液質(zhì)串聯(lián)測(cè)銀耳及其銀耳制品中米酵菌酸含量

米酵菌酸（Bongkrekic acid，簡(jiǎn)稱BA），分子式C28H38O7，是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種產(chǎn)生的一種會(huì)引起食物中毒的毒素。2012年，山東省臨沂市發(fā)生了一起食物中毒事件，患者表現(xiàn)為惡心、嘔吐、乏力、精神不振等癥狀，隨后在剩余的銀耳中檢測(cè)到了米酵菌酸。米酵菌酸具有很強(qiáng)的生物活性，高溫不易殺死，且易吸附于活性炭，是會(huì)導(dǎo)致銀耳中毒的病原菌產(chǎn)生的毒素之一。米酵菌酸有脂溶性，易溶解于乙腈、甲醇等有機(jī)溶劑。我國(guó)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中米酵菌酸的測(cè)定》（GB 5009.189-2016）中規(guī)定使用高效液相色譜法，但前處理中的液液萃取法較為復(fù)雜，消耗時(shí)間太長(zhǎng)，且三氯甲烷具有毒性，不利于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。目前，雖然出現(xiàn)了超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的新方法，但尚未有相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)銀耳基質(zhì)進(jìn)行較為簡(jiǎn)單的檢測(cè)。因此，本文探索使用LC-MS測(cè)定銀耳（干制品）中的米酵菌酸含量，以期獲得簡(jiǎn)便、靈敏、快速、可靠、重現(xiàn)性好，能用于銀耳及其銀耳制品中米酵菌酸檢測(cè)的方法。

1.1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器與器材

Agilent1290-6470三重四極桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；AllegraX-15R離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；YB-502N電子天平，上海海康電子儀器廠；VXR振蕩器，IKA公司；50mL的FALCON離心管；有機(jī)系0.22μm濾膜。

1.1.2試劑

乙腈（色譜純）OMNI（批號(hào)：230101011M04）；氯化鈉（分析純）天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司（批號(hào)：20180113）；鹽酸（分析純）西隴科學(xué)股份有限公司（批號(hào)：200720）；米酵菌酸TMstandard（含量：97.5%）（批號(hào)：722206-100μg/G23080131）。

1.1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取5.128mg米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品，加乙腈溶解并定容至100mL，此時(shí)，米酵菌酸濃度為50μg/mL。

1.1.4色譜條件

儀器：三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent1290-6470；色譜柱：ACE C18-AR 50×2.1mm；流動(dòng)相：A相—乙腈；B相—蒸餾水。梯度洗脫程序：前0.5分鐘20%A，0.5到1.50分鐘A由20%變成80%，1.5到2.00分鐘80%A；流速：0.35mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：2.00μL。

1.1.5質(zhì)譜條件

檢測(cè)方式MRM；離子源AJS ESI－；霧化器壓力25psi；干燥器溫度150℃；干燥器流速18L/min；毛細(xì)管電壓3000V；鞘氣溫度150℃；鞘氣流速12L/min；加速電壓3V；母離子（m/z）：485.6；子離子（m/z）：441.1（定量離子）/397.3/321.2/153.0；裂解電壓/V：130/130/130/130；碰撞能量/V：13/13/25/35。

1.2方法

1.2.1樣品前處理

1.2.1.1采用GB 5009.189-2016中的液液萃取法

前處理：稱取20g（精確至0.01g）置于具塞錐形瓶中，加入20mL甲醇，室溫下避光浸泡1h，再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液（45.4%）。將上述濾液分別移入150mL分液漏斗中，加入與濾液等體積的碳酸氫鈉溶液（40g/L），振搖2min，靜置待分層后，取出下層于另一分液漏斗中；接著，用碳酸氫鈉溶液（40g/L）10mL重復(fù)提取兩次，輕搖；將三次提取的碳酸氫鈉溶液合并，加入25mL三氯甲烷，振搖2min，靜置分層后棄去三氯甲烷，于分液漏斗中慢慢加入鹽酸溶液（6mol/L）調(diào)該溶液pH至2-3，之后加入石油醚50mL，振搖3min，靜置分層，取出石油醚層于旋蒸瓶中，再分別用石油醚30mL和20mL各提取一次，將石油醚層并入同一瓶中，于40℃±0.5℃水浴中旋蒸濃縮至干，接著用少量甲醇分次將旋蒸瓶中的提取物溶解并轉(zhuǎn)移至5.0mL的玻璃離心管或濃縮瓶中，于40℃±0.5℃下氮吹濃縮至干，最后加入0.5mL甲醇，渦旋溶解，混勻，經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)行HPLC分析。方法檢出限為0.005μg/g，定量限為0.015μg/g。

1.2.1.2改進(jìn)方法

前處理：精確稱取20.00g（精確至0.01g），置于50mL具塞塑料離心管中，加入20mL乙腈，室溫下避光浸泡1h，加入0.1mL鹽酸，3.00g氯化鈉，使用振蕩器振搖5.5min，靜置，接著以7500r/min離心6min，取適量上清液經(jīng)0.22μm有機(jī)系濾膜過濾，待三重四級(jí)桿液相質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent1290-6470測(cè)定，色譜及質(zhì)譜條件如1.1.4、1.1.5設(shè)定。

1.2.2配制標(biāo)準(zhǔn)曲線系列溶液

分別稱取25.0μL、50.0μL、100.0μL、250μL、500μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（50μg/mL）于5mL容量瓶中，加乙腈稀釋并定容至5.00mL，此時(shí)，米酵菌酸濃度為0.25μL/mL、0.50μL/mL、1.00μL/mL、2.50μL/mL、5.00μL/mL。

1.2.3樣品的測(cè)定

按照國(guó)標(biāo)方法：取街市上購買的銀耳（干制品）3批，編號(hào)為T1-1、T2-1、T3-1，按照GB 5009.189-2016測(cè)定，結(jié)果顯示均未檢出。

按照改進(jìn)方法：取街市上購買的銀耳（干制品）（廠家與國(guó)標(biāo)方法的廠家一致）3批，編號(hào)為T1-2、T2-2、T3-2，按照改進(jìn)方法進(jìn)行提取測(cè)定，結(jié)果顯示均未檢出。

2.結(jié)果與分析

2.1前處理方法的優(yōu)化

與國(guó)標(biāo)方法相比，本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟較為簡(jiǎn)單，方便操作，耗時(shí)短，能顯著提高實(shí)驗(yàn)效率。使用國(guó)標(biāo)方法檢測(cè)時(shí)，銀耳（干制品）浸泡后基質(zhì)過于粘稠，在凈化的步驟中經(jīng)過多次稀釋，仍無法通過柱子，耗時(shí)長(zhǎng)，效率低。在改進(jìn)方法中，用乙腈作為萃取劑，可以直接將米酵菌酸目標(biāo)物提取出來到乙腈層，省略國(guó)標(biāo)中過柱子的煩瑣過程，大大節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。

2.2線性

取米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在上述色譜-質(zhì)譜條件下進(jìn)行檢測(cè)分析，作米酵菌酸濃度-響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)，以響應(yīng)值Y為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)作線性回歸，得到如下回歸方程：Y=252711X-54963，R2=0.9962。因此，米酵菌酸的濃度在0.25-5.00μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.3檢出限

稱取5g已知不含米酵菌酸的銀耳（干制品）空白樣品，精密吸取160.0μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)液S2（0.50μg/mL）按照1.2.1.2的改進(jìn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)按照上述色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定，將3倍信噪比（S/N=3）作為檢出限的最低響應(yīng)值，由儀器得出的信噪比為7.2，可以滿足檢測(cè)要求。該條件下的檢出限為0.004μg/g，可以滿足國(guó)標(biāo)方法檢出限0.005μg/g的要求。

2.4儀器精密度

取濃度為5.00μg/mL的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，響應(yīng)值分別為1208108.780、1214873.017、1198420.799、1208523.953、1203241.138，RSD為0.5%，由此可見，該儀器的準(zhǔn)確性較高。

2.5重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在已知不含米酵菌酸含量的6份銀耳（干制品）（20g）中分別加入200.0μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（50μg/mL），按1.2.1.2的前處理方法進(jìn)行提取，此時(shí)樣品中含米酵菌酸0.50μg/mL，接著以1.1.4和1.1.5的色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行米酵菌酸的測(cè)定。結(jié)果顯示，6份試樣中米酵菌酸的最終濃度平均值為0.5033，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.5%。由此可見，本檢測(cè)方法穩(wěn)定可行、重復(fù)性好，具體結(jié)果見表1。

2.6回收率試驗(yàn)

在已知不含米酵菌酸含量的樣品中采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，稱取9份銀耳（干制品）試樣各20g，將9份試樣分成低（編號(hào)：A-1，A-2，A-3）、中（編號(hào)：B-1，B-2，B-3）、高（編號(hào)：C-1，C-2，C-3）三個(gè)水平，分別加入120.0μL、360μL、1200μL的米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（50μg/mL），按照1.2.1.2的操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后在上述1.1.4和1.1.5的液相-質(zhì)譜條件下測(cè)定米酵菌酸的含量，同時(shí)按外標(biāo)法進(jìn)行定量，計(jì)算加標(biāo)回收率。最終數(shù)據(jù)表明，此方法的加標(biāo)回收率在98.4%-102.9%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.6%-0.8%之間，這說明此檢測(cè)方法可行，檢測(cè)結(jié)果可靠，具體結(jié)果見表2。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取不含米酵菌酸含量的樣品20g，加入120.0μL米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（50μg/mL），按照1.2.1.2的操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)在1.0h、4.0h、8.0h三個(gè)不同的時(shí)間間隔點(diǎn)按1.1.4和1.1.5的液相-質(zhì)譜條件測(cè)定米酵菌酸的含量。結(jié)果顯示，1h、4h、8h后的測(cè)得值分別為0.3002μg/mL、0.2998μg/mL、0.2996μg/mL，相應(yīng)的相對(duì)偏差（RAD）為0.07%、0.04%、0.10%，這說明此檢測(cè)方法穩(wěn)定性好，檢測(cè)結(jié)果可靠。

2.8空白試驗(yàn)

空白試驗(yàn)是在不加入樣品的情況下按1.2.1.2處理。結(jié)果顯示未檢出且在出峰時(shí)間段基線平衡，這說明空白對(duì)本試驗(yàn)不會(huì)造成影響。

結(jié)論

銀耳（干制品）作為日常食品，對(duì)于采用控制產(chǎn)品質(zhì)量的定量分析的簡(jiǎn)便方法十分有必要，而銀耳（干制品）使用國(guó)標(biāo)方法浸泡后，基質(zhì)過于黏稠，多次稀釋仍無法過濾且耗時(shí)長(zhǎng)，因此，本研究采取了測(cè)定銀耳（干制品）中米酵菌酸含量的快速檢測(cè)方法。本改進(jìn)方法在試驗(yàn)時(shí)，不受銀耳浸泡后基質(zhì)過于黏稠的影響。在改進(jìn)方法中，使用氯化鈉降低米酵菌酸在水中的溶解度，使乙腈和水分層，然后用鹽酸使樣品溶液酸化，以乙腈作為萃取溶劑。結(jié)果數(shù)據(jù)表明，本文方法在0.25-5.00μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系呈良好，相關(guān)系數(shù)R為0.998，回收率在98.4%-102.9之間，回收率的RSD在0.6%-0.8%之間，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RAD在0.07%-0.10%之間，重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為0.5%。同時(shí)，本方法的檢出限為0.004μg/g，符合國(guó)標(biāo)要求。由此可見，本方法有較高的精確度和可靠性。