miR-10b 通過激活 KLF4/Notch-1/STAT3 信號途徑加速腹主動脈瘤的進展

郭 暢，劉 欣，李妍潔，張明明

（1.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，河北 石家莊 050057；3.河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，河北 石家莊 050011）

腹主動脈瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是病變血管形成的永久性異常擴張或膨出，其血管直徑超過正常直徑的50%，多由于動脈壁先天性結(jié)構(gòu)異常或后天性病理改變，引起血管壁局部薄弱、張力減退，在血流的不斷沖擊下形成該種異常結(jié)構(gòu)［1］。研究表明，血管壁慢性炎癥、平滑肌細胞的異常增殖、凋亡、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）表達水平升高、細胞外基質(zhì)的降解等均促進AAA 病程，這些病理過程之間相互作用，共同加速AAA 的發(fā)展［2］。當前對動脈瘤的主要治療手段局限于外科手術(shù)，對于AAA 的具體發(fā)病機制尚不明確，因此探究AAA 發(fā)病機理以尋找臨床潛在治療靶點，對預(yù)防AAA 破裂、降低致死率具有重要意義［3］。

微小RNA（microRNA，miRNA）作為一類內(nèi)源性、小分子非編碼RNA 在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中起到重要作用［4］。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)miRNA已成為動脈粥樣硬化、腹主動脈瘤等心血管疾病的新的生物學(xué)標志物，與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［5］。miR-10b 在多種類型的惡性腫瘤中的作用機制被廣泛研究［6，7］，但其對AAA 的影響與致病機理鮮少研究，W?gs?ter 等［8］發(fā)現(xiàn)miR-10b 在AAA 患者血漿內(nèi)表達明顯升高，進而在動脈瘤模型小鼠中發(fā)現(xiàn)miR-10b 促進血管壁彈性蛋白降解和中性粒細胞募集進而增加主動脈破裂的風(fēng)險。目前尚缺乏對miR-10b 促進AAA 惡化的分子機制的深入研究，本文通過動物及細胞模型實驗，探討miR-10b 在AAA病理過程中的分子機制，以期為AAA 的靶向治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

水合氯醛（ST1002，華北制藥廠）；Thermo turbofect 轉(zhuǎn)染試劑（R0531）、雙熒光素酶檢測試劑盒（16161）、胎 牛 血 清（16140071）、1640 培 養(yǎng) 基（11875176）購自賽默飛世爾公司；雙熒光素酶載體psi-CHECK-2 由河北省人民醫(yī)院實驗室提供。血管 緊 張 素Ang Ⅱ（A9290）、Masson 染 色 試 劑 盒（G1340）、BCA 試劑盒（PC0020）、SDS-PAGE 凝膠試劑（P1200）、ECL 化學(xué)發(fā)光液（PE0010）購自美國索萊寶公司；佛波酯PMA（524400）購自美國Sigma公司；miR-10b mimics 及其陰性Nc 對照（杭州啟晨生物公司）；巨噬細胞CD68 多克隆抗體（BA3638）、a-SMA 抗體（BM002）以及SABC 免疫組化試劑盒（SA1055）、DAB 顯色試劑盒（AR1000）購自武漢博士德生物工程有限公司；抗體Notch1（ab52627）、MMP-2 （ab92536） 、MMP-9 （76003） 、KLF4（ab215036）、p-STAT3（ab267373）購 自Abcam 公司 ；DAPI（G1012-100 毫 升） 、BSA 試 劑（GC305006-100g）購自武漢塞維爾生物公司；KLF4抑制劑（HY12302，杭州昊鑫生物）；Notch-1 抑制劑（M04536-RVN，北京百奧萊博科技公司）；STAT3抑制劑（52926ES10，翌圣生物科技公司）；光學(xué)顯微鏡（CX21）、熒光倒置顯微鏡（型號IX71）購自日本Olympus 公司；慢病毒載體構(gòu)建相關(guān)化學(xué)物質(zhì)購自上海漢恒生物公司；凝膠成像系統(tǒng)（884-S 型，美國Bio-rad 公司）。

1.2 雙熒光素酶實驗

1.2.1 miR-10b 靶基因預(yù)測 利用生物學(xué)信息預(yù)測軟 件targetscan（http：//www.Targetscan.org）分 析結(jié)果顯示KLF4為miR-10b 的靶基因之一，miR-10b與KLF4-3′UTR 有靶向結(jié)合位點（圖1）。

圖1 miR-10b 靶向結(jié)合KLF4-3'UTR 位點Fig 1 miR-10b targets binding to the KLF4-3'UTR site

1.2.2 構(gòu)建野生型及突變型雙熒光素酶載體 從基因庫中獲取KLF4的基因序列，設(shè)計并化學(xué)合成KLF4-3′UTR 結(jié)合位點的野生型與突變型基因序列的正反鏈，并行PCR 擴增。純化PCR 產(chǎn)物后，用限制性內(nèi)切酶Xh0I.和NotI.酶切37 ℃過夜，再將雙酶切后的片段用連接酶連接到psi CHECK-2 載體特異位點，野生型標記為psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt，突 變 型 標 記 為psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-mut。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶活性檢測 自上海細胞庫購入人單核THP-1 細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清+1640 培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃、5%CO2。向?qū)?shù)期生長的THP-1 單核細胞內(nèi)加入PMA 24 小時將其誘導(dǎo)為人THP-1 巨噬細胞，繼續(xù)培養(yǎng)于配置的1640 完全細胞培養(yǎng)基中。根據(jù)Thermo turbofect 轉(zhuǎn)染試劑操作說明將雙熒光素酶 載 體 與miR-10b mimic、miRNA-Nc 共 同 轉(zhuǎn) 染至THP-1 巨 噬 細 胞，細 胞 分 組 為：（1）psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt+miR-10b Nc；（2）psi CHECK-2-KLF4-3′UTR-wt+miR-10b mimic；（3）psi CHECK-2-KLF4 -3′UTR-mut+miR-10b Nc；（4）psi CHECK -2-KLF4-3′UTR-mut+miR-10b mimic。轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2環(huán)境，48 h 后收集細胞并裂解、離心，按照雙熒光素酶檢測試劑盒操作說明規(guī)范進行，最后測定相對熒光活性。

1.3 體內(nèi)實驗

1.3.1 AAA 動物模型構(gòu)建 采用經(jīng)典血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）［9］灌注法造模：20 只apoE-/-小鼠隨機分為miR-10b 組：Ang Ⅱ（1 000 ng/kg/min）皮下緩慢泵入+含miR-10b 過表達慢病毒（1×108TU）基因尾靜脈注射，和模型組：Ang Ⅱ（1 000 ng/kg/min）皮下緩慢泵入，Ang Ⅱ持續(xù)皮下泵入28 d，另取10只同品系假手術(shù)小鼠同等劑量生理鹽水皮下泵入作空白對照。所有小鼠均從河北伊維沃生物科技有限公司購買，品系為apoE-/-雄鼠（生產(chǎn)許可證號為SCXK（冀）2020-002），平均重量（23±1）g，8～10 周齡，給予同等飼養(yǎng)條件（光照/黑暗時間每日各連續(xù)12 h，相對溫度19～25 ℃，相對濕度40%～60%，自由飲水和進食），飼養(yǎng)地點為河北省人民醫(yī)院臨床研究中心SPF 級實驗動物中心。本實驗已通過河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查，編號：（2020）科研倫審第（291）號。

1.3.2 病理學(xué)染色 所有小鼠在3%水合氯醛腹腔注射麻醉狀態(tài)下實施解剖，打開胸腔及腹腔，暴露心臟及其相連血管，將4 ℃生理鹽水勻速灌注左心室，剝離血管周圍脂肪組織及結(jié)締組織，分離出腎下腹主動脈，然后將瘤體組織及正常腹主動脈組織用4%多聚甲醛固定、梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后制作成5 μm 厚病理切片，分別行Mssson 染色、CD68+與α-SMA 免疫組化染色、MMP-2與MMP-9 熒光雙染，鏡下觀察病理學(xué)形態(tài)并拍照記錄。

1.3.3 Western-blot 檢測 將3 組小鼠的血管組織研磨成組織勻漿，離心提取蛋白，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白然后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜上，依次進行5% 脫脂奶粉2 h 封閉、滴加一抗4 ℃過夜、TBST 洗滌、滴加酶標二抗37 ℃孕育2 h，最后經(jīng)電化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)掃描顯影，顯示小鼠血管組織 中 蛋 白KLF4、Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 的表達量。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與轉(zhuǎn)染［10］THP-1 細胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化步驟同1.2.3。利用慢病毒轉(zhuǎn)染miR-10b mimic 及其陰性Nc 對照，分別為miR-10b過表達、miR-10b 正常表達的THP-1 巨噬細胞，并用100 μmol/L 的Ang Ⅱ與轉(zhuǎn)染后的THP-1 巨噬細胞作用1 h，以備藥物分組實驗。

1.4.2 THP-1 巨噬細胞分組 應(yīng)用KLF4 抑制劑、Notch-1 抑制劑、STAT3 抑制劑將細胞隨機分為：（1）Nc 組；（2）miR-10b mimic 組；（3）Nc+ KLF4 抑制 組；（4）miR-10b mimic+ KLF4 抑 制 組；（5）Nc+Notch-1 抑 制 組；（6）miR-10b mimic+ Notch-1 抑 制組；（7）Nc+STAT3 抑 制 組；（8）miR-10b mimic+STAT3 抑制組。

1.4.3 各組細胞相關(guān)蛋白量檢測 棄去細胞培養(yǎng)液并用PBS 溶液沖洗兩次，用細胞裂解液將上述8組細胞充分裂解，用刮刀及移液槍迅速將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL 離心管，離心后留取上清液-20℃保存，而后提取蛋白等步驟同1.2.3，比較各組蛋白表達水平的差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

SPSS 27.0 處理數(shù)據(jù)，定量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，顯著性水平設(shè)為P＜0.05。GrapgPad Prism 9.0 繪圖。

2 結(jié)果

2.1 雙熒光素酶活性

兩組攜帶KLF4 野生型（wt）3′UTR 載體的相對熒光活性，轉(zhuǎn)染miR-10b mimic 組的顯著低于miR-10b Nc 組（P＜0.05）；而兩組攜帶KLF4 突變型（mut）3′UTR 載體的相對熒光活性無明顯差異（P＞0.05）；同樣共轉(zhuǎn)染miR-10b mimic，轉(zhuǎn)染KLF4 突變型（mut）3′UTR 載體組細胞的相對熒光素酶活性明顯高于轉(zhuǎn)染KLF4 野生型（wt）3′UTR 載體組（圖2）。以上結(jié)果說明miR-10b 可靶向作用于基因KLF4。

圖2 雙熒光素酶相對活性分析Fig 2 Analysis of relative activities of dual luciferase enzymes

2.2 體內(nèi)實驗結(jié)果

2.2.1 病理學(xué)染色結(jié)果 Masson 染色發(fā)現(xiàn)，3 組小鼠間血管或瘤體直徑差異顯著（P＜0.05），其中miR-10b 組最寬，模型組次之，血管外壁膠原沉積量也呈上升趨勢，主動脈纖維化加重。見圖3A。

圖3 小鼠血管組織病理學(xué)染色Fig 3 Histopathologic staining of mouse blood vessels

免疫組化實驗可見，CD68+巨噬細胞數(shù)量在正常主動脈壁中較少，而動脈瘤血管壁有大量炎癥細胞積聚并浸潤，與模型組相比，miR-10b 組的這種現(xiàn)象加強了。見表1，圖3B。血管平滑肌細胞是組成動脈血管的重要成分，分為收縮型和增殖型兩種表型，正常血管以收縮型為主，維持血管的彈性與順應(yīng)性，在動脈瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，會發(fā)生兩種表型的相互轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致以α-SMA 為標志物的收縮表型平滑肌細胞數(shù)量大幅減少，繼而增加瘤體破裂的風(fēng)險［11］。本研究發(fā)現(xiàn)α-SMA 染色陽性在假手術(shù)組最高，miR-10b 組明顯減少甚至部分區(qū)域為零表達，模型組雖較miR-10b 組表達顯著性增多，但仍遠少于假手術(shù)對照組，可見miR-10b 會促進血管平滑肌細胞的凋亡。見表1、圖3C。

表1 3 組小鼠血管組織中物質(zhì)表達水平比較（±s）Tab 1 Comparison of substance expression levels in vascular tissues of three groups of mice（±s）

表1 3 組小鼠血管組織中物質(zhì)表達水平比較（±s）Tab 1 Comparison of substance expression levels in vascular tissues of three groups of mice（±s）

注：與假手術(shù)組比，aP＜0.001；與模型組比，bP＜0.001。

組別假手術(shù)組MMP-2 相對熒光強度0.21±0.04 MMP-9 相對熒光強度0.16±0.04模型組巨噬細胞陽性面積（μM2）28 667±18 031 99 001±17 652a平滑肌細胞陽性面積（μM2）176 000±13 446 86 999±9 818 a 0.62±0.03 a 0.69±0.04 a miR-10b 組176 333±15 782b 32 667±10 820 b 1.22±0.04 b 1.32±0.05 b F P 184.8 398.4 2 007 1 613＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

雙熒光染色中，MMP-2 與MMP-9 分別顯示綠色熒光和紅色熒光，熒光強度在假手術(shù)組血管中最弱，在動脈瘤組織中明顯增強，miR-10b 組最強。見表1、圖3D、3E。

2.2.2 血管組中相關(guān)蛋白表達水平 蛋白KLF4 在假手術(shù)組、模型組、miR-10b 組表達逐漸減少，蛋白Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 在3 組中呈升高趨勢，且各組間變化顯著（P＜0.001）。見圖4。

圖4 小鼠血管組織中蛋白表達水平比較Fig 4 Comparison of protein expression levels in vascular tissues of mice

2.3 各組THP-1 巨噬細胞中相關(guān)蛋白表達水平

（1）、（2）兩組細胞間，后者KLF4 表達較少、而Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 表 達 顯 著 偏多，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），這與2.2.2 的結(jié)果相符，說明miR-10b 對動脈瘤組織中相關(guān)蛋白表達有影響。見圖5。

圖5 各組THP-1 巨噬細胞中蛋白表達水平比較Fig 5 Comparison of protein expression levels in THP-1 macrophages in each group

（3）（4）組細胞與（1）（2）組細胞相比，KLF4 抑制劑抑制KLF4 表達，而Notch-1 顯著增多，間接說明KLF4 靶向下調(diào)Notch-1 的功能。見圖5A1、A2；（5）（6）組細胞與（1）（2）組細胞相比，Notch-1 被抑制而減少表達，p-STAT3 也隨之降低表達，證明Notch-1 可靶向上調(diào)p-STAT3 表達。見圖5B、B2；（7）（8）組細胞與（1）（2）組細胞相比，p-STAT3 被抑制表達，MMP-2 與MMP-9 表達量也明顯降低，可知p-STAT3 直接促進蛋白MMP-2、MMP-9 的表 達。見圖5C1，C2。

3 討論

腹主動脈進行性局部擴張超過3 cm 容易導(dǎo)致腹主動脈破裂，當前主要治療手段為手術(shù)修復(fù)，尚缺乏有效治療的藥物。雖然修復(fù)技術(shù)愈來愈成熟，但由于AAA 破裂的突發(fā)性和嚴重性，常導(dǎo)致?lián)尵葻o效而死亡［12，13］。為此，本文旨在研究動脈瘤發(fā)病的分子機制，尋找預(yù)防高風(fēng)險人群發(fā)病、延緩動脈瘤進展的藥物靶點。

AAA 發(fā)病的分子機制尚不完全清楚，炎癥被認為是 AAA 發(fā)展的核心因素，貫穿AAA 的整個病程［14］。以巨噬細胞為主的多種炎癥細胞浸潤至主動脈壁，通過細胞直接接觸或分泌細胞因子及蛋白酶，使細胞外基質(zhì)降解、血管平滑肌細胞凋亡減少，進而發(fā)生病理性血管重塑，啟動或促進AAA 的擴增［15］。miRNA 是一類高度保守的組織特異性小分子非蛋白質(zhì)編碼RNA，廣泛存在于人體各器官與組織中，參與氧化應(yīng)激和細胞自噬、增殖、凋亡等病理、生理過程［16］。相關(guān)研究表明［17］，miRNA 參與了調(diào)控AAA 的病理過程，通過靶向調(diào)節(jié)下游基因，激活內(nèi)皮和血管平滑肌細胞中的信號傳導(dǎo)，從而促進炎癥，影響動脈瘤形成。有研究人員發(fā)現(xiàn)miR-10b對動脈瘤病情發(fā)展有促進作用，本文通過生物學(xué)信息預(yù)測軟件發(fā)現(xiàn)miR-10b 與KLF4-3′UTR 有靶向結(jié)合位點，雙熒光素酶實驗進一步確定KLF4是miR-10b 的靶基因。本研究結(jié)果顯示，患有動脈瘤的小鼠動脈組織中KLF4較正常小鼠顯著減少，且隨著miR-10b 的高表達，KLF4表達下降，血管CD68+巨噬細胞浸潤增多及病變程度加重，側(cè)面說明缺乏KLF4 可能為動脈瘤惡化的危險因素。本文使用Ang Ⅱ誘導(dǎo)建立動物模型，Ang Ⅱ能募集并刺激巨噬細胞活化，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)、促進MMP 表達，引起巨噬細胞的趨化反應(yīng)，最終導(dǎo)致腹主動脈瘤形成［18］。KLF4在調(diào)節(jié)巨噬細胞極化方面起著關(guān)鍵作用，巨噬細胞KLF4 會增加其向促炎M1 樣表型極化，加重炎癥反應(yīng)和組織損傷，KLF4 對動脈瘤患者有正向保護功能［19］。

Notch-1 信號通路可通過影響血管平滑肌細胞凋亡增加收縮分化，介導(dǎo)巨噬細胞炎癥反應(yīng)參與AAA 疾病進程［20，21］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)IL-6 可上調(diào)STAT3 活性以影響蛋白水解活性巨噬細胞的積累以及MMPs 的表達，STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的信號傳導(dǎo)可 誘 發(fā) 動 脈 基 質(zhì) 蛋 白 水 解［22］。另 外，p-STAT3 是STAT3 的活化形式，在組織和細胞內(nèi)多以此種形式發(fā)揮生物學(xué)功能［23］。KLF4、Notch-1、STAT3 之間存在信號傳導(dǎo)通路的交匯［24，25］。

MMP-2 和MMP-9 作 為MMPs 家 族 中 的 重 要成員，具有水解細胞外基質(zhì)、破壞血管壁結(jié)構(gòu)完整性的能力，能導(dǎo)致血管順應(yīng)度減退、彈性降低，最終在血流沖擊下血管壁局部膨出、動脈瘤形成［26］。大動脈中膜主要由彈性膜、平滑肌和彈性纖維構(gòu)成，外膜主要是由疏松結(jié)締組織構(gòu)成，包含豐富的細胞外基質(zhì)，其中主要成分是彈性纖維和膠原蛋白，免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn)MMP-2 蛋白主要聚集于血管中膜，MMP-9 蛋白主要在血管外膜累積，二者降解血管壁重要支撐成分，造成主動脈壁逐漸變薄和過度基質(zhì)重塑，是形成病理性血管擴張的必要條件。本實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ang Ⅱ灌注后的腹主動脈瘤小鼠動脈組織內(nèi)MMP-2 和MMP-9 蛋白顯著增多，轉(zhuǎn)染miR-10b 過表達后，表達水平較模型組更高，同樣，用Ang Ⅱ刺激作用后miR-10b 組THP-1 巨噬細胞，較未轉(zhuǎn)染Nc 組的MMP-2 和MMP-9 表達量也顯著偏高，Notch-1、p-STAT3 蛋白在各組小鼠和巨噬細胞的表達趨勢與MMP-2、MMP-9 相一致，但KLF4表達趨勢則與之相反，本文研究亦證實miR-10b 對KLF4 基因具有靶向抑制作用，說明miR-10b 可能通過下調(diào)KLF4 繼而上調(diào)下游分子Notch-1、p-STAT3、MMP-2、MMP-9 的表達，促進動脈瘤的惡化。

但上述分子在AAA 組織中的上下游作用關(guān)系尚不明確，故本研究增加體外抑制實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制KLF4 表達后，Notch-1 表達量顯著上升；抑制Notch-1 表達后，p-STAT3 表達隨之顯著減少；抑制p-STAT3 的 表 達，MMP-2 與MMP-9 表 達 水 平 也 明顯減少，提示信號通路可能為KLF4/ Notch-1/STAT3，其 中KLF4 對Notch-1 靶 向 抑 制，Notch-1對STAT3 是正向促進作用，STAT3 對下游靶蛋白MMP-2 和MMP-9 亦為正向調(diào)節(jié)。動脈瘤發(fā)病機制復(fù)雜，除本文信號途徑傳導(dǎo)兩種MMPs 表達外，ERK1/2 也是其上游信號分子［27］，同時，氧化應(yīng)激也被認為是動脈瘤的發(fā)生機制之一［28］，并可作為輔助AAA 管理的新的生物學(xué)標志物［29］。

綜上所述，miR-10b 通過影響KLF4/Notch-1/STAT3 信號通路，引起動脈瘤組織中MMP-2、MMP-9 表達增加，從而加速AAA 的進程。

作者貢獻度說明：

郭暢：調(diào)研整理文獻，設(shè)計研究方案及論文框架，起草論文；劉欣、李妍潔：參與研究，實施研究過程，采集整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析；張明明：提出研究選題，獲取技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)性支持。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。