年齡相關性黃斑變性的研究進展

魏丹丹，宋宇涵，王 淇，宿樹蘭，朱 悅，段金廒

南京中醫藥大學 中藥資源產業化與方劑創新藥物國家地方聯合工程研究中心/江蘇省中藥資源產業化過程協同創新中心/江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，江蘇 南京 210023

目前中國人口結構已進入老年型,深入研究衰老及老年相關疾病、科學應對人口老齡化是新時代的國家重大需求。在眾多老年相關疾病中,年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,AMD)嚴重威脅著老年人群的視力健康。

1 AMD簡介

AMD為視網膜黃斑區域的退行性疾病,引起進行性中央視力喪失,是65歲及以上老年人視力喪失甚至失明的主要原因。流行病學研究表明,中國發達城市AMD發病率高達15.5%,預計2040年全球患者將達到2.88億人。臨床上以玻璃疣大小將AMD分為早期、中期、晚期3個階段,晚期AMD導致嚴重的永久性中央視力喪失,晚期AMD包括干性或濕性兩種類型。干性AMD目前尚無有效的治療手段,濕性AMD主流療法為玻璃體腔注射抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體。

2 AMD發生、發展的新近研究進展

AMD病變主要包括視網膜色素上皮細胞(recular pigment endothelial, RPE)以及感光層的喪失、RPE下方脂質和蛋白質積累或Bruch膜中蛋白質沉積、絨毛膜毛細血管脫落、脈絡膜新生血管和盤狀瘢痕以及小膠質細胞、巨噬細胞募集以及補體激活引起的炎性反應。迄今為止AMD機制尚不完全清楚,但視網膜在老化和壓力刺激下導致的一系列內穩態失衡在其發生、發展中起重要作用[1]。

2.1 細胞衰老-更新失衡

視網膜細胞更新和修復的能力差,使其罹患退行性疾病風險大大增加。RPE具有維持視網膜內穩態功能,隨著年齡增長細胞反復復制導致端粒變短,RPE等體細胞分裂能力下降引發復制性細胞衰老。RPE細胞衰老是AMD的關鍵環節,表現為衰老相關-β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal)上調、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)增多等。衰老的RPE細胞溶酶體消化能力下降導致細胞內蛋白聚集體和脂褐素等代謝廢物堆積,脂褐素的積累導致早期AMD的發生,脂褐素在光暴露下產生自由基導致RPE細胞溶酶體功能障礙,吞噬功能進一步受損促進AMD發展[2]。衰老RPE細胞的DNA損傷促進細胞內脂褐素的堆積,SA-β-gal可以抑制線粒體分裂進一步促進脂褐素生成。

紫外線輻射、香煙暴露、氧化應激等可作為應激源,作用于細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)抑制劑以及p53下游信號,阻止下游低磷酸化的視網膜母細胞瘤基因(retinoblastomal, Rb)蛋白磷酸化,抑制S期DNA復制減慢細胞周期,觸發壓力引起RPE等細胞早衰。貝伐單抗顯著降低CDK2、CDK4和CDK6以及cyclin D和E的表達,阻斷RPE細胞的G1/S進展[3]。多柔比星等藥物暴露也能夠導致RPE細胞衰老,與胚胎干細胞共孵育可通過TGF-β和PI3K信號通路逆轉早衰的RPE細胞[4-5]。衰老的RPE細胞破壞了血-視網膜屏障,導致RPE吞噬光感受器外節能力和調節類視黃醇循環能力下降,RPE代謝效率低下、識別和去除受損蛋白質的泛素蛋白酶體和自噬溶酶體系統功能受損,導致細胞內泛素化蛋白質堆積和視網膜細胞外沉積物聚集,形成了包含脂質、脂蛋白、脂褐素、β-淀粉樣蛋白以及炎性相關因子多種有害物質的玻璃膜疣并充當抗原刺激,激活免疫系統。年齡相關的Bruch膜細胞外基質膠原纖維交聯度增加,導致載脂蛋白等大分子在通過視網膜時受阻沉積,進而導致視網膜色素上皮和感光層損傷。

2.2 氧化壓力-抗氧化失衡

線粒體的脂肪酸β氧化為RPE細胞提供大量能量,與此同時產生大量的自由基,視網膜高含量的脂質增加了RPE氧化應激的風險,RPE細胞主要抗氧化機制為核因子紅細胞2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)。衰老的RPE中Nrf2的轉錄和表達量下降甚至沉默,導致其無法有效地與細胞質中的Kelch樣ECH相關蛋白1分離活化并進入細胞核,與抗氧化反應元件結合,導致下游超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽還原酶、硫氧還原酶等抗氧化劑短缺。低度ROS可活化氧化信號以維持生理功能,但慢性香煙煙霧、光暴露等刺激造成RPE細胞內ROS堆積,造成多不飽和脂肪酸等脂質過氧化,導致視網膜鐵蓄積[6-7]。RPE細胞內過量的鐵通過GSH-GPx-4和FSP1-CoQ(10)-NADH信號轉導導致RPE細胞鐵死亡并加速視網膜的老化,依賴于RPE提供營養和清除代謝廢物的光感受器細胞隨之死亡[8]。RPE細胞功能障礙和丟失觸發早期AMD的發生及進展,最終導致視網膜變性,二十二碳六烯酸對鐵超載小鼠模型的氧化應激和干性AMD具有保護作用[9-10]。

脂質過氧化產物可以氧化修飾視網膜細胞內的DNA、蛋白質、脂質、線粒體DNA等大分子使其轉變為壽命更長的氧化應激刺激物--氧化特異性表位(oxidation-specific epitopes, OSEs),如晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products, AGEs),AGEs促進其他OSEs的保留并防止其被模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)清除。OSEs通過與PRRs相互作用招募小膠質細胞,下調26S蛋白酶導致細胞內泛素化蛋白質蓄積促進脂褐素和玻璃膜疣的形成,并產生神經毒性炎性介質,清除瀕死神經元,破壞并吞噬光感受器。受損的線粒體DNA正反饋地促進細胞內ROS進一步增加并加劇線粒體功能失調,氧化損傷的DNA分子導致視網膜細胞DNA甲基化、端粒變短、組蛋白脫乙?；?、線粒體功能失調、轉錄組變化等功能異常。給予外源性線粒體來源的24肽護腦素HG可以降低細胞內炎性指標的蛋白水平,如CD62E/E-Selectin、CD62P/P-Selectin、ICAM-1、TNF-α、MIP-1α、IFN-γ、IL-1β、IL-13、IL-17A等,減輕線粒體DNA介導的炎性反應[11]。RPE中特異性地過表達Nrf2可以保護RPE形態和功能并防止感光細胞層被破壞[1]。巨噬細胞NAD+消耗酶的過度表達導致視網膜微環境中NAD+濃度下降,觸發巨噬細胞炎性途徑激活、炎性細胞正反饋聚集和ROS積累[12]。給予其前體如煙酰胺核糖NR和煙酰胺單核苷酸NMN可通過Sirt3-Nrf2等通路恢復氧化-還原平衡改善AMD[13-14]。

2.3 慢性炎性反應-抗炎失衡

視網膜中的硬脂酸通過Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)重塑染色質,選擇性地增強AP-1結合位點并觸發先天免疫系統持續重編程。視網膜中的AGEs可以放大炎性反應,保留炎性碎片或細胞殘留物形成玻璃膜疣,觸發AMD。氧化壓力和線粒體功能失調可活化炎性小體NLRP3和cGAS/STING,激活NF-κF轉錄因子,釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1等,導致視網膜長期處于慢性低度炎性環境,加劇AMD的進展。衰老相關分泌表型SASPs包括促炎細胞因子IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL2、CSF-1,一方面誘導周圍健康細胞發生細胞衰老,另一方面以自分泌、旁分泌的方式誘導免疫細胞聚集,引起慢性炎性反應。衰老的RPE細胞內蓄積的ROS可以激活NLRP3炎性小體和NF-κF信號通路,上調caspase-1,促進IL-1β、IL-18等炎性因子的前體轉化為活性形式,并激活其他炎性因子,隨著炎性反應的加劇免疫功能下降。NLRP3在AMD發展過程中的作用,目前尚存在爭議,有研究認為在AMD的后期抑制NLRP3相關信號可防止RPE變性和干性AMD的進展,另一些研究則認為NLRP3信號可防止AMD進一步發展。此外,衰老的RPE招募小膠質細胞,激活補體系統并釋放玻連蛋白和簇蛋白等補體通路調控因子,形成C3和C5膜攻擊復合物等促炎反應物,導致細胞溶解和釋放趨化因子,進一步介導炎性細胞包括小膠質細胞和巨噬細胞募集,視網膜單核吞噬細胞的免疫狀態是AMD進展、轉歸的關鍵決定因素[15]。

2.4 自噬功能失衡

自噬為RPE及視網膜代謝提供了至關重要的支持,保護視網膜免受壓力和生理衰老的影響。早期AMD患者中央凹周圍RPE中PTEN誘導激酶1(PTEN induced kinase 1, PINK1)降低,PINK1缺陷型RPE線粒體自噬和線粒體功能受損,觸發上皮-間充質轉化,這種作用可以被一種分泌性蛋白Kallistatin所逆轉[16-17]。當自溶體形成受損時分泌性自噬取代退化性自噬,導致RPE釋放蛋白質-蛋白質聚集體、脂褐素、β-淀粉樣蛋白、線粒體缺陷、促炎因子和促血管生成因子,形成玻璃膜疣和脈絡膜新生血管。抑制分泌性自噬可能是AMD的一種治療策略,分泌性自噬體特異性的TRIM16、SEC22B和RAB8A蛋白可能是治療靶點的主要候選蛋白[18]。年齡的增長導致褪黑素含量下降,補充褪黑素通過抑制低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)/Bcl2/腺病毒E1B19kD相互作用蛋白3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3, BNIP3)-輕鏈3B(light chain 3B, LC3B)/線粒體自噬信號抑制碘酸鈉誘導的ARPE-19細胞凋亡[19]。

2.5 腸道屏障和腸道微生態失衡

隨著衰老的進展,由上皮細胞、黏液層、抗菌肽、IgA分泌的免疫球蛋白構成的腸道上皮屏障功能下降,導致腸道微生物的多樣性和豐富性下降。腸道微生物的結構也隨著衰老逐漸變化:水解蛋白質的潛在的腸道病原菌豐度增加,有利于維持腸道屏障功能完整性的水解糖類的腸道菌以及具有抗氧化活性的腸道菌豐度下降[20-21]。腸道菌及其代謝產物如短鏈脂肪酸可以直接或者間接修飾不同細胞的表觀基因組,從而調節免疫細胞功能,老化的腸道菌群及其代謝產物可以刺激免疫系統的先天免疫應答和適應性免疫應答,誘導全身性炎性反應,通過“腸-眼軸”、“腸-視網膜軸”在視網膜遠端影響免疫狀態,導致視網膜長期處于炎性環境,誘發AMD的發生和發展。老化的腸道內乳酸菌豐度下降,乳酸可緩解線粒體膜電位破壞、減輕細胞內ROS,上調LC3II/I的比例激活自噬、增加LC3點狀和自噬液泡的形成,保護線粒體功能并防止氧化應激誘導的視網膜變性[22]。

2.6 促血管生成-抗血管生成失衡

RPE同時生成促血管生成因子VEGF以及抗血管生成因子--色素上皮衍生因子維持正常視網膜內穩態;衰老或早衰的RPE細胞內蓄積的ROS通過低氧誘導因子HIF-1α通路上調VEGF的表達,促進脈絡膜新生血管形成。脆弱的脈絡膜新生血管易破裂受損,促使鄰近RPE缺氧并上調VEGF表達,導致絨毛膜、毛細血管血流失調,加劇濕性AMD進展[23]。

3 問題與展望

AMD的發病機制尚不完全清楚、缺乏特異性專屬性衰老相關靶點,嚴重阻礙了AMD藥物研發進程。NF-κF、Nrf2、VEGF是其主要靶點,NF-κF抑制劑、Nrf2激活劑、VEGF抗體、補體抑制劑、端粒激活劑、細胞周期調節劑、微生態調節劑可以在一定程度上促使受損的視網膜重獲細胞內穩態,可以在一定程度上延緩AMD的發生和發展。