西瓜噬酸菌DeoR家族轉錄因子glpR的功能研究

王成梁 喬培 劉德華 孟永紅 關巍 楊玉文 趙廷昌

摘 ? ?要：DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor）家族轉錄因子是在原核生物中廣泛存在的轉錄調控因子。DeoR通過調節毒力因子的表達來影響病原細菌的致病性，并且在不同的病原細菌中有不同的調控網絡。為了闡明DeoR在西瓜噬酸菌中的功能和信號通路，Aac5菌株被用來構建DeoR轉錄因子glpR的缺失突變株及互補菌株，通過進行表型及轉錄水平的測定，對西瓜噬酸菌中DeoR轉錄因子glpR的功能進行初步探究。結果表明，缺失glpR基因后，Aac5菌株利用果糖的能力、對西瓜苗的致病能力、西瓜子葉體內生長能力以及形成生物膜的能力均顯著下降，體外生長速度減慢，而抗高鹽脅迫能力以及抗銅離子脅迫能力顯著增強。同時，基因glpR的缺失會導致三型分泌系統基因hrpG、hrpE及hrcJ表達量顯著下調，果糖利用相關基因fruA、fruB與fruK表達量顯著下調，生物膜相關基因flgG表達量顯著下調，與WT-fruBpGUS相比，ΔglpR-fruBpGUS的fruB的啟動子活性顯著減弱。以上結果表明，glpR基因在西瓜噬酸菌果糖利用、抵抗逆境脅迫以及致病過程中起重要作用。

關鍵詞：西瓜噬酸菌；致病力；DeoR轉錄因子

中圖分類號：S651+Q945.8 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）05-041-12

Function of DeoR family transcription factor glpR in Acidovorax citrulli

WANG Chengliang1， 2， QIAO Pei2， LIU Dehua1， 2， MENG Yonghong3， GUAN Wei2， YANG Yuwen2， 4， ZHAO Tingchang2， 4

（1. College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， Jilin， China; 2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Beijing 100193， China; 3. Ledong Douzhiguo Melon and Watermelon Planting Professional Farmers Cooperative， Ledong 572541， Hainan， China; 4. National Nanfan Research Institute（Sanya）， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Sanya 572024， Hainan， China）

Abstract： The DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor） family of transcription factors are transcriptional regulators that are widely present in prokaryotes. DeoR affects the pathogenicity of pathogenic bacteria by regulating the expression of virulence factors， and there are different regulatory networks in different pathogenic bacteria. In order to elucidate its function and signaling pathway in Acidovorax citrulli， Aac5 strain was used to construct the deletion mutant and complementary strain of DeoR transcription factor glpR. The function of DeoR transcription factor glpR in Acidovorax citrulli was preliminarily explored by measuring the phenotype and transcription level. The results showed that after deletion of glpR gene， the ability of Aac5 strain to utilize fructose， the pathogenicity of watermelon seedlings， the growth ability of watermelon cotyledons and the ability to form biofilm were significantly decreased， and the growth rate in vitro was slowed down. The ability to resist high salt stress and copper ion stress was significantly increased. At the same time， the deletion of the gene glpR resulted in a significant down-regulation of the type III secretion system genes hrpG， hrpE and hrcJ， a significant down-regulation of the fructose utilization-related genes fruA， fruB and fruK， and a significant down-regulation of the biofilm-related gene flgG. Compared with WT-fruBpGUS， the promoter activity of fruB in ΔglpR-fruBpGUS was significantly reduced. The results indicated that glpR gene plays an important role in fructose utilization， resistance to stress and pathogenicity of Acidovorax citrulli.

Key words： Acidovorax citrulli; Virulence; DeoR transcription factor

細菌性果斑?。╞acterial fruit blotch，BFB）是典型的檢疫性細菌性病害，會對西瓜、甜瓜等葫蘆科作物造成嚴重危害，西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli）為其病原菌。根據寄主的差異可以將西瓜噬酸菌劃分為兩組，I組菌株、II組菌株分別主要分離自甜瓜、西瓜[1-2]。1965年該病首次在美國佐治亞州被發現[3]，目前已在世界范圍內發生流行。在西瓜噬酸菌中研究比較多的發揮重要作用的致病因子主要有Ⅲ型分泌系統[4-6]、IV型菌毛[7]、Ⅵ型分泌系統[8]、鞭毛[9]、群體感應[10]以及生物膜等[11]，但是該病害在致病機制方面的研究仍然較少，針對性的防控手段也比較有限[12-13]，因此通過解析該病害的致病機制可為開發新的防控果斑病技術提供參考。

果糖是細菌碳水化合物代謝途徑早期進化中的重要糖類，果糖代謝在生命活動中具有重要意義，并且果糖磷酸轉移酶系統（PTSFru）在細菌物種中比任何其他碳水化合物磷酸轉移酶系統都更廣泛[14]。果糖磷酸轉移酶系統由fruA和fruB組成，細菌先通過果糖磷酸轉移酶系統將果糖運輸并磷酸化為果糖-1-磷酸，然后通過fruK編碼的1-磷酸果糖激酶把果糖-1-磷酸磷酸化為果糖-1，6-二磷酸。因此，fruA、fruB和fruK是果糖代謝過程中的關鍵基因[15]。

DeoR（Deoxyribonucleoside operon repressor）家族轉錄調控因子廣泛存在于細菌中，該家族首個被鑒定的成員是大腸桿菌（Escherichia coli）DeoR蛋白，是一種調控deo操縱子（deoxyribonucleoside operon）轉錄表達的轉錄抑制子[16-18]。DeoR蛋白單體在結構上主要由N末端DNA結合結構域和存在于C末端的配體結合結構域組成，并且有一個保守的螺旋-轉角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）結構基序存在于N端DNA結合結構域中[19-20]，C末端結構域的用途是完成蛋白寡聚化和配體結合[21]。而在功能上，大腸桿菌DeoR蛋白既可作為局部的特異性調控因子[22-23]，也可作為全局的多效性調控因子[24-25]，還可以通過結合啟動子DNA的特定序列來轉錄抑制或者激活靶基因的轉錄表達[26]。

目前已發現多個DeoR轉錄因子在細菌致病過程、果糖代謝和抗脅迫過程中發揮著重要作用。筆者在本研究中，通過對西瓜噬酸菌 AAC00-1 基因組生物信息學分析，只發現了1個DeoR家族轉錄因子glpR，但是DeoR家族轉錄因子在西瓜噬酸菌致病過程中的功能尚不清楚，因此，筆者通過敲除西瓜噬酸菌glpR基因來探究其對西瓜噬酸菌致病相關多種表型以及轉錄水平的影響，從而明確glpR基因在西瓜噬酸菌中的功能，為西瓜噬酸菌中DeoR家族轉錄因子相關調控網絡的后續探索提供參考，也為細菌性果斑病有效防治技術的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物、菌株與質粒 試驗于2022年6月至2023年8月在中國農業科學院植物保護研究所進行。試驗所用西瓜（Citrullus lanatus）品種為中蔬瑞鑫[中蔬種業科技（北京）有限公司]。本試驗所用菌株及質粒詳見表1。

大腸桿菌在溶菌肉湯（Lysogeny broth，LB）培養基中37 ℃、220 r·min-1振蕩培養；西瓜噬酸菌Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp使用金氏B（Kings B，KB）培養基28 ℃、220 r·min-1培養。卡那霉素（Kanamycin，Km）、氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）、氯霉素（Chloraphenical， Cm）的終質量濃度分別為50、100、25 μg·mL-1。

1.1.2 試劑、培養基 試劑：限制性內切酶和KOD高保真酶購自日本TaKaRa公司，質粒小提試劑盒購自美國Axygen生物有限公司，SuperReal PreMix Plus（SYRB Green）購自北京天根生化科技有限公司，細菌總RNA提取試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司等。由北京六合華大基因科技有限公司完成測序以及相關引物合成。

培養基－（1）KB培養基（pH 7.0）：參考蔡馥宇等[27]的配方；（2）LB培養基（pH 7.0）：參考蔡馥宇等[27]的配方；（3）0.3%半固體培養基[28]（pH 7.0）：細菌專用蛋白胨0.24 g、運動性專用瓊脂粉2.4 g以及酵母粉0.24 g，分別使用去離子水將上述3種培養基定容至800 mL，滅菌溫度和時間分別為121 ℃、20 min，滅菌后放室溫備用。（4）三型分泌系統（Type III Secretory System，T3SS）誘導培養基XVM2：果糖1.801 g、MgSO4 0.601 g、KH2PO4 0.021 7 g、酪蛋白水解物0.3 g、蔗糖3.432 g、（NH4）2SO4 1.33 g、CaCl2 1.11 g、FeSO4·7H2O 0.002 8 g、NaCl 1.17 g以及K2HPO4·3H2O 0.073 g，最后調至pH=6.7[29]；（5）M9培養基（pH 7.0）：KH2PO4 9 g、Na2HPO4·12H2O 45.362 1 g、NaCl 1.5 g以及NH4Cl 3 g[30]；（6）MMX基礎培養基（pH 7.0）：KH2PO4 6 g、檸檬酸三鈉1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO4 4 g、葡萄糖5 g、（NH4）2SO4 1.33 g[31]。（7）MMX-q培養基則是在MMX基礎培養基基礎上，將該培養基中的糖源葡萄糖改為果糖。將上述4種培養基均加入去離子水至1000 mL，在110 ℃條件下高壓滅菌15 min后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 構建glpR基因的缺失突變菌株和互補菌株 通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索西瓜噬酸菌AAC00-1的基因組后發現glpR基因位于660 436～661 200之間，并且全長為765 bp。然后通過KEGG（https：//www.kegg.jp/）下載glpR基因的完整核苷酸序列；利用Primer 5設計的左右臂引物glpR-1F/glpR-1R、glpR-2F/glpR-2R在KOD高保真酶作用下擴增glpR上下游的DNA片段；再通過Overlapping PCR技術連接擴增成功的上下游DNA片段，酶切（EcoRⅠ/HindⅢ）pK18mobsacB載體質粒后將質粒通過無縫連接酶的作用與上下游DNA片段連接并轉入到大腸桿菌感受態DH5α中，從而構建pK18-glpR敲除載體[32]，然后依據同源重組雙交換的原理篩選正確的ΔglpR突變菌株，pK18-glpR通過三親雜交導入到Aac5-WT中，篩選具有Km以及Amp抗性的正確單交換克?。煌ㄟ^在含有Amp和10%蔗糖的M9固體平板上涂布單交換克隆，篩選獲取正確的缺失突變菌株[33]，利用三親本雜交法在Aac5-WT以及突變菌株中均導入pBBR1MCS-2質粒，從而消除pBBR1MCS-2對菌株的影響。最后利用西瓜噬酸菌特異性引物WFB1/WFB2、目的基因特異性驗證引物ΔglpR-L/ΔglpR-R以及pBBR1MCS-2質粒檢測引物Kan-F/Kan-R進行PCR驗證。相關的引物序列見表2。

使用引物對ΔglpRcomp-F/ΔglpRcomp-R擴增glpR的全長序列，使用無縫連接酶將其與酶切（HindIII/BamHI）后的載體質粒pBBR1MCS-2連接并轉入大腸桿菌感受態DH5α。通過測序確認已構建的pBBR1MCS-glpR載體，利用三親本雜交的原理把互補載體質粒pBBR1MCS-glpR導入突變株中，同樣用引物ΔglpR-F/ΔglpR-R、WFB1/WFB2以及Kan-F/Kan-R進行驗證（表2）。

1.2.2 GUS基因表達菌株的構建 使用引物對GUS-F/GUS-R擴增fruB的啟動子序列，使用無縫連接酶將其與酶切（XbaI/EcoRI）后的質粒pBBRNolacGUS連接并轉入大腸桿菌感受態DH5α。通過測序確認已構建的pBBRNolacGUS-fruBp載體，利用三親本雜交的方法將載體質粒pBBR1MCS-glpR分別導入Aac5及ΔglpR菌株中，再利用三親本雜交的方法將載體質粒pBBR1MCS導入Aac5菌株中，使用GUS-F/GUS-R進行PCR驗證[34]。

1.2.3 果糖利用能力的測定 在MMX基礎培養基上對糖源進行替換，然后分別在添加果糖和不添加果糖條件下進行試驗，調菌懸液濃度至OD600=0.6后離心，棄上清液，然后用培養基重懸，在裝有990 μL培養基的離心管中加入10 μL菌懸液，設置5個重復。各處理均在28 ℃、220 r·min-1條件下培養4 d，然后分別測定其OD600值[31]。利用XVM2培養基來測定各菌株對果糖的利用能力，分別在添加果糖和不添加果糖條件下進行試驗，調各菌株菌懸液濃度至OD600=0.6，然后分別從各菌株菌懸液中取出1 mL至15 mL離心管，離心棄上清液后的菌體用5 mL XVM2培養基重懸，均設置3次重復。各處理均在28 ℃、220 r·min-1條件下培養24 h后分別測定并記錄其OD600值[35]。

1.2.4 抗脅迫能力測定 用KB培養基（含4% NaCl）來模擬高鹽脅迫條件，將新鮮的菌懸液濃度統一調至OD600=0.3后，用4%NaCl的KB培養基重懸，在28 ℃、220 r·min-1下振蕩培養20 h后，分別測定其OD600值[36]，每個處理設置5次重復，試驗3次重復。利用4 mmol·L-1 CuSO4·5H2O KB培養基來模擬銅離子脅迫條件，方法同抗高鹽脅迫測定。

1.2.5 致病力測定 通過噴霧接種測定各菌株致病能力。各菌株的菌懸液離心棄上清液后用無菌水統一調濃度至OD600=0.3（3×108 CFU·mL-1），每種菌株都準備100 mL菌液備用，共分為ΔglpR、ΔglpRcomp、Aac5和清水陰性對照4個處理，每個處理4次重復，每個重復5株苗。待西瓜苗長出3～4片真葉后進行接種，在西瓜真葉的正反面均勻噴霧后置于生長條件為28 ℃ 、16 h光照和20 ℃ 、8 h黑暗的光照氣候培養箱中，相對濕度為85%。接種10 d后調查各處理西瓜苗的病情指數[37]。試驗3次重復。

1.2.6 體外生長能力測定 將OD600=0.3的各菌株菌懸液用KB液體培養基稀釋100倍后，各取200 μL加入100孔聚苯乙烯板，在自動生長曲線儀中28 ℃振蕩培養96 h，每2 h測定1次OD600值[9]。每個處理設置4次重復，試驗3次重復。

1.2.7 寄主體內生長能力測定 新鮮菌懸液用無菌水重懸后濃度調至106 CFU·mL-1，然后將菌懸液用1 mL去掉針頭的注射器注滿西瓜子葉，放置于培養箱中，培養條件同1.2.3。各菌株都設置3個重復，共接種30株西瓜苗，設置在西瓜子葉中注射清水的陰性對照。共取樣5次，接種后1、24、48、72、96 h隨機取3片西瓜子葉拍照，每片子葉使用打孔器（直徑1 cm）截取葉盤，放入裝有500 μL無菌水的2 mL離心管中，充分研磨后梯度稀釋，分別取10 μL點樣于加有Km和Amp抗生素的KB固體平板，于28 ℃倒置培養48 h后計算各處理菌落數[38]。試驗3次重復。

1.2.8 生物膜的形成能力測定 將各菌株的菌懸液使用新鮮KB液體培養基分別調濃度至OD600=0.3后，采用結晶紫染色的方法進行生物膜形成能力測定[39]，記錄各處理OD575值，每個處理分別設置4次重復，試驗3次重復。

1.2.9 致病相關基因表達量的測定 分別從西瓜噬酸菌Aac5和突變菌株ΔglpR的培養平板上挑取單菌落到T3SS誘導培養基以及KB液體培養基中，并使用恒溫搖床28 ℃、220 r·min-1搖培24 h。然后用細菌總RNA提取試劑盒分別提取經兩種培養基培養后的野生型菌株Aac5和突變菌株ΔglpR的總RNA，將各處理的RNA濃度調節統一后反轉錄為cDNA，選取的內參基因為rpoB，然后分別對果糖利用關鍵基因（fruA、fruK、fruB）、三型分泌系統關鍵基因（hrpG、hrpE、hrpX、hrcJ）和生物膜相關基因（flgG）進行qRT-PCR測定，本試驗引物信息見表2。利用相對定量（2-ΔΔCt）的方法計算對應基因在突變菌株中的表達量[40-42]。試驗3次重復。

1.2.10 啟動子活性測定 分別取KB培養的OD600=0.6的WT-GUS、WT-fruBp-GUS和ΔglpR-fruBp-GUS菌懸液各5 mL，低溫離心后棄上清液，用Sonic Buffer調濃度至OD600=0.5，取液體1 mL超聲破碎（35 W，超聲開時間5 s，超聲關時間5 s，工作總時間5 min）后，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液備用。使用XVM2重復上述操作，獲得蛋白上清液備用。使用 BCA protein Assay Kit 檢測各處理上清液的蛋白濃度。使用Infinte F200多功能酶標儀（激發光360 nm、發射光480 nm）測定反應前后各處理的熒光數值，并計算GUS 活性。具體試驗步驟參見張曉曉[43]的方法。

1.3 數據處理

使用Excel 2019記錄并計算試驗數據和制圖，使用SPSS 26進行方差分析和差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 突變菌株及互補菌株的構建

使用目的基因特異性驗證引物ΔglpR-F/ΔglpR-R、西瓜噬酸菌特異性引物WFB1/WFB2以及pBBR1MCS-2質粒檢測引物Kan-F/Kan-R分別對Aac5、ΔglpR以及ΔglpRcomp進行PCR驗證，以加ddH2O作為陰性對照（圖1）。目的基因特異性驗證引物ΔglpR-F/ΔglpR-R的驗證結果表明，Aac5與互補菌株ΔglpRcomp均成功擴增出664 bp的條帶，而突變菌株ΔglpR沒有條帶，確定獲得了正確的突變菌株及互補菌株；利用西瓜噬酸菌特異性引物WFB1/WFB2證實各菌株均為西瓜噬酸菌；利用Kan-F/Kan-R證實Aac5-WT與突變菌株中成功導入了pBBR1MCS-2空載質粒。

2.2 GUS基因表達菌株的構建

使用目的基因特異性驗證引物GUS-F/GUS-R、西瓜噬酸菌特異性引物WFB1/WFB2以及pBBRNolacGUS質粒檢測引物Kan-F/Kan-R分別對WT-GUS、WT-fruBp-GUS以及ΔglpR-fruBp-GUS進行PCR驗證，以加ddH2O作為陰性對照（圖2）。目的基因特異性驗證引物GUS-F/GUS-R驗證結果表明，WT-GUS、WT-fruBp-GUS以及ΔglpR-fruBp-GUS均成功擴增出542 bp的條帶，確定獲得了正確的GUS基因表達菌株；利用WFB1/WFB2證實各GUS基因表達菌株均為西瓜噬酸菌；利用Kan-F/Kan-R證實WT-GUS、WT-fruBp-GUS以及ΔglpR-fruBp-GUS中成功導入了pBBRNolacGUS質粒。

2.3 glpR的缺失減弱了Aac5對果糖的利用能力

果糖利用能力測定結果表明，在MMX-q培養基中，不添加果糖的3種菌懸液濃度無顯著差異；而添加果糖后的Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp的OD600值分別為0.60、0.55和0.59，ΔglpR的OD600值顯著低于Aac5菌株，而互補菌株的OD600值與Aac5的OD600值沒有顯著差異，說明glpR基因的缺失減弱了西瓜噬酸菌Aac5對果糖的利用能力（圖3-A）。

在XVM2培養基中，不添加果糖的3種菌懸液濃度無顯著差異；而添加果糖后的Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp的OD600值分別為0.58、0.48和0.57。ΔglpR的OD600值顯著低于Aac5菌株，而互補菌株的OD600值與Aac5的OD600值沒有顯著差異，說明glpR基因的缺失使西瓜噬酸菌Aac5對果糖的利用能力減弱（圖3-B）。

2.4 glpR的缺失影響西瓜噬酸菌Aac5的抗脅迫能力

利用4% NaCl的KB培養基對各菌株進行抗高鹽脅迫能力測定，高鹽脅迫條件下培養20 h后，Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp的OD600值分別為0.13、0.21和0.16，Aac5菌株的抗高鹽脅迫能力顯著低于突變株ΔglpR，而互補菌株ΔglpRcomp部分恢復抗高鹽脅迫能力（圖 4）。表明基因glpR的缺失增強了西瓜噬酸菌抗高鹽脅迫的能力。

在4 mmol·L-1 CuSO4·5H2O的KB培養基中培養20 h后，Aac5、ΔglpR 和ΔglpRcomp的OD600值分別為0.33、0.67和0.30，Aac5菌株和互補菌株ΔglpRcomp的OD600值均顯著低于突變株ΔglpR，并且互補菌株ΔglpRcomp的OD600值能夠恢復至Aac5水平（圖5）。結果表明glpR基因缺失后，西瓜噬酸菌抗銅離子脅迫的能力得到顯著提高。

2.5 glpR的缺失減弱了Aac5的致病能力

噴霧接種西瓜幼苗14 d后，西瓜幼苗接種ΔglpR后與接種Aac5、ΔglpRcomp相比發病更輕（圖 6-A），接種Aac5幼苗病情指數為40.67，接種互補菌株ΔglpRcomp的西瓜幼苗病情指數為38.79，兩者均顯著高于接種ΔglpR的病情指數26.36，互補菌株ΔglpRcomp的致病力能夠恢復至Aac5水平（圖 6-B）。

2.6 glpR的缺失減弱了Aac5的體外生長能力

突變菌株ΔglpR和互補菌株ΔglpRcomp比野生菌株Aac5進入對數生長期慢了約4 h。但在進入平臺期后，突變菌株的生長量和Aac5相差不大，互補菌株的生長量略低于突變菌株和Aac5（圖7）。

2.7 基因glpR的缺失減弱了Aac5的體內生長能力

通過子葉注射對各菌株體內定殖能力進行測定。結果表明，子葉中的活菌數量均隨時間推移而升高，在接種各處理48 h后，ΔglpR接種的子葉發病情況明顯弱于Aac5（圖 8-A），且在接種各處理24～96 h時，ΔglpR在子葉中的菌群數量始終低于Aac5，而互補菌株ΔglpRcomp在體內生長情況基本恢復至Aac5水平（圖 8-B）。

2.8 glpR的缺失減弱了Aac5的生物膜形成能力

Aac5形成的生物膜比ΔglpR更明顯，ΔglpRcomp和Aac5形成的生物膜相近（圖9-A）。用95%乙醇溶解生物膜后測量得到Aac5、ΔglpR和ΔglpRcomp的OD575值分別為0.29、0.12和0.27。Aac5菌株和互補菌株ΔglpRcomp的OD575值均顯著高于ΔglpR，并且互補菌株ΔglpRcomp的OD575值可以恢復到Aac5的水平（圖9-B）。

2.9 致病相關的基因表達量測定結果

qRT-PCR測定結果表明，與Aac5相比，用T3SS誘導培養基培養時，ΔglpR中T3SS關鍵基因hrpG、hrpE與hrcJ表達量顯著降低，果糖代謝相關基因fruA、fruB與fruK表達量顯著降低；通過KB培養基培養，ΔglpR生物膜相關基因flgG表達量顯著降低（圖10），推測西瓜噬酸菌中的基因glpR和T3SS相關基因、果糖代謝相關基因以及生物膜相關基因之間均存在著一定的調控關系。

2.10 GUS啟動子活性檢測

筆者分析了 fruB 基因的啟動子在Aac5和ΔglpR菌株中的活性，以此來進一步驗證 qPCR檢測的相關結果。GUS酶活檢測結果表明，與WT菌株相比，在KB和XVM2培養基兩種培養條件下，ΔglpR菌株中的基因fruB的啟動子活性均顯著降低（圖 11）。這與qPCR測定結果一致，表明基因glpR在西瓜噬酸菌中能調控果糖利用關鍵基因fruB的啟動子活性。

3 討論與結論

為了研究基因glpR的功能，筆者構建了西瓜噬酸菌glpR基因缺失突變株及互補菌株，在測定glpR基因缺失突變株對果糖利用能力時發現，同Aac5相比，突變株利用果糖的能力顯著下降，并且轉錄水平測定結果表明，果糖利用相關基因fruA、fruB與fruK表達量顯著下調。GUS啟動子活性檢測結果表明，突變株中的fruB基因的啟動子活性顯著降低，推測glpR可能與果糖利用關鍵基因fruB的啟動子結合，促進fruB基因的轉錄，而glpR缺失后對激活fruB基因啟動子造成影響，進而影響突變株對果糖的利用能力。綜上所述，glpR基因在西瓜噬酸菌果糖代謝過程中起關鍵作用，這與以往的研究結果相一致[44]。在抗脅迫測定中發現，glpR基因缺失突變株在高鹽脅迫以及銅離子脅迫中的耐受程度都顯著高于Aac5。在進一步對致病相關的表型分析后發現，突變菌株ΔglpR的體內定殖能力、體外生長能力以及生物膜的形成能力均顯著下降，體內定殖能力、體外生長能力以及生物膜形成能力的減弱可能與缺失glpR基因后西瓜噬酸菌對果糖等營養元素利用能力減弱有關。glpR基因缺失使西瓜噬酸菌的致病能力顯著減弱，在丁香假單胞菌中，DeoR家族轉錄因子setA的缺失會導致病原菌對寄主的致病能力顯著下降并且T3SS中相關基因的表達量也顯著下降[45]，與此相似，glpR缺失后西瓜噬酸菌T3SS關鍵基因hrpG、hrpE及hrcJ表達量顯著下調，推測glpR基因是hrpG、hrpE及hrcJ上游潛在的調控基因。

綜上所述，筆者的研究初步探究了glpR基因對西瓜噬酸菌致病性相關表型的影響，glpR基因在西瓜噬酸菌中不僅在果糖利用、抗脅迫方面具有重要作用，而且對西瓜噬酸菌致病力方面具有重要貢獻。但目前對西瓜噬酸菌中DeoR家族調控機制的研究還不夠深入，對該轉錄因子的調控網絡了解較少，在后續研究中還需要繼續尋找其下游可能存在的重要調控靶點，探尋可能存在的調控網絡，從而為尋找新的病原細菌防治靶標提供參考。

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