物總酚與總黃酮量。

a-總糖;b-還原糖;c-總酚;d-總黃酮

2.3 ATEP消化產(chǎn)物抗氧化力的變化

由圖4可知,在經(jīng)歷了模擬“唾-胃-腸”作用后,產(chǎn)物抗氧化力出現(xiàn)增強(qiáng)效果。與ATEP對照相比,模擬消化后產(chǎn)物,ABTS和DPPH清除率,抗氧化酶活力顯著升高(P<0.05),總還原力消化后極顯著增強(qiáng)(P<0.001)。

2.4 體外酵解過程中產(chǎn)物變化規(guī)律

體外模擬酵解反應(yīng)是補(bǔ)充人體內(nèi)消化道大腸段消化過程,該路徑為宿主腸道細(xì)菌的主要聚居地,隨消化向下行徑,微生物數(shù)量和種類的豐富程度陡增。根據(jù)圖5可知,在48 h的模擬酵解過程中,ATEP作為重要碳源,隨著時(shí)間的延長被微生物持續(xù)酵解,碳水化合物消耗量不斷上升(圖5-a)。在此發(fā)酵過程中,以看到還原糖含量在前12 h表現(xiàn)出持續(xù)上升積累,但隨后急速下降,分析在此過程中,多糖糖苷鍵被破壞,降解為小分子糖類,如還原糖;隨后,還原糖又會成為下游細(xì)菌的能量來源代謝并轉(zhuǎn)換成其他小分子物質(zhì),如短鏈脂肪酸等。與此同時(shí),酵解的進(jìn)行使微環(huán)境酸度上升,酵解前pH 8.2,酵解中pH不斷下降至終止時(shí)為5.1。

a-碳水化合物消耗量;b-還原糖含量;c-pH

2.5 ATEP促進(jìn)益生菌增殖

如圖6-a～圖6-d所示,ATEP表現(xiàn)出對雙歧桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌及大腸桿菌均有促生長促增殖的作用。添加ATEP后,4種菌在培養(yǎng)48 h時(shí)密度均大于對照組。其中,雙歧桿菌和植物乳桿菌在培養(yǎng)12 h后,這種促生長作用表現(xiàn)出來,而干酪乳桿菌和大腸桿菌則在培養(yǎng)6 h就有體現(xiàn)。培養(yǎng)環(huán)境pH的變化不斷下降,從8.1下降至5.6(圖6-e～圖6-h)。相同培養(yǎng)時(shí)長下,ATEP對pH影響輕微。

a-雙歧桿菌OD值;b-植物乳桿菌OD值;c-干酪乳桿菌OD值;d-大腸桿菌OD值;e-雙歧桿菌pH;f-植物乳桿菌pH;g-干酪乳桿菌pH;h-大腸桿菌pH

2.6 ATEP對SCFAs發(fā)酵產(chǎn)量的影響

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線回歸方程見表2。如圖7所示,ATEP對SCFAs促進(jìn)影響極顯著(乙酸P<0.001;丙酸、丁酸P<0.005)。與對照相比,酵解結(jié)束后乙酸含量增長13倍,增幅1 200%,丙酸和丁酸含量增加2倍。

表2 三種SCFA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of three SCFAs reference materials

圖7 經(jīng)模擬酵解后發(fā)酵物SCFAs產(chǎn)量Fig.7 Production of SCFAs after simulated fermentation

3 討論

天然多糖根據(jù)其單糖、糖苷鍵類型的多樣而表現(xiàn)出不同活性。靈芝中提取的D-葡聚糖具有較高抗氧化力[19],杏鮑菇多糖主要由葡萄糖組成,比例可達(dá)78.32%,因而表現(xiàn)出較好的胰島素耐受力[20]。體外模擬消化基于減少傷害實(shí)驗(yàn)動物,可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn),近年來被研究者們廣泛使用。梁美香等[21]對柑橘果膠進(jìn)行體外模擬消化后,其產(chǎn)物抗氧化活性提高,對4種益生菌具有較好的促進(jìn)增殖作用。本文中ATEP經(jīng)“唾-胃-腸”模擬消化后并沒有顯著提高產(chǎn)物抗氧化活性,與YUAN等[22]對馬尾藻多糖處理后自由基清除力降低類似,但相同處理后,馬齒莧抗氧化活性得到增強(qiáng)[23]。

在體內(nèi)消化系統(tǒng)中,α多糖(如淀粉)可被自身消化酶水解,同時(shí)受膽鹽等化合物影響,α多糖理化性質(zhì)容易被改變,進(jìn)而被人體利用[24]。但天然多糖,特別是具有藥用價(jià)值的活性多糖,其支鏈的β多糖并不能直接利用[25],而是在細(xì)菌的作用下逐漸水解為小分子物質(zhì)方可被吸收,如短鏈脂肪酸。本研究中ATEP經(jīng)模擬酵解可增加SCFAs,特別是乙酸含量,且對雙歧桿菌、干酪乳桿菌具有促進(jìn)增殖的益生作用。XIE等[26]認(rèn)為,體外發(fā)酵可表征人類腸道微環(huán)境代謝各類食物的能力,并據(jù)此設(shè)計(jì)和制造有針對性的功能食品。

4 結(jié)論

本研究中ATEP總糖質(zhì)量占比43.52%,在抗氧化方面,自由基清除率與抗氧化酶系均有較強(qiáng)作用。體外模擬消化顯示,人體自有消化酶幾乎不能對ATEP進(jìn)行降解,但人體寄生細(xì)菌卻對ATEP表現(xiàn)出較高喜好與利用率。ATEP在腸道微生物作用下發(fā)生不同程度水解,一方面為微生物生長提供能量物質(zhì)來源,一方面經(jīng)其代謝可轉(zhuǎn)換為對人體有用的小分子短鏈脂肪酸。本試驗(yàn)選用的4種益生菌在無氧條件下的生長同樣表現(xiàn)出對ATEP的依賴。這些說明ATEP作為天然來源真菌多糖,通過腸道微生物利用,產(chǎn)生了多種代謝產(chǎn)物,并對人類健康有重要意義。