高效液相色譜法檢測(cè)混合型飼料添加劑中綠原酸的優(yōu)勢(shì)及其影響因素

【摘要】綠原酸作為一種具備多種生理功能的活性物質(zhì)在畜牧業(yè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。高效液相色譜法因分離能力強(qiáng)、靈敏度高、分析速度快、結(jié)果精確以及應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)而備受青睞，成為綠原酸檢測(cè)中最為常用的檢測(cè)方法。本文闡述了高效液相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的優(yōu)勢(shì)及注意事項(xiàng)，旨在為檢測(cè)混合型飼料添加劑中的綠原酸含量提供一些新思路。

【關(guān)鍵詞】綠原酸；高效液相色譜法；混合型飼料添加劑

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.02.002

Determination of Chlorogenic Acid in Mixed Feed Additives by HPLC and Its Influencing Factors

YANG Huijie

（Liaoning Inspection，Examination & Certification Centre〔Liaoning Lnstitute forAgro-product Veterinary Drugs and Feed Control〕， Shenyang 110036， China）

Abstract： Chlorogenic acid， as an active substance with various physiological functions， has been more and more widely used in animal husbandry. High performance liquid chromatography （HPLC） is favored for its excellent separation ability， high sensitivity， rapid analysis speed， accurate results and a wide range of applications， and is most commonly used in chlorogenic acid detection. In this paper， the advantages and precautions of determination of chlorogenic acid in mixed feed additives by high performance liquid chromatography （HPLC） were described， in order to provide some new ideas for the determination of chlorogenic acid in mixed feed additives.

Keywords： chlorogenic acid； HPLC； mixed feed additives

綠原酸（Chlorogenic acid，CA）是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinicacid，1-羥基六氫沒(méi)食子酸）生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物[1]。綠原酸類物質(zhì)來(lái)源廣泛，具有重要的生物活性作用，如抗菌、抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤、降血壓、降血脂、清除自由基等[2]。作為一種潛在的增強(qiáng)動(dòng)物自身免疫力的飼料添加劑，綠原酸能夠緩解動(dòng)物腸道氧化應(yīng)激和炎癥，維持腸道穩(wěn)態(tài)和免疫機(jī)能，保障動(dòng)物腸道健康[3]。綠原酸不僅可有效提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，具有抗炎、抗氧化、提升機(jī)體免疫能力的優(yōu)點(diǎn)[4-6]，還能作為替代飼用抗生素類的飼料添加劑，確保畜禽肉質(zhì)安全優(yōu)質(zhì)，顯著增強(qiáng)畜禽的抗病力。因此，在畜牧行業(yè)中綠原酸擁有廣闊的應(yīng)用前景。

1綠原酸的理化性質(zhì)

綠原酸半水合物為白色或微黃色的針狀結(jié)晶，其在110℃時(shí)會(huì)失去結(jié)晶水變?yōu)闊o(wú)水物，熔點(diǎn)為208℃。在25℃的條件下，綠原酸在水中的溶解度大約為4%。它易溶于如乙醇、丙酮和甲醇等極性溶劑，而在乙酸乙酯中的溶解度較小。同時(shí)，綠原酸難以溶解在三氯甲烷、乙醚和苯等親脂性的有機(jī)溶劑中[7]。在結(jié)構(gòu)上，綠原酸是由咖啡酸和奎尼酸結(jié)合形成的酯，其分子中包含酯鍵、不飽和雙鍵以及多元酚這三個(gè)化學(xué)性質(zhì)較為活躍的部分。因此，在從植物中提取綠原酸時(shí)，常常會(huì)因?yàn)樗夂头肿觾?nèi)酯基的遷移而導(dǎo)致綠原酸異構(gòu)化。由于綠原酸具有特定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，我們可以利用極性溶劑如乙醇、丙酮、甲醇等從植物中提取綠原酸，但綠原酸并不穩(wěn)定，所以應(yīng)避免在高溫、強(qiáng)光的環(huán)境下進(jìn)行提取，并且不要長(zhǎng)時(shí)間加熱。

2高效液相色譜法檢測(cè)混合型飼料添加劑中綠原酸的含量

綠原酸的檢測(cè)方法很多，例如應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)快速測(cè)定甜葉菊中綠原酸含量[8]，應(yīng)用HPLC-MS/MS檢測(cè)杜仲中綠原酸含量[9]，基于碳點(diǎn)為探針的熒光檢測(cè)方法測(cè)定綠原酸含量[10]等。高效液相色譜法因分離效能高、靈敏度高、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，在綠原酸檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

2.1高效液相色譜法檢測(cè)混合型飼料添加劑中綠原酸含量概述

目前，針對(duì)混合型飼料添加劑中綠原酸含量的檢測(cè)尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)室基本采用企業(yè)提供的標(biāo)準(zhǔn)，以高效液相色譜法為主。該方法在不同的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中雖不完全一致，但所采用的設(shè)備、試劑及檢測(cè)條件基本一致。

2.1.1試劑和設(shè)備

甲醇（色譜純），磷酸（優(yōu)級(jí)純），乙腈（色譜純），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥95.0%），高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器），超聲波清洗器，分析天平。

2.1.2色譜條件

色譜柱：長(zhǎng)度為250 mm、內(nèi)徑為4.6 mm的C18柱或與之相當(dāng)性能的色譜柱；流動(dòng)相組成為乙腈和0.4%磷酸溶液，比例為15∶85；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為327 nm。

2.1.3含量測(cè)定

1）標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取10 mg的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品，將稱取的標(biāo)準(zhǔn)品放入一個(gè)10 mL的棕色量瓶中，然后加入50%的甲醇溶液，使其溶解，并確保準(zhǔn)確定容，然后將量瓶中的溶液混合均勻，這樣就得到了標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。再?gòu)臉?biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液中準(zhǔn)確量取5 mL的溶液，并將其轉(zhuǎn)移到一個(gè)50 mL的棕色容量瓶中，再次使用50%的甲醇溶液，將容量瓶中的溶液稀釋至刻度線，并混合均勻，這樣就得到了用于上機(jī)分析的標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)液。

2）試樣溶液制備

稱取適量混合型飼料添加劑（約相當(dāng)于綠原酸2 mg），放入一個(gè)100 mL的棕色量瓶中，加入50%的甲醇溶液，并通過(guò)振搖使其充分溶解。待溶解完全后，使用50%的甲醇溶液將容量瓶中的溶液定容至刻線，然后將定容后的樣品充分搖勻，以確其保混合均勻。最后，通過(guò)0.45μm的有機(jī)濾膜進(jìn)行過(guò)濾灌瓶，即得試樣溶液。

3）上機(jī)測(cè)定

分別將上述標(biāo)準(zhǔn)品上機(jī)液和試樣溶液注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

4）結(jié)果計(jì)算

2.2高效液相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的優(yōu)勢(shì)

2.2.1高效液相色譜法的自身優(yōu)勢(shì)

高效液相色譜法具有分離效果好、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、定量準(zhǔn)確、選擇性好、自動(dòng)化程度高和適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)。好的分離效果可以有效地將綠原酸與其他化合物進(jìn)行分離，避免干擾物質(zhì)的影響，提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性；高靈敏度可以滿足各種不同類型樣品的分析需求；相比傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，高效液相色譜法的分析速度更快，可以在短時(shí)間內(nèi)完成大量樣品檢測(cè)，提高工作效率；高效液相色譜法可以提供準(zhǔn)確的定量結(jié)果，通過(guò)對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的峰面積，可以確定樣品中綠原酸的含量，這對(duì)混合型飼料添加劑中綠原酸的質(zhì)量控制非常重要；好的選擇性可以有效避免干擾物質(zhì)的影響，從而更準(zhǔn)確地測(cè)定綠原酸含量。

2.2.2試劑設(shè)備簡(jiǎn)單

高效液相色譜法檢測(cè)綠原酸，常用的試劑主要包括甲醇（色譜純）、磷酸（優(yōu)級(jí)純）、乙腈（色譜純）、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量≥95.0%）等，這些試劑在高效液相色譜分析中比較常用，相對(duì)容易獲取。因此，從試劑的角度來(lái)看，高效液相色譜法檢測(cè)綠原酸所用的試劑相對(duì)簡(jiǎn)單。而該方法所用設(shè)備有高效液相色譜儀（配備紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器）、超聲波清洗器、分析天平，這些設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)設(shè)備，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。

2.2.3前處理方法簡(jiǎn)單

應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中綠原酸含量的前處理方法操作簡(jiǎn)便，只需通過(guò)甲醇提取，確保充分溶解、定容準(zhǔn)確即可。全程操作簡(jiǎn)便快捷，無(wú)需凈化、衍生化等復(fù)雜的前處理過(guò)程。另外，此方法因操作步驟少也減少了處理過(guò)程中綠原酸的損失。

3高效液相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中綠原酸含量時(shí)的注意事項(xiàng)

盡管高效液相色譜法測(cè)定混合型飼料添加劑中綠原酸含量簡(jiǎn)便、易行，但忽視操作細(xì)節(jié)容易導(dǎo)致測(cè)定含量偏低、色譜峰型差、峰前延、峰拖尾甚至不出峰等情況發(fā)生。為了更好地應(yīng)用液相色譜法開(kāi)展混合型飼料添加劑中綠原酸的檢測(cè)，我們總結(jié)了以下注意事項(xiàng)。

3.1樣品的稱量

在檢測(cè)樣品過(guò)程中，稱量樣品時(shí)要注意以下幾點(diǎn)：一是精確度。稱量樣品時(shí)需要保證稱量的精確度，以避免因稱量誤差導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確。二是避免污染。需要確保樣品不被污染，這包括避免樣品受到外界物質(zhì)的干擾，如灰塵、雜質(zhì)等，同時(shí)也需要確保稱量器具的清潔和衛(wèi)生。三是稱量設(shè)備合格。一定使用檢定合格的天平，且天平放置環(huán)境的溫濕度等要符合相關(guān)規(guī)定。四是樣品均勻性。稱量前一定要充分混勻，且至少稱量?jī)山M平行樣品。

3.2色譜柱的選擇

在色譜分析中色譜柱的選擇是非常重要的。選擇適合的色譜柱需要考慮多個(gè)因素，如分離度、柱效、穩(wěn)定性、兼容性和價(jià)格等。測(cè)定綠原酸推薦使用耐酸范圍寬的C18色譜柱。一方面，該類型色譜柱穩(wěn)定性好、分離度高、柱效高；另一方面，該實(shí)驗(yàn)中采用的流動(dòng)相含有磷酸溶液，pH值在1.8左右。色譜柱選擇不當(dāng)不僅影響檢測(cè)結(jié)果，還會(huì)損壞色譜柱的填料，縮短色譜柱使用壽命。

3.3避光操作

綠原酸含有鄰二酚羥基。這個(gè)結(jié)構(gòu)使得綠原酸在受熱、遇強(qiáng)光時(shí)容易發(fā)生氧化反應(yīng)，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此該實(shí)驗(yàn)需要在避光條件下進(jìn)行。具體措施為：一是使用遮光窗簾或黑布遮蓋實(shí)驗(yàn)臺(tái)或整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，以阻擋外界光源的照射；二是在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用黑色塑料袋或黑布，將需要避光的容量瓶等容器包裹起來(lái)，以避免受到光線的影響。

3.4預(yù)防交叉污染

同一臺(tái)液相色譜儀，同一個(gè)色譜柱，如果既做綠原酸檢測(cè)又做其他樣品的檢測(cè)，需要格外注意每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的沖洗程序，建議低流速過(guò)夜清洗色譜柱，確保整個(gè)系統(tǒng)清潔完全后再進(jìn)行下一次的實(shí)驗(yàn)。

3.5質(zhì)控管理

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中很多因素會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，如儀器狀態(tài)、試劑質(zhì)量、實(shí)驗(yàn)人員的操作等。為了確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和可靠性，每次檢測(cè)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員可通過(guò)加標(biāo)回收或質(zhì)控樣的方式來(lái)確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，一旦實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題則立即進(jìn)行調(diào)整，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4結(jié)束語(yǔ)

綠原酸作為一種天然植物提取物，具有環(huán)保、可持續(xù)等特點(diǎn)。在畜牧業(yè)中應(yīng)用綠原酸，可有效減少對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)資源的浪費(fèi)，從而促進(jìn)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了更加充分地發(fā)揮綠原酸的作用和優(yōu)勢(shì)，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)研究和實(shí)踐，不斷探索更好的檢測(cè)方法、質(zhì)量控制方案及其在畜牧業(yè)中的最佳應(yīng)用方式等，以滿足畜牧業(yè)發(fā)展的多樣化需求。

【參考文獻(xiàn)】

[1]陳芳，杜恩存，樊啟文，等.綠原酸類物質(zhì)在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，59（21）：10-14.

[2]汪洪濤.綠原酸應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品，2020（2）：1-3.

[3]萬(wàn)凡，侯扶江，伊寶，等.綠原酸的生理功能及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2021（5）：2416-2427.

[4]白盼盼，張晨，徐美利，等.綠原酸類化合物的生物活性及其在畜牧生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究，2022，45（6）：127-130.

[5]李卓妮，劉峰，孔艷華，等.杜仲葉對(duì)雞增重、生化指標(biāo)及肉品質(zhì)的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（1）：85-89.

[6]宋金秋，燕麗娜，李暉，等.杜仲葉水提物對(duì)湘西土雞生長(zhǎng)發(fā)育及免疫功能的影響[J].中國(guó)飼料，2021（24）：29-32.

[7]孫陽(yáng)，黃和，胡燚.綠原酸提取純化方法的研究進(jìn)展[J].化學(xué)試劑，2017（3）：257-262.

[8]未俊峰，高偉，程遠(yuǎn)新，等.近紅外光譜技術(shù)快速檢測(cè)甜葉菊中綠原酸含量[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2023（16）：298-304.

[9]李冉，齊芪，李赟，等.HPLC-MS/MS檢測(cè)杜仲中綠原酸等4種活性成分的分析方法[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016（6）：123-129.

[10]韓竹，基于碳點(diǎn)為探針的利福平、綠原酸、Cu2+和谷胱甘肽的熒光檢測(cè)新方法研究[D].重慶：西南大學(xué)，2020.

【作者簡(jiǎn)介】

楊慧杰，女，1986年出生，高級(jí)畜牧師，碩士，研究方向?yàn)轱暳稀⑿螽a(chǎn)品檢驗(yàn)檢測(cè)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制修訂。

（編輯：李鈺雙）