六堡茶中茶多糖的含量測定分析

1.前言

黑茶屬于后發(fā)酵茶，是中國六大茶之一，主要分為湖南黑茶、廣西六堡茶、安徽古黟安茶、云南普洱茶等。其中，六堡茶的產(chǎn)制歷史可追溯到1500多年前，其以湯色紅濃透亮，香氣陳醇，滋味醇厚回甘聞名，也是國家地理標(biāo)志產(chǎn)品之一。

茶多糖作為一種功效性成分，其為酸性多糖，主要成分有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖等，研究發(fā)現(xiàn)其具有降血糖、抗氧化、降血脂、增強(qiáng)免疫力等功效。而研究表明，黑茶的茶多糖遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于紅茶和綠茶，其在后發(fā)酵期間茶多糖的含量會有所增加，因此，對六堡茶中茶多糖的含量進(jìn)行分析研究具有深遠(yuǎn)意義。

邱思綺等人的研究明確了六堡茶多糖中含有中性糖和糖醛酸蛋白質(zhì)和多酚，但由于茶多糖在提取過程中受顏色的影響較大，因此，目前多用苯酚-硫酸法測定六堡茶的茶多糖，多用蒽酮-硫酸法測定烏龍茶、綠茶等的茶多糖。本試驗主要對苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法測定六堡茶茶多糖的最大吸收波長、曲線線性、樣品茶多糖含量、2h內(nèi)吸光度穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率和精密度等方面進(jìn)行研究分析。

2.材料與方法

2.1材料與儀器

試驗材料：六堡茶，購自梧州市天譽(yù)茶業(yè)、廣西梧州茶廠、廣西梧州茂圣茶廠等。

試驗儀器：紫外可見分光光度計（X-7），購自上海元析儀器有限公司；電子天平（Quintix224-1 CN），購自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S8），購自金壇市精達(dá)儀器制造有限公司；高性能通用臺式離心機(jī)（AllegraX-15R），購自美國貝克曼公司。

試驗試劑：無水葡萄糖（AR），購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；蒽酮（AR）、無水乙醇（AR）、丙酮（AR）、正丁醇（AR），購自成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙醚（AR）、三氯甲烷（AR），購自西隴科學(xué)；苯酚（AR），購自麥克林；濃硫酸（GR），購自西隴科學(xué)。

2.2溶液配制

0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：先將無水葡萄糖在105℃干燥箱干燥，恒重后精密稱取100mg，用水溶解并定容至1000mL。

5%苯酚溶液配制：稱取5g苯酚，溶于100mL水中。

0.2%蒽酮溶液配制：稱取0.4g蒽酮，溶于200mL濃硫酸中現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3方法

2.3.1茶多糖提取方法

準(zhǔn)確稱取1g經(jīng)粉碎過篩的茶葉，加入15mL水，在70℃的水浴下提取2h后，過濾，潤洗殘渣2遍，濾液一并收集后用旋蒸儀濃縮至大約10mL，加入無水乙醇至50mL，沉淀24h后，轉(zhuǎn)移至50mL離心管，在4750r/min離心5min后棄去上清液。將沉淀用水重新進(jìn)行復(fù)溶，并定容至40mL，加入1∶1的Sevag試劑，振搖20min，靜置分離。收集上清液后定容至50mL，搖勻后精密移取1mL至10mL容量瓶中，并用水定容至刻度，此為樣品茶多糖溶液。

2.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

2.3.2.1苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于0.000mg，0.010mg，0.020mg，0.040mg，0.060mg，0.080mg，0.100mg葡萄糖）于7支10mL比色管中，用水定容至1mL，再依次加入1mL5%苯酚溶液及5mL濃硫酸，每個試劑加入后都應(yīng)充分混勻。用渦流均勻器混勻后放置5min后，置于100℃水浴下加熱15min，取出放冷。以0管為參比，以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2.2蒽酮-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

精密吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于0.000mg，0.010mg，0.020mg，0.040mg，0.060mg，0.080mg，0.100mg葡萄糖）于7支10mL比色管中，用水定容至1mL，分別加入0.2%蒽酮溶液3mL，搖勻后置于100℃水浴下加熱10min，取出冷卻，以0管為參比，以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3測定波長的確定

2.3.3.1苯酚-硫酸法波長的確定

精密移取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL及樣品茶多糖溶液1.0mL，分別置于10mL比色管中，按2.3.2.1自“用水定容至1mL……”起進(jìn)行操作，測定。

以試劑空白和樣品空白為參比，于400-700nm間進(jìn)行掃描，取兩者最大吸收波長。

2.3.3.2蒽酮-硫酸法波長的確定

精密移取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL及樣品茶多糖溶液1.0mL，分別置于10mL比色管中，按2.3.2.2自“用水定容至1mL……”起進(jìn)行操作，測定。

以試劑空白和樣品空白為參比，于400-700nm間進(jìn)行掃描，取兩者最大吸收波長。

2.3.4樣品茶多糖的測定

精密移取樣品茶多糖溶液1mL，分別按2.3.2.1、2.3.2.2自“用水定容至1mL……”起進(jìn)行操作，測定。

2.3.5穩(wěn)定性實(shí)驗

精密吸取1mL樣品茶多糖儲備液，分別按2.3.2.1、2.3.2.2自“用水定容至1mL……”起進(jìn)行操作，測定。

在2h內(nèi)每30min對其進(jìn)行吸光度測定，重復(fù)3次，考察其穩(wěn)定性。

2.3.6加標(biāo)回收率的測定

精密吸取樣品茶多糖儲備液0.5mL，準(zhǔn)確加入0.4mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按2.3.2.1、2.3.2.2自“用水定容至1mL……”起進(jìn)行操作，測定含量，算出回收率。同時每個樣品連續(xù)測定5次，用于計算方法精密度。

3.結(jié)果與分析

3.1原理

3.1.1苯酚-硫酸法原理

經(jīng)過處理的試樣的糖經(jīng)提取后，用硫酸對試樣的多糖進(jìn)行脫水，生成糠醛或其衍生物。生成物與芳香族酚類化合物縮合生成黃色物質(zhì)。

3.1.2蒽酮-硫酸法原理

經(jīng)過處理的試樣的糖經(jīng)提取后，用硫酸對試樣的多糖進(jìn)行水解，脫水成為葡萄糖，在加熱和酸性條件下與蒽酮結(jié)合成藍(lán)綠色化合物。

3.2吸收波長的比較及確定

精密移取0.1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL及樣品茶多糖溶液1.0mL，分別按2.3.3.1、2.3.3.2操作，在波長400-700nm區(qū)域內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，觀察兩者最大吸收峰所在的波長。對掃描結(jié)果進(jìn)行比較可以得出，六堡茶茶多糖在苯酚-硫酸法實(shí)驗中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在485nm有最大吸收峰，而六堡茶的茶多糖樣品溶液在482nm處有最大吸收峰，無其他干擾峰的存在，說明該方法以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品是可靠的。兩者的最大吸收峰的波長基本一致。故本方法采用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的最大吸收峰的波長485nm作為最大吸收波長。

六堡茶茶多糖在蒽酮-硫酸法實(shí)驗中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在592nm，431nm處有較高的吸收峰，六堡茶茶多糖樣品溶液在584nm，429nm波長處出現(xiàn)較高的峰值，但由于干擾峰較多，最后參考現(xiàn)有研究決定選擇波長590nm作為最大吸收波長。

兩種方法相比較，苯酚-硫酸法峰值明顯，且無干擾峰，測定準(zhǔn)確性較高。

3.3線性比較

以葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作線性回歸。苯酚-硫酸法測定茶多糖的回歸方程為c=0.104*A-0.001，相關(guān)系數(shù)R=0.999580，蒽酮-硫酸法測定茶多糖的回歸方程為C=0.122*A+0.001，相關(guān)系數(shù)R=0.999266，兩種方法在濃度為0.01-0.1mg濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

3.4六堡茶茶多糖含量的比較

將樣品茶多糖的測定結(jié)果（吸光度）分別代入兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線，再分別算出其樣品茶多糖含量，兩法測定六堡茶茶多糖含量的測定數(shù)據(jù)如表1，兩種方法的重復(fù)性RSD（%）均小于10%，在允許的誤差范圍內(nèi)，這說明兩種方法的重復(fù)性較好，且有較好的重現(xiàn)性；而苯酚-硫酸法的RSD（%）要較蒽酮-硫酸法小，這說明測定結(jié)果該法測定六堡茶的重復(fù)性更好。

3.5穩(wěn)定性的比較

每30min對樣液茶多糖進(jìn)行吸光度測定，持續(xù)2h，結(jié)果如表2。結(jié)果表明，苯酚-硫酸法的穩(wěn)定性較好，2h內(nèi)吸光度變化值的RSD為1.1%，較為平穩(wěn)，而蒽酮-硫酸法穩(wěn)定性不如苯酚-硫酸法，2h內(nèi)有明顯下降，RSD為8.5%，但在1h內(nèi)穩(wěn)定性并沒有特別明顯的下降。

3.6精密度及加標(biāo)回收率比較

如表3所示，苯酚-硫酸法測定樣品平均回收率為100.1%，RSD為1.8%；蒽酮-硫酸法測定樣品平均回收率為102.6%，RSD為5.7%；兩種方法的加標(biāo)回收率都符合要求，由表3數(shù)據(jù)可知苯酚-硫酸法的精密度更好。

結(jié)論

本試驗用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法測定不同六堡茶樣品，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別從兩種方法的最大吸收波長、曲線線性、樣品茶多糖含量、2h內(nèi)吸光度穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率、精密度等方面進(jìn)行了相關(guān)比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法的線性關(guān)系良好，重復(fù)性、2h內(nèi)吸光度穩(wěn)定性、加標(biāo)回收率、精密度都有較好的表現(xiàn)。但相比較而言，苯酚-硫酸法的最大吸收峰值明顯，重復(fù)性更好（RSD最高為4.9%），2h內(nèi)吸光度穩(wěn)定性更佳（RSD為1.1%），精密度更高（RSD為1.8%）。從樣品茶多糖含量的數(shù)據(jù)來看，蒽酮-硫酸法測得的數(shù)據(jù)要高一些，雖然苯酚-硫酸法反應(yīng)劇烈，蒽酮-硫酸法的安全系數(shù)會相對更高，但綜合所有數(shù)據(jù)來看，苯酚-硫酸法更適合用于六堡茶茶多糖的測定。