miR-301a 的上調通過PTEN/PI3K/AKT 信號軸誘導巨噬細胞M1 極化促進動脈瘤的進展

梁國新，郭 暢，唐紅悅，劉 欣，張明明

（1.華北理工大學研究生院，河北 唐山 063000；2.河北省人民醫院臨床醫學研究中心，河北 石家莊 050051；3.河北北方學院研究生學院，河北 張家口 075132；4.河北醫科大學研究生學院，河北 石家莊 050000）

腹主動脈瘤（AAA）是一種嚴重的血管疾病，定義為主動脈病理性擴張超過正常直徑50%。AAA的死亡率很高，其中主動脈破裂是主要原因之一［1］。大量研究表明，血管生成和炎癥浸潤在促進AAA的發生和發展中起著重要作用。研究表明AAA 形成的一個標志是外膜和內側動脈中炎性細胞的病理性浸潤，巨噬細胞和CD4+T 細胞在AAA 的主動脈浸潤中占主導地位［2，3］。浸潤和駐留的活化巨噬細胞通過產生促炎細胞因子（腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）［4］和基質金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）促進主動脈壁內細胞外基質降解并激活膠原蛋白酶造成彈力纖維破壞，從而造成血管壁彈性減弱最終發展成動脈瘤［5］。兩種巨噬細胞亞群參與了腹主動脈瘤的發展，促炎表型M1 負責合成促炎分子和MMP，從而促進AAA 的形成［6］；相反，M2 發揮抗炎作用，并有助于組織修復。M2 的保護特作用已被研究證實［7］。因此調控參與的巨噬細胞的表型，可以控制動脈瘤的進展。

微小RNAs（microRNAs，miRNAs）是一種長度21～24 個核苷酸、具有生物活性的內源性非編碼功能RNA 序列，它與蛋白質編碼基因3′端非翻譯區（3′-UTR）中的特定互補序列相互作用，通過抑制蛋白質翻譯或轉錄產物的降解來抑制靶基因的表達［8，9］。miR-301a 是miRNAs 家族的成員，miR-301a參與細胞炎癥、凋亡、免疫調節和血管生成等病理過程［10-12］。miRNA-301a-3p 通過靶向KLF7 增加 氧低密度脂蛋白誘導的人臍靜脈血管內皮細胞的氧化應激、炎癥和凋亡，促進動脈粥樣硬化的進展［13］。miR-301a-3p 可調節PTEN/PI3K 軸介導巨噬細胞極化［14］。然而，miR-301a 能否通過調節巨噬細胞極化促進AAA 仍有待進一步的探究，本研究旨在探索miR-301a 調節巨噬細胞極化參與AAA 進展的機制，為抑制動脈瘤的形成和進展提供新的思路。

1 對象和方法

1.1 倫理、參與者

本研究經河北省人民醫院倫理委員會批準（審批號：2020291）。組織樣本和血清來自包括；所有新發現的完整（未破裂）動脈瘤患者（n=18），接受擇期開放AAA 修補術；因動脈瘤破裂而入院的患者（n=6）；健康對照組（n=10）取選自相同年齡和性別的志愿者。組織樣本收集于手術室，在AAA患者術前和健康志愿者收集血液樣本離心獲得血清。所有參與者均已知情同意。

1.2 實驗動物、建模和分組

所有動物實驗均遵循當地動物護理和使用委員會的規定進行，并經河北省人民醫院倫理委員會批準（倫理審批號：202104）。8～10 周齡載脂蛋白E敲除小鼠（APOE-/-，C57BL/6J 遺傳背景）小鼠，體重（22±2） g，購于河北伊維沃生物科技有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（冀）2020-002。動物實驗在河北省人民醫院臨床研究中心的無特定病原體級動物房進行［實驗動物使用許可證：SYXK（冀）2020-005］，自動控制系統針對適宜小鼠生存的溫度及濕度等條件進行設定，自由進食飲水。適應性喂養后將小鼠分為兩組，一組作為AAA 模型（n=45），通過微型滲透泵（型號：1004，Alzet，CA，USA）將1 000 ng/kg/min 血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）長期注入小鼠中誘導AAA，另一組小鼠使用生理鹽水作為對照組（n=15），28 d 后，殺死模型小鼠（n=6）和對照小鼠（n=6），取出主動脈并固定24 h，然后冷凍在-20 ℃下，并抽取血液以提取血清。為了研究miR-301a 在AAA 發展中的意義，將建成AAA 模型的小鼠分為3 組，每組8 只，分組如下：對照組、agomir NC 組（用無意義片段處理的組）、miR-301a agomir 組。agomir NC 組、agomir miR-301a 組 小 鼠分別尾靜脈注射agomir NC、agomir miR-301a，劑量為0.3 mol/kg 加到0.1 mL 生理鹽水中，每周2 次注射到小鼠，第7 天收集血液并處死小鼠收集動脈標本冷凍至-80 ℃直至分析。

1.3 細胞培養和轉染

THP-1 細胞株（人單核細胞白血病細胞THP-1細胞株）購自于武漢普諾賽生命科技有限公司，培養于37 ℃、5% CO2條件下的培養瓶中，培養基為1%雙抗、10%FBS 的RPMI1640 完全培養基，將處于對數生長期的THP-1 細胞傳代傳，進行后續實驗。當細胞處于對數生長期且狀態良好時加入濃度 為100 ng/mL 的PMA，48 h 后THP-1 細 胞 成 熟為巨噬細胞，從懸浮狀態變為貼壁細胞。更換新鮮的培養基繼續培養，當細胞融合到80%左右，使用0.25%胰酶消化細胞并計數，調整THP-1 細胞密度為5×105/mL，將細胞接種于24 孔板中加入完全培養基繼續培養24 h。取50 μL OPTI-MEM 培養基稀釋1 μL Lipofec-tamineTM3000 并充分混勻，取50 μL OPTI-MEM 培 養 基 稀 釋20 pmol agomir NC /agomir 柔和混勻，在每管已稀釋的 LipofectamineTM3000 試劑中，加入稀釋的miR-301a agomir 或者agomir NC （1∶1 比例），輕柔混勻，室溫放置20 min形成復合物。100 μL 的RNA-脂質體復合物加到細胞中。37 ℃孵育細胞48 h 后分析轉染后的細胞.

1.4 生物信息學

本研究的GSE24194 數據集通過GEO 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載。使用R 軟件Edge R 包分析差異表達的miRNA，并將P＜0.05 定義為顯著差異的閾值。基于TargetScan7.2和miRWalk 數據庫預測miR-301a 的靶基因，并對靶基因進行基因本體（GO）和 KEGG 通路分析。

1.5 Western blotting

使用RIPA 裂解緩沖液（G2002，Servicebio）提取蛋白質，并在4 ℃下以12 000g離心15 min。從裂解物中提取蛋白質，使用BCA 蛋白質分析試劑盒測量其濃度，使用8%～12%分離膠進行SDS-PAGE分離，將解析的蛋白質電印跡到膜上，用5%脫脂奶封閉后，將膜與一抗4 ℃孵育過夜后，孵育二抗。采用凝膠成像儀拍照。ImageJ 軟件對免疫反應條帶進行定量。

1.6 定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）

qRT-PCR 根據試劑盒說明書進行，使用TRIzol 試劑提取總RNA，并通過分光光度法進行定量。對于miRNA 檢測，在存在莖環的情況下對1 μg 總RNA 進 行 反 轉 錄，并 使 用Bulge-LoopTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit 試劑盒進行擴增。引物序列如下：miR-301a 的上游引物：5′-CGCGCAGTGCAATAGTATGT-3′，下 游 引 物：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6 上 游 引 物：5'-CTCGCTTCGGCAGC ACA-3'，下 游 引 物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。U6 作為miR-301a 的內參。

1.7 熒光素酶活性測定

通 過TargetScan7.2（http：//www.targetscan.org/）預測miR-301a 的結合位點，構建了具有野生型或突變型PTEN 3'-UTR 的熒光素酶報告基因。根據制造商的方案，使用Lipofectamine3000（Invitrogen）將報告基因與miR-301a 模擬物或對照物共轉染THP-1 細胞，轉染后48 h，使用雙熒光素酶報道基因測定系統（Promega）測量 光素酶活性。

1.8 酶聯免疫吸附測定（ELISA）

根據制造商的試劑盒說明，使用ELISA 試劑盒檢測AAA 小鼠血清中和THP-1 細胞上清中的單核細 胞 趨 化 蛋 白-1（MCP-1）、TNF-α、IL-1β 和IL-6濃度。

1.9 統計學分析

GraphPadPrism8.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（±s）表示，夏皮羅-威爾克檢驗用于數據的正態性檢驗，然后進行方差齊性檢驗。兩組間比較選擇t檢驗；多組間采用單因素方差分析或曼-惠特尼U檢驗進行統計。皮爾遜相關系數用于衡量相關性。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-301a 在腹主動脈瘤模型中表達上調

與Control 組相比，AngⅡ誘導的AAA 組小鼠主動脈外徑明顯增加， AAA 組小鼠腹主動脈瘤發生率為66.67%（見圖1A-B）；miRNA 微陣列數據顯示miR-301a 在動脈瘤組織中表達上調（見圖1C-D）；qRT-PCR 實 驗 顯 示，與Control 組 比 較，AAA 模型組的主動脈組織miR-301a 表達顯著升高（見圖1E，t=11.56，P＜0.001）；與Control 組比較，AAA 組小鼠血清中miR-301a 表達水平顯著升高（見圖 1F，t=14.32，P＜0.001）。

圖1 miR-301a 在腹主動脈瘤中高表達Fig 1 miR-301a is highly expressed in abdominal aortic aneurysm

2.2 miRNA 靶基因的預測及其功能注釋

通過在線數據庫共篩選出59 個miR-301a 的靶基因。并明確了miR-301a 在野生型和突變型PTEN 的3'-UTR 中的結合位點（圖2A）；熒光素酶報告基因實驗發現miR-301a 過表達顯著抑制野生型PTEN 的螢光素酶活性，且差異具有統計學意義（t=14.72，P＜0.01），但miR-301a 模擬物不影響與突變型PTEN 3′-UTR 轉染的THP-1 細胞中的熒光素酶活性。此外，miR-301a 模擬物陰性對照與野生型或者突變型PTEN 3'-UTR 轉染的THP-1 細胞中，螢光素酶活性沒有變化，差異無統計學意義（t=1.56，P=0.19） （見圖2B）。接下來，GO 和KEGG數據庫對目標基因進行功能注釋。GO 顯示phosphatidylinositol 3-kinase signaling 通路被富集（見圖2C）；KEGG 途徑分析揭示了PI3K/AKT、mTOR、MAPK、FOXO 等信號通路被顯著富集（見圖2D）。

圖2 miR-30c-1-3p 靶基因的預測、GO 富集分析和KEGG 途徑Fig 2 Prediction of miR-30c-1-3p target genes， GO enrichment analysis， and KEGG pathway

2.3 miR-301a 的上調是調控巨噬細胞極化促進動脈瘤進展的關鍵分子

如圖3 所示，Western blotting 結果顯示，與Control 組 比 較，Ang Ⅱ+agomir NC 組 動 脈 組 織 中p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1β 水 平 顯 著 升 高，同 時PTEN 的表 達 降 低；與Ang Ⅱ+agomir NC 比 較，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 組p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1? 蛋白的表達水平顯著提高，同時PTEN 蛋白的表達更低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。ELISA 結果表明，與Control 比 較，AngⅡ+agomir NC 組 小 鼠 血 清 中MCP-1、TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平顯著升 高， AngⅡ+miR-301a agomir 組IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 血 清 促 炎 因 子 的 水 平 更 高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 miR-301a 是AAA 中調控巨噬細胞活化的關鍵分子Fig 3 The miR-301a is the key player in regulating activation of M1 macrophages

2.4 過表達miR-301a 激活巨噬細胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路

Western blotting 結 果 顯 示，與Control 組 比 較，Ang Ⅱ+NC agomir 組 細 胞 中p-PI3K、p-Akt、p-IKKa/b、p-NF-κB p65 磷酸化蛋白水平和iNOS、MMP9 和MCP-1 蛋白水平均顯著增加（P＜0.05），PTEN 的表達顯著降低（P＜0.05）；與AngⅡ+NC agomir 組 比 較，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 組p-PI3K、p-Akt、p-IKKa/b、p-NF-kB p65、iNOS、MMP9 和MCP-1 蛋 白 水 平 顯 著 上 調（P＜0.05），PTEN 的下調更顯著（P＜0.05），但這種調節作用可被PI3K 抑 制 劑LY294002 顯 著 逆 轉（P＜0.05）。見圖4。

圖4 過表達miR-301a 激活巨噬細胞中PI3K/AKT/NF-κB 信號通路Fig 4 Overexpression of miR-301a activates PI3K/AKT/NF-κB in macrophages signal pathway

2.5 miR-301a 過表達對AngⅡ處理的THP-1 細胞中炎癥因子水平的影響

如 圖5 所 示，ELISA 結 果 顯 示，與Control 組 相比，Ang Ⅱ+NC agomir 組 上 清 液 中IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 的水平均顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ+NC agomir 組 比 較，Ang Ⅱ+miR-301a agomir 組上述炎癥因子的表達水平更高（P＜0.05）；而PI3K 抑制劑LY294002 可以逆轉上述由miR-301a 過表達引起的AngⅡ誘導的THP-1 細胞中IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 的 水 平 變 化（P＜0.05）。

圖5 miR-301a 過表達對AngⅡ刺激的THP-1 細胞IL-1β、IL-6、MCP-1 及TNF-α 水平的影響Fig 5 Effect of miR-301a overexpression on IL-1β， IL-6， MCP-1 and TNF-α levels in AngII-stimulated THP-1 cells

2.6 AAA 血 清 中miR-301a 和MMP 的 水 平 升 可 預測腹主動脈瘤破裂的風險

與對照組（1.70±0.18）相比，URAAA（4.21±0.85）和RAAA（5.51±0.46）組患者的動脈最大直徑增大（見圖6A，t=14.10，t=19.25，t=4.347，P＜0.05）；患者血清的MMP9 血清結果顯示，與對照組（147.5±32.28）相 比，URAAA（423.7±64.22）和RAAA（543.2±49.39）組血清中miR-301a 濃度遞增高（見 圖6B，q=19.12，q=20.92，q=6.92，P＜0.05）；患者樣本的miR-301a 血清結果顯示，與對照組（0.39±0.09）相 比，URAAA（0.91±0.14）和RAAA（1.33±0.31）組中miR-301a 血清濃度遞增（見 圖6C，t=11.83，t=7.322，t=3.241，P＜0.05）；雙變量相關分析顯示，腹主動脈瘤患者miR-301a 水平與主動脈最大直徑呈正相關（圖6D，r=0.682，P＜0.001），與MMP9 表 達 呈 正 相 關（圖6E，r=0.727，P＜0.01）；MMP9 水平與主動脈最大直徑呈正相關（圖6F，r=0.656，P＜0.001）；受試者工作特征（ROC）曲線分析顯示最大直徑、MMP9 和miR-301a 的曲線下面積（AUC）依次為87.96%（95%CI，71.50%～100%）（ 圖 6G，P＜0.05）；94.44%（95%CI，85.47%～100%）（ 圖 6H，P＜0.01）；92.59%（95%CI，81.38%～100%）（圖6I，P＜0.05）。

圖6 AAA 患者miR-301a 表達上調Fig 6 miR-301a is upregulated in AAA patients

3 討論

AAA 是一種嚴重的遲發性血管疾病，死亡率很高［15］。因此迫切需要尋找針對該病的有效防治措施。如前所述，miRNAs 已被證明是心血管系統生理穩態的重要調節因子［16，17］。使用高通量技術研究AAA 小鼠模型差異表達的miRNAs，發現miR-301a 是AAA 組織中一種新的上調miRNA。已有研究表明miR-301a 與免疫反應、炎癥、腫瘤和血 管 生 成 密 切 相 關［12，18，19］，并 在 動 脈 粥 樣 硬 化 中 起重要作用。然而，miR-301a-3p 促進AAA 進展的機制尚不清楚。本研究建立體內、體外模型、發現miR-301a-3p 在AAA 組織和THP-1 細胞中上調并與動脈瘤的直徑呈正相關。此外使用生物信息學分析了miR-301a 促進動脈瘤進展的機制，研究結果表 明，miR-301a 通 過PTEN/PI3K/AKT 信 號 通 路誘導巨噬細胞向M1 極化，促進動脈瘤的進展。

AAA 的形成和發展是可逆的過程，動脈瘤的發生是一個復雜的過程，涉及多個因素的相互作用。這些因素包括動脈壁的結構異常、缺血和營養不足、高血壓以及感染和炎癥等。其中巨噬細胞極化起著至關重要的作用［20，21］。巨噬細胞作為機體免疫系統的重要組成部分，在慢性和急性炎癥中都能發揮重要的作用，巨噬細胞通過分泌TGF-β 和IL-10等抑制性細胞因子下調免疫反應從而有效控制炎癥［22］。miR-301a 在機體內包括巨噬細胞在內的各種組織細胞中廣泛表達。巨噬細胞能促進動脈粥樣硬化的形成和發展［23］。有研究證實miR-301a 能夠引起慢性炎癥［11］，miR-301a 可能參與AAA 的形成和發展，并與巨噬細胞的炎癥有關。GO 和KEGG 通路分析顯示miR-301a 靶標在PI3K/AKT、mTOR、NF-κB 和MAPK 等與炎癥相關的信號通路中富集。PTEN/PI3K/AKT 途徑在巨噬細胞極化中起重要作用，機制可能是因為NF-κB 是PI3K/AKT 信號下游的關鍵分子。而NF-κB 通路的激活與炎癥反應密切相關，并在小膠質細胞M1 極化的病理學中發揮關鍵作用［24］。本研究顯示，miR-301a上 調 p-PI3K、p-AKT、CD68、iNOS、MMP9、MMP2、VEGFA 和TGF-1β 水 平，參 與 巨 噬 細 胞M1 極化，促進血管生成及動脈瘤的進展。大量研究表明，慢性炎癥及動脈壁細胞外基質的病理性重構可能是動脈瘤發生和進展的重要機制。比如，各種炎性細胞的浸潤促進了MMPs 的分泌，尤其是MMP9 的分泌，導致動脈管壁彈力纖維和膠原纖維的損傷而發病。而在浸潤的炎性細胞中，以巨噬細胞的作用最為突出，巨噬細胞數量的增加可能導致MMP2 和MMP9 水平增加，從而導致動脈血管周圍膠 原 纖 維 的 破 壞［25，26］。monocyte chemotactic protein-1，MCP-1 對巨噬細胞的浸潤有著重要的調節作用，核轉錄因子（nuclear factor κB，NF-κB）則在轉錄水平調控了MCP-1 等促炎癥基因的表達［27］。本研究發現miR-301a 升高增強了巨噬細胞中MMPs的表達，隨后導致巨噬細胞滲透［28］。此外，還發現AAA 小 鼠 和 轉 染 miR-301a 模 擬 物 的THP-1 細 胞中的炎癥因子顯著增加，表明miR-301a 的過度表達促進了炎癥因子的釋放和主動脈彈性蛋白的降解和破壞，從而導致增加AAA 的易感性。此外，使用PI3K 抑制劑能抑制巨噬細胞的極化。在AAA 進展過程中，miR-301a 表達升高并能抑制PTEN 表達，調控PI3K/AKT/NF-κB 信號通路促進巨噬細胞極化加速動脈瘤的進展。 此外本研究評估了miR-301a 和MMP9 在動脈瘤中的診斷價值，發現miR-301a 和MMP9 的水平能夠很好的預測動脈瘤的破裂風險，是一種無創的潛在標志物。

總之，本研究表明，miR-301a 可以通過PI3K/AKT/NF-κB 信號通路調節巨噬細胞極化，參與AAA 中的炎癥反應和血管生成，加速動脈瘤的進展。miR-301a 及其靶點為限制AAA 的形成提供了治療思路。

作者貢獻度說明：

張明明：構思該研究的思路；張明明、梁國新：實驗方案設計；梁國新、劉欣、郭暢和唐紅悅：進行實驗；梁國新：進行初步的數據分析；郭暢、唐紅悅：參與臨床資料和樣本的收集工作；梁國新：起草手稿；張明明和梁國新：數據分析，并撰寫手稿，所有作者都批準了最后的手稿。

所有作者聲明不存在利益沖突關系。