芽孢桿菌脂肽類抗生素的抑菌活性及其對植物病害的生物防效研究

摘 要：生物農藥替代化學類農藥和農藥減量已成為農業可持續發展的必然趨勢。為此，介紹了脂肽類抗生素的種類和結構以及脂肽類抗生素的抑菌活性，闡述了脂肽類抗生素在植物病害生物防治中的表現，探索了芽孢桿菌開發為生物農藥方面的應用。

關鍵詞：芽孢桿菌；脂肽類抗生素；抑菌活性；植物病害；生物防效

中圖分類號：S436.68 文獻標志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）02–00-03

在自然生態系統中存在著一類有益微生物能夠抑制或殺滅植物病原菌的生長，人們可以將有益微生物開發成為生物農藥替代化學農藥，減少化學農藥的使用，從而減少環境污染和食品安全隱患。芽孢桿菌是生物農藥中最具潛力和開發前景的一類有益微生物。芽孢桿菌產生的芽孢具有非常強的抗逆性，能夠適應惡劣的環境。芽孢還可以避免生物農藥在運輸或儲藏過程中活菌劑容易失活的現象，因此芽孢桿菌是一種較為理想的生物農藥。更重要的是，大多數芽孢桿菌還能夠產生多種多樣的抗菌活性物質，脂肽類抗生素是芽孢桿菌產生的重要活性物質。由于脂肽類抗生素具有低毒、易降解等特點，同時對極端溫度、酸堿度等具有廣泛的適應性，不僅被用于農業生產植物病害的生物防治，還被廣泛應用于土壤修復、石油回收、化妝行業、食品加工行業以及醫療等領域。由于脂肽類抗生素具有各種優勢，脂肽類抗生素的研究受到人們的青睞。了解和研究脂肽類抗生素不同抗菌活性及其在植物病害生物防治中的作用，有助于人們在農業生產中更好地開發和利用。

1 脂肽類抗生素的種類和結構

脂肽類抗生素是芽孢桿菌非核糖體合成的抗菌活性物質，主要由脂肪酸和肽鏈構成，根據碳原子數目以及氨基酸種類不同，可以分為三大家族：表面活性素（surfactins）、伊枯草菌素（iturins）和豐原素（fengycins）。在三大家族的肽環上由于不同的氨基酸序列和結構、類型或者連接的脂肪酸鏈，因此三大家族的脂肽之間由于氨基酸序列、長度、分支不同或者脂肪酸的不飽和現象等形成明顯的異構體或同系物。同時，三大家族的每一脂肽類抗生素種類都存在幾種同系物，而且往往是共同存在的。

表面活性素和伊枯草菌素都由7個氨基酸連接脂肪酸鏈構成的環脂肽類抗生素化合物。表面活性素是由C14到C17組成的β-羥基脂肪酸鏈，伊枯草菌素（iturins）是由C14至C15組成的β-氨基酸脂肪酸鏈，表面活性素同系物包括表面活性素、地衣芽孢桿菌素（lichenysin）和埃斯波素（esperins）；伊枯草菌素

（iturins）同系物包括iturinA、B、C、D，桿菌抗霉素（bacil-omyein）L、D、F和抗霉枯草菌素（mycosubtilin）等。豐原素

（fengycins）包括fengycin A 和B，plipastatin屬于fengycin

或有人認為fengycin也稱為plipastatin；fengycin由10個氨基酸連接脂肪酸鏈構成的環脂肽類抗生素化合物，脂肪酸碳原子數C14到C18，并且是3-Tyr和10-Ile通過內酯鍵形成一個環狀結構。

2 脂肽類抗生素的抑菌活性

在脂肽類抗生素三大家族中，surfactin具有強的表面活性，具有抗病毒、抗腫瘤、抗支原體和抗細菌的活性，但是不具有顯著的抗真菌活性，surfactin的抗菌機制在于能夠與細菌細胞膜相互作用可以誘導脂質雙分子層穿孔并形成離子通道，從而破壞膜的完整性。有研究表明surfactin與芽孢桿菌的鞭毛運動有關，可能會減弱細胞群在向植物根部聚集時細胞表面相互產生的摩擦力，因此有利于芽孢桿菌在植物根部定殖。此外，雖然surfactin沒有明顯抑制真菌的活性，但與其他脂肽類抗生素類化合物如iturin A共同作用時能夠顯著增強抑真菌活性。

伊枯草菌素具有較強的表面活性，而且對多種病原真菌和酵母菌表現強烈的抗菌活性，但是對細菌的抗菌活性是有限的，甚至沒有抑菌活性。研究表明，iturin A能夠有效抑制植物病原真菌和酵母菌，其抑菌機理主要通過病原真菌細胞壁和干擾小囊泡的細胞膜，造成內膜微粒子的聚集，促進電解質釋放和大分子物質與磷脂的降解，導致細胞死亡。此外，iturin A還改變細胞膜的滲透性，造成膜內鉀離子的泄漏。由于iturin A低毒、低致敏性，可用于人和動物真菌病害的防治。在iturins家族中，與iturin A親緣關系最近還有芽孢菌霉素和抗霉菌枯草桿菌素，由于iturin A抗真菌活性最強，可與化學殺菌性能相媲美，且具有低毒、低致敏性，對動物和人安全，因此可開發為最具理想的環境友好型的生物源農藥。

豐原素的表面活性比伊枯草菌素和表面活性素弱，但是對絲狀真菌，如實灰霉病原菌具有較強的抑制作用。此外，還能夠抑制大腸桿菌的生長。經fengycin

處理過的抑菌區域，新生菌絲頂端或者分枝頂端膨大，呈淡黃色泡囊。部分泡囊破裂，細胞壁內含物流出，造成菌絲細小、呈空癟狀和局部斷裂。有學者研究表明Bacillus subtilis C2產生的fengycin A能夠誘導尖孢鐮刀菌后桓孢子的形成，同時造成菌絲生長稀疏，菌絲腫脹畸形和分生孢子溶解。豐原素（fengycins）抑菌機理主要通過破壞真菌細胞膜上磷脂分子的正常秩序，引發胞質外流導致細胞死亡，且在高濃度下與surfactins類似對細胞膜具有溶解作用。

3 脂肽類抗生素在植物病害生物防治中的表現

由于脂肽類抗生素結構具有多樣性和復雜性，對植物病原真菌、細菌、病毒、昆蟲等都具有較強的生物活性，因此抑制或殺死病原菌的機制存在多樣性。芽孢桿菌作為生物農藥，最主要最直接的方式是產生抑菌活性物質包括脂肽類抗生素，而其在田間的生物防治效果：一方面與芽孢桿菌在植物根部土壤中的移動能力有關，另一方面與誘導寄主植物產生抗性有關，同時促進植物生長以抵抗病原菌的侵襲（一些芽孢桿菌被稱為根圍促生菌，PGPR）。研究表明：脂肽類抗生素不僅有利于生防菌在植物根部的定殖，而且在激發寄主植物產生抗性機制過程中也起到關鍵性作用，為脂肽類抗生素作為生物農藥的開發和利用提供了可行性條件，因此脂肽類抗生素在植物病害生物防治中具有舉足輕重的地位。

3.1 促進芽孢桿菌在植物根部的定殖

芽孢桿菌在植物根部的定殖與鞭毛有關。芽孢桿菌通過鞭毛的運動在植物根部定殖，在競爭中這些芽孢桿菌形成具有較強的黏著性、組織性和抗菌能力的多細胞群體。在固體表面，芽孢桿菌菌落進化和形成一個結構性組織，稱之為生物膜，在液相或氣相表面形成薄皮，會黏著在土壤顆粒表面，形成一個互相協調的群體，以此聯合起來共同適應不良的環境條件。這些芽孢桿菌產生的芽孢也具有高度的有序性，共筑的生物膜或薄皮之間就形成了“銅墻鐵壁”。研究表明，脂肽類抗生素surfactin和mycosubtilin與芽孢桿菌的鞭毛運動有關，可能會減弱細胞群在向植物根部聚集時細胞表面相互產生的摩擦力，因此有利于芽孢桿菌在植物根部定殖。此外，surfactin還與生物膜形成有關。生防菌通過抑制病原物是其生態競爭的重要機理， 脂肽類抗生素由于脂肪酸鏈與肽鏈的長度和種類不同，因此表現出不同的抗菌屬性，許多芽孢桿菌在植物根際土壤中具有一定的競爭優勢與環脂肽類抗生素的抗菌活性密不可分。

3.2 誘導寄主植物產生系統抗性

芽孢桿菌能夠誘導寄主植物產生系統防衛反應，被稱為誘導系統抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）。系統抗性反應是在寄主植物在感病狀態下，由微生物引起的寄主植物細胞分子反應模式的一種結果，系統反應信號通過轉導給寄主植物使得其修飾基因的表達，從而增強了植物對病原物的抵抗能力。生防菌誘導的ISR信號主要通過茉莉酸或乙烯信號途徑，水楊酸也可以引起環脂肽（CLP）的誘導系統抗性，主要是由表面活性素和豐原素誘導的多種寄主植物上的系統抗性 。

4 脂肽類抗生素的應用

由于surfactins具有較強的表面生物活性，因而在食品方面作為乳化劑或食品添加劑以及在藥物開發方面作為佐劑開發應用較為廣泛，并逐漸成為化學表面活性劑的天然替代品。近年來，有文獻報道surfactins具有較強的抗真菌活性，且具有潛在蚊蟲殺蛹作用；fengycins具有良好的抗真菌活性，可特異性治療真菌，在許多芽孢桿菌的抗菌活性物質檢測中發現存在fengycins，在醫藥研究中發現fengycins還可抑制金黃色葡萄球菌的定殖；iturins脂肽類抗生素在三大家族中表現抗真菌活性最強，可與化學殺菌性相比擬，且具備較強的穩定性、低毒性和低致敏性的特點，因此是最具理想的環境友好型的生物源農藥。植物病害中80%的病害是由病原真菌引起的，iturins在植物病害中的抑菌活性得到了較為充分的體現，加之iturins的大規模發酵生產已積累了長期的技術和經驗，顯示了iturins作為生物農藥廣泛的應用前景。

伊枯草菌素A（iturin A）最初是從枯草芽孢桿菌分離得到的，對多種病原真菌和酵母菌具有強烈抑制作用的環脂肽化合物，其在農業中主要用于種子儲藏性和對土壤寄居性病原真菌的防治，后來用于人類和動物的醫藥研究。國外，iturin A用于防治堅果類和谷物類的黃曲霉毒素曾獲得專利。隨后，科學家發現了與iturin A親緣關系最近的芽孢菌霉素（bacillomycin）和抗霉菌枯草桿菌素，三者都屬于iturins家族，而iturin A在iturins家族中抗真菌活性最強。通過動物和人體臨床試驗也表明，iturin A低毒、低致敏性，可用于人和動物真菌病害的防治。有學者最初從枯草芽孢桿菌中分離到iturin A的8個同系物，并認為iturin A是8個同系物的混合物。后來Yerra Koteswara Rao等[1]從解淀粉芽孢桿菌中也分離到iturin A的8個同系物。因此，能夠產生iturin A的生防菌株以枯草芽孢桿菌（B. subllis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）報道較多。

與iturin A先后被發現，且親緣關系最近的是bacilo-

mycin和mycosubtilin，兩者都是從Bacillus subtilis分離出的一類環脂肽類抗生素化合物，它們的肽段均包括L-型和D-型的氨基酸，并且bacillomycin F抗菌活性與iturin A有關。mycosubtilin與iturin A的親緣關系最近。與surfactin相同，mycosubtilin與芽孢桿菌鞭毛運動有關，通過減弱細菌群運動中細胞表面產生的摩擦力，因此優先聚集到植物根部并定殖下來。Valérie Leclère等[2]研究發現B. subtilis ATCC6633產生的mycosubtilin對腐霉?。≒ythium aphanidermatum）有較好的防效。

B. subtilis RB14對土傳性病害尤其是番茄土傳性病害具有良好的防效，并開發成生物農藥，其產生的主要抑菌活性物質是iturin A。此后，許多研究者對B. subtilis RB14產iturin A發酵條件以及脂肽類抗生素合成酶基因進行了較為深入的研究。B. subtilis B3對小麥赤霉?。‵usarium graminearum）、小麥立枯病（Rhizoctonia solani）、小麥紋枯?。≧hizoctonia cerealis）和稻瘟?。≒yricularia grisea）等真菌病害具有良好防效且穩定性較好，其商品名為麥豐寧。通過脂肽合成酶基因的克隆測序和分析，研究表明B. subtilis B3產生的抑菌物質主要為iturin A 和fengycin。

5 芽孢桿菌在植物病害生物防治中的應用

芽孢桿菌能夠產生抗生素、嗜鐵素、植物生長激素等活性物質，這些活性物質與植物病害的生防機制密切相關，也對芽孢桿菌開發生物農藥和生物肥料起到了優勢作用，其中基于芽孢桿菌開發的生物農藥產品約占細菌性生物農藥的50%。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌中最早和最具代表性的商品化生物農藥[3-5]。

例如，日本東研發的B. subtilis RB14對立枯絲核菌（Rhizo-

ctonia solani）引起的番茄病害有良好的防效，美國研發的B. subtilis var. amyloli quefaciens FZB 24，商品名為Taegro，

主要用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麥白粉病，還可作為增產促進劑，隨后B. subtilis QST713和B. subtilis QST 2808被美國Agraquest公司注冊生產，商品名分別為SerenadeTM和SouataAS，葉面施用可防治蔬菜、櫻桃、葡萄、葫蘆、胡桃等作物的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等真菌性病害。此后，B. subtilis MBI600在英國、日本、瑞士等國家獲得注冊登記和商業化生產[6]。

我國生物農藥研發的整體水平在發展中國家處于領先地位，利用枯草芽孢桿菌防治植物病害的應用研究也達到世界先進水平。較為典型的枯草芽孢桿菌如B. subtilis B916、B908、B3、BS-208 等相繼實現產業化，開發商品名分別為紋曲寧、百抗、麥豐寧、依天得。在美國，側孢短芽孢桿菌被成功地作為生物殺蟲劑來防治動物線蟲，我國云南大學側孢短芽孢桿菌殺線蟲成果也得到了生產上的應用。2015年，由山東奧豐生物科技自主研發枯草芽孢桿菌B. subtilis BSn5干粉劑已通過相關專家的科技成果鑒定，經大田試驗該菌對水稻稻瘟病、黃瓜白粉病、草莓灰霉病等植物病害具有較好的防治效果。當前，芽孢桿菌開發為生物農藥大多含有2種或2種以上芽孢桿菌混合液，或芽孢桿菌與殺菌劑的復配劑，通過芽孢桿菌之間或芽孢桿菌與殺菌劑的協同作用，增強生物防治效果和防效的穩定性[7-10]。

6 結束語

當前，雖然化學防治是植物病害防治的主要方式，但隨著環保新型農藥的研制、開發、利用和推廣，新型生物農藥的應用效果和對環境友好的優勢作用已經被市場逐漸認可，生物農藥替代化學類農藥和農藥減量已經成為農業可持續發展的必然趨勢。同時，隨著分子生物學和生物信息技術的發展，人們利用宏基因組學、蛋白質組學和代謝組學等手段，對植物、微生物和土壤三者之間的分子水平研究機制逐步開展分析，將會開發出越來越多的新型生物農藥，達到良好的應用效果，用于造福于人類。

參考文獻

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