假儉草WRKY家族基因鑒定及其響應干旱脅迫表達分析

摘要：WRKY家族是高等植物特有且最大的一類轉錄因子。本研究利用生物信息學技術，在假儉草（Eremochloa ophiuroides（Munro.））全基因組中鑒定92個WRKY家族基因，命名為EoWRKY1～EoWRKY92，分布在9條染色體上。對其序列特性、基因結構、順式作用元件等進行分析，并基于假儉草相關轉錄組數據，分析了EoWRKYs在干旱脅迫下的表達模式，最后基于qRT-PCR解析其在干旱脅迫下的瞬時表達特征。結果表明：根據系統發育特征可將EoWRKYs分為三組，Group Ⅰ含有完整的WRKY結構域和鋅指基序，Group II～III存在結構域和鋅指基序丟失和變異現象。EoWRKYs在干旱脅迫下的轉錄組分析結果表明：在假儉草葉片和根干旱脅迫不同時期，各基因表達量存在差異。qRT-PCR結果表明：干旱處理不同時間后，EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和 EoWRKY2在脅迫下表達量顯著升高，具有正向調控作用；EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60表達量下降，這8個基因在干旱脅迫下表達量顯著變化，與轉錄組數據一致。本研究為假儉草WRKY轉錄因子的進一步功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：假儉草；WRKY基因家族；生物信息學；干旱脅迫

中圖分類號：Q945.78""" 文獻標識碼：A"""" 文章編號：1007-0435（2024）05-1378-14

Identification of the WRKY Family Genes and thier Expression Analysis in

Response to Drought Stress in Centipedegrass

YU Yuan-ping1，2， JIANG Yu-jia1，2， SUN Xiang-yi1，2， WU Chun-yan1，2， ZHOU Min1，2， LIU Ming-xi1，2*

（1. Department of Pratacultural Science， College of Agronomy， Hunan Agricultural University， Changsha，

Hunan Province 410128， China; 2. Hunan Grassland Research Center， Changsha， Hunan Province 410128， China）

Abstract：The WRKY family is the unique and the largest class of transcription factors in higher plants. In this study，92 WRKY family genes，named EoWRKY1～EoWRKY92，were identified in the whole genome of centipedegrass by bioinformatics method. The sequence characteristics，gene structure and cis-regulatory element of EoWRKYs were analyzed，and the expression patterns of EoWRKYs under drought stress were analyzed based on their relevant transcriptome data. qRT-PCR was used to analyze their transient expression under drought stress. The results show that EoWRKYs can be divided into three groups according to their phylogenetic characteristics. Group I contains a complete WRKY domain and a zinc finger motif，which were deleted or changed in Group II and Group III. The results of transcriptome analysis of EoWRKYs under drought stress showed that there were differences in gene expression in leaves and roots during different drought stress stages. qRT-PCR results showed that the expression level of EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30 and EoWRKY2 was significantly increased under drought stress，while the expression level of EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9 and EoWRKY60 was decreased under drought stress. The expression levels of these 8 genes changed significantly under drought stress，which was consistent with the transcriptome data. This study provides a basis for further functional studies of the WRKY transcription factor in centipedegrass.

Key words：Centipedegrass；WRKY gene family；Bioinformatics；Drought stress

WRKY家族是高等植物特有且最大的一類轉錄因子，由其N端具有高度保守的WRKYGQK的核心基序而命名，該基序中氨基酸W，R和K是高度保守的，其中存在氨基酸殘基替換突變體［1］。在WRKY結構域的C端有兩種類型的鋅指結構［2］，分別是C2HC （C-X7-C-X23-HX-C），C2H2（C-X4-5-C-X22-23H-X-H），根據WRKY結構域的數目和鋅指結構特征，將WRKY家族分為三個亞家族，即Group I～III。首個WRKY轉錄因子在甘薯（Dioscorea esculenta）中鑒定［3］，越來越多的WRKY轉錄因子在不同的植物中挖掘，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）［4］、水稻（Oryza sativa）［5］、香樟（Cinnamomum camphora）［6］、紅麻（Hibiscus Cannabinus）［7］、綠豆（Vigna radiata）［8］等。有許多研究表明，WRKY轉錄因子在響應植物非生物脅迫反應中發揮重要作用。李紅等［9］在紫花苜蓿（Medicago sativa）中鑒定出一個WRKY基因能夠響應蘇打鹽堿脅迫。MsWRKY33轉錄因子通過正向調控MsACS2表達來影響乙烯合成，從而影響紫花苜蓿的鹽脅迫響應［10］。OsWRKY11的異位表達提高了其對熱脅迫和干旱脅迫的響應［11］。在煙草（Nicotiana benthamiana）中過表達LcWRKY40可以通過響應干旱脅迫反應來增強植物的耐旱性［12］。GhWRKY68通過調節ABA信號傳導以及細胞活性氧來響應干旱脅迫和鹽脅迫［13］。過表達AtWRKY30增強轉基因小麥（Triticum aestivum）對熱和干旱脅迫的耐受性［14］。在Sun等［15］的研究中發現AtWRKY53通過介導氣孔運動負調節擬南芥的抗旱性。TaWRKY2和TaWRKY19的過表達使轉基因擬南芥具有更強的耐鹽和耐旱性［16］。

假儉草是一種多年生C4草本植物，是禾本科蜈蚣草屬中唯一可作用于草坪草的草種，原產于我國四川、云南、福建、江蘇、浙江、湖北、湖南、廣西等長江流域以南亞熱帶地區，是我國最重要的本土暖季型草種，被稱為“中國草坪草”［17-18］。假儉草植株低矮、抗逆性強且耐粗放管理，是建植綠地草坪、固土護坡、綠化建設及治理水土流失的理想材料［19-20］。

WRKY轉錄因子在植物響應干旱脅迫中發揮重要作用，但目前關于假儉草WRKY轉錄因子基因響應干旱脅迫的研究未見報道。本研究利用假儉草全基因組數據庫，篩選鑒定了EoWRKYs家族成員，分析其蛋白理化性質、系統發育進化樹、保守基序、順式作用元件等，并基于干旱脅迫下轉錄組數據進行表達譜分析，同時通過qRT-PCR驗證EoWRKYs在干旱脅迫下的表達水平，為進一步研究該轉錄因子家族成員在假儉草干旱脅迫應答等過程中的作用提供理論基礎，為假儉草和其他草種抗旱品種培育提供基因素材。

1 材料與方法

1.1 EoWRKY基因家族成員鑒定與蛋白質結構域驗證

參考假儉草全基因組數據［21］，通過本地BLAST比對，獲取假儉草WRKY候選蛋白，同時在Pfam數據庫（http：//pfam.xfam.org/）中下載WRKY基因家族保守結構域的隱馬爾可夫模型文件（PF03106），利用HMMER3.1軟件在假儉草本地蛋白數據中進行BlastP搜索，獲取假儉草WRKY候選蛋白，E-value值為10-10，合并序列后將二者獲得序列全部作為WRKY基因家族的候選序列。利用NCBI-CDD，Pfam等在線網站對獲取的候選WRKY基因家族蛋白序列進行結構域驗證，保留含有WRKY結構域的基因，最終從假儉草全基因組蛋白文件中篩選出92個EoWRKY基因家族成員。

1.2 假儉草WRKY家族成員系統進化樹的構建

利用MEGA7軟件，采用臨近法構建假儉草WRKY基因家族系統發育進化樹。

1.3 假儉草WRKY家族基因保守基序、染色體位置信息和蛋白理化性質分析

利用在線網站MEME（https：//meme-suite.org/）對假儉草WRKY家族基因進行保守基序分析，根據假儉草基因組GFF3注釋文件，提取EoWRKYs基因內含子及外顯子的位置信息和WRKY基因染色體的位置信息，繪制基因結構圖及染色體定位圖。同時利用在線網站ExPASy（https：//www.expasy.org/）對WRKY家族成員氨基酸序列的等電點（PI）、蛋白質分子量（MW）和氨基酸數目（AA）進行分析。

1.4 假儉草WRKY基因啟動子區順式作用元件分析

提取EoWRKYs基因上游2 000 bp的序列，利用在線工具PlantCARE（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測順式作用元件。

1.5 共線性分析

利用假儉草全基因組及GFF3注釋信息獲取EoWRKYs染色體位置信息及共線性分析，利用MCScan X分析EoWRKY基因的共線性，并使用circos軟件繪制結果。

1.6 假儉草WRKY基因家族表達譜分析

利用課題組前期干旱脅迫下假儉草轉錄組數據［22］，使用TBtools繪制熱圖。

1.7 植物材料與處理方法

假儉草“22-1”作為試驗材料，材料種植于湖南農業大學西田徑場資源圃中。采用干砂脫水法對假儉草進行模擬干旱，將假儉草從資源圃中拔出，用流水沖洗根部，用吸水紙吸干水分后放入培養瓶中并裝滿干燥石英砂，分別進行0 h，3 h，6 h及12 h干旱脅迫處理，0 h作為對照。

1.8 干旱脅迫下EoWRKY基因的qRT-PCR分析

利用轉錄組表達譜數據篩選出的候選EoWRKY基因的CDS序列，使用Primer3plus網站設計PCR引物（表1），內參為假儉草中actin1［22］。使用Trizol法提取假儉草葉片RNA，使用反轉錄試劑盒（全式金，AT311）進行假儉草葉片cDNA合成，使用熒光定量試劑盒（諾唯贊，Q711）于ABI（Applied Biosystems）公司ABI7500 PCR系統進行熒光定量反應。試驗技術重復3次，相對表達量使用2-ΔΔCT計算。

2 結果與分析

2.1 假儉草EoWRKY家族基因成員鑒定及其理化性質分析

通過Blast和HMMER序列比對，結合WRKY保守結構域分析，最終獲得了92個假儉草WRKY家族成員，根據在染色體上的位置將其編號EoWRKY1～EoWRKY92。EoWRKY家族成員理化性質鑒定分析結果如表2所示，該基因家族多肽鏈氨基酸數目為154～1 219個；等電點為4.84～10.11。親水性分析結果顯示，所有EoWRKY蛋白的親水性均為負值，屬親水蛋白，其中親水性最強的是EoWRKY38，其平均親水性為-1.05。不穩定指數的鑒定結果表明，所有成員不穩定指數均高于40，均為壽命較短的不穩定蛋白。蛋白亞細胞定位預測分析表明EoWRKY蛋白均定位于細胞核。

2.2 假儉草EoWRKY基因系統進化樹分析

本研究利用MEGA7對92個EoWRKY家族成員的氨基酸序列構建系統發育進化樹，結果如圖1。假儉草WKRY家族成員分為三個組，分別為Group Ⅰ～Ⅲ，其中GroupⅡ分為Ⅱa和Ⅱb兩個亞類。Group Ⅰ包含11個成員；Group Ⅱ成員數最多，有52個；剩下的29個成員位于Group Ⅲ。

2.3 假儉草WRKY基因染色體定位及物種間共線性分析

染色體定位結果發現（圖2），分布于chr5的數量最多，為21；分布數量最少的是chr8，數量為4。且92個EoWRKY基因不均勻的分布在9條染色體上，這說明EoWRKY基因的染色體分布不具有偏好性。

對假儉草EoWRKY基因的旁系同源關系進行預測，并對EoWRKY基因復制事件分析，92個EoWRKY中含有16對同源基因（圖3），其中位于1號染色體的EoWRKY8和EoWRKY9為1對串聯基因，同樣位于7號染色體的EoWRKY69與EoWRKY70，EoWRKY79與EoWRKY82為2對串聯基因，其余13對同源基因均為片段復制。除4號染色體外，其他8條染色體均有片段復制基因。推測片段復制事件是假儉草EoWRKY基因進化的主要途徑。

2.4 假儉草EoWRKY基因結構和保守基序分析

基因結構表明（圖4），假儉草EoWRKY基因家族成員含有1～11個內含子，2～12個外顯子。EoWRKY41僅含有2個外顯子和1個內含子；EoWRKY88基因結構最復雜，含有11個內含子和12個外顯子。

對假儉草EoWRKY蛋白進行motif預測，分析得到10個保守基序，命名為motif1～motif10，如圖5所示。其中最短基序序列長度為6個氨基酸（motif6），最長基序序列長度為50個氨基酸（motif4）。在不同的EoWRKY蛋白中含有motif數量2～9個不等，其中motif1為WRKY家族七肽保守基序WRKYGQK，motif3為鋅指蛋白結構域。I組成員基本全包含motif5，motif1，motif2和motif3，motif4主要存在I組中。II組成員中motif種類多，全包含motif1，motif2和motif3，IIa組中成員包含motif9，但IIb中不存在。motif7主要III組成員中，包含的motif種類基本一致。GroupI～III中基本都含有motif1，motif2和motif3，推測這3個基序是EoWRKY蛋白的核心保守基序，但EoWRKY87不含有motif1和motif2，可能是遺傳進化中發生丟失所導致。

2.5 假儉草EoWRKY家族成員啟動子區順式作用元件預測

獲取假儉草EoWRKY基因上游2 000 bp的啟動子區域序列，利用Plantcare軟件進行順式作用元件分析，篩選出14個順式作用元件，如赤霉素響應元件、光反應元件、水楊酸響應元件、低溫反應元件、脫落酸響應元件和生長素響應元件等（圖6）。可為進一步研究WRKY轉錄因子參與植物抗逆脅迫的分子機理及選育高抗假儉草品種提供參考。

2.6 EoWRKY家族成員在假儉草不同干旱脅迫時期表達情況

基于課題組已有假儉草轉錄組數據［22］對EoWRKY基因家族成員在不同干旱時期的表達情況進行分析，不同EoWRKY基因在假儉草葉片和根系的干旱前期（0 d）、中期（7 d）、后期（15 d）中表達模式存在較大差異（圖7和圖8）。干旱脅迫下葉片中，EoWRKY66，EoWRKY54，EoWRKY14等在干旱脅迫后期高表達，EoWRKY65，EoWRKY45，EoWRKY88等在干旱脅迫中期表達量較高；EoWRKY11，EoWRKY5，EoWRKY13等成員在干旱脅迫下表達量下降，EoWRKY76和EoWRKY29缺少表達信息。干旱脅迫下根系轉錄組分析結果表明，60個EoWRKY基因按照其對干旱脅迫的應答模式分為4組，第1組為EoWRKY69等26個基因，表現為隨著干旱脅迫程度的加深，表達量逐漸下降；第2組為EoWRKY90等14個基因，在干旱前中期有較高表達，后期表達量下降；第3組包含EoWRKY77等5個基因，表現為隨著干旱脅迫進行表達量逐漸升高；第4組包含EoWRKY8等15個基因，其表達量表現隨干旱進行出現先上升后下降的趨勢，表明這些EoWRKY基因可能在干旱脅迫中起重要作用。

2.7 干旱脅迫下假儉草EoWRKY基因的qRT-PCR分析

為保證轉錄組測序數據的準確性，隨機篩選出8個EoWRKYs，即EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRK-Y30，EoWRKY2，EoWRKY33，EoWRKY62，EoWR-KY9和EoWRKY60，轉錄組數據中前4個基因隨著葉片干旱脅迫時間的延長，表達量提高；而后4個基因則剛好相反。通過qRT-PCR驗證其響應干旱脅迫的瞬時表達量差異，結果如圖9，EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2在干旱脅迫下表達量升高，正向響應了干旱脅迫，EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60在干旱脅迫下表達量逐漸下降，說明干旱脅迫短期內可能抑制了這些基因的表達。qRT-PCR結果與轉錄組數據分析結果一致，表明轉錄組測序數據有較高的可靠性。

3 討論

WRKY作為一類存在于高等植物中的重要調控因子，廣泛參與著植物生長發育進程與植物逆境脅迫的響應［23］。目前已經在多個物種完成WRKY基因家族的鑒定，例如二穗短柄草（Brachypodium distachyon）［24］、鹽生草（Halogeton glomeratus）［25］、大苞萱草（Hemerocallis middendorffii）［26］等，然而在假儉草中WRKY基因家族的研究未見報道。本研究基于假儉草全基因組測序結果［21］，通過生物信息學手段，在假儉草中鑒定出92個EoWRKY基因。通過構建系統進化樹，并根據保守結構域與鋅指結構將EoWRKY基因家族分為Group Ⅰ～Ⅲ三大組，Group Ⅱ成員數最多，占比最大（56.5%），在其他植物WRKY家族中Group Ⅱ比例也較高，如在木薯（Manihot esculenta）中占比66%［27］。

基因復制是基因家族擴增的主要驅動力之一，片段復制和串聯重復是基因復制的主要兩種方式［28］。以往研究表明，片段復制在WRKY基因家族中發揮重要作用。研究發現在白三葉（Trifolium repens）WRKY轉錄因子中，存在118個片段復制和6個串聯復制［29］。在百脈根（Lotus corniculatus）WRKY基因家族的研究中，發現有37個基因復制事件，其中包括36個片段復制［30］。在玉米（Zea mays）的WRKY基因研究中，有52個基因復制事件，且全為片段復制，沒有涉及到串聯復制［31］。在本研究中，假儉草EoWRKY基因中含有13對片段重復基因和3對串聯重復基因，該進化模式與玉米［31］、亞麻薺（Camelina sativa）［32］等相同，這表明片段復制事件可能是假儉草EoWRKY基因家族形成和擴增的主要動力。

啟動子區域存在大量順式作用元件，調控著基因的轉錄和表達。本研究中，在假儉草EoWRKY基因的啟動子區域中鑒定了各種順式作用元件，如光響應、激素應答、逆境脅迫和生長發育等順式作用元件，如與生長素、赤霉素、水楊酸、脫落酸響應相關的元件，這對于研究EoWRKY基因的潛在功能是重要的。以往研究表明，WRKY轉錄因子通過與脅迫相關的轉錄調控元件參與干旱脅迫應答，MaWRKY80通過調節脫落酸和氧化還原代謝正向調節轉基因擬南芥的抗旱性［33］；干旱、鹽堿、高溫和低溫脅迫等環境因素，以及與防御相關的植物激素ABA和SA影響著ZmWRKY65的轉錄，從而增強了轉基因擬南芥對非生物脅迫的耐受性［34］。擬南芥中過表達EjWRKY17可促進ABA處理下轉基因株系的根伸長和子葉綠化［35］。綜上所述，本研究中啟動子區域研究結果為假儉草在干旱脅迫下揭示信號通路提供了思路。

許多研究表明，植物在受到干旱脅迫時WRKY基因能被快速誘導表達，從而響應干旱脅迫。對不同干旱脅迫時期下轉錄組數據分析發現存在顯著差異表達的EoWRKY基因，推測這些差異基因可能參與了干旱脅迫過程。如葉片中EoWRKY66，EoWRKY54和EoWRKY14等在干旱脅迫后期高表達，而根系中EoWRKY54與之相反，EoWRKY14沒有表達；葉片中EoWRKY16，EoWRKY17和EoWRKY59等在干旱脅迫前期高表達，EoWRKY42，EoWRKY63和EoWRKY71等在干旱脅迫后期高表達，而這些基因在根系干旱脅迫中期出現高表達，表明這些基因可能在特定的組織和干旱脅迫中起重要作用。例如，ZmWRKY79通過觸發ABA生物合成基因（包括AAO3基因），正向調控ABA水平的增加，從而提高擬南芥的抗旱性［36］。AtWRKY57通過直接結合W-box元件刺激RD29A和NCED3的表達，從而提高擬南芥的耐旱性［37］。在本研究中，在受到不同時期的干旱脅迫后，假儉草葉片和根系的表達模式與其分類并不存在相關性，這與Yang等［38］的研究結果不同。這些發現表明，WRKY轉錄因子在不同組織中表達譜不同，進而調節一系列生理生化代謝過程，推測在假儉草根系和葉片中相關EoWRKY基因共同發揮作用以抵御干旱脅迫。

在本研究中qRT-PCR驗證結果EoWRKY33，EoWRKY62，EoWRKY9和EoWRKY60在脅迫后表達量顯著降低；EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2均在干旱脅迫12 h相對表達量上升，且表現出較強的應激反應，這驗證了轉錄組數據，同時也推測這些基因可能通過激活相關基因的表達來響應干旱脅迫。據報道，過表達ZmWRKY40通過調控逆境相關基因STZ，DREB2B和RD29A提高轉基因擬南芥的抗旱性［39］。ZmWRKY106的過表達通過ABA信號通路調控逆境相關基因，提高了轉基因擬南芥對干旱和熱脅迫的耐受性［40］。過表達OsWRKY30能通過磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）來增強水稻對干旱脅迫的耐受性［41］。結合WRKY家族在許多植物中的研究結果，推測假儉草中的WRKY基因可能具有與非生物脅迫相關的調控功能。

4 結論

本研究從假儉草全基因組中鑒定出92個EoWRKY基因，并對其蛋白理化性質、系統發育進化、染色體分布、保守基序、順式作用元件等進行了分析，較為系統的鑒定了假儉草EoWRKY基因家族。同時，基于干旱脅迫下轉錄組數據，分析發現假儉草葉片和根系中大量EoWRKY基因表達量上調，并通過qRT-PCR對相關基因進行驗證，其結果與轉錄組數據一致，且EoWRKY77，EoWRKY28，EoWRKY30和EoWRKY2基因在干旱脅迫下被快速誘導激活，推測這些基因共同發揮作用以提高假儉草的耐旱性。本研究結果為深入研究假儉草EoWRKY耐旱基因成員的篩選、抗逆作用機制及假儉草分子育種提供數據支持。

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（責任編輯 劉婷婷）

收稿日期：2023-11-01；修回日期：2023-12-28

基金項目：湖南省自然科學基金項目面上項目（2018 JJ2180）；湖南省教育廳一般項目（17C0759）共同資助

作者簡介：

于元平（1999-），男，漢族，山東威海人，碩士研究生，主要從事草坪草分子研究，E-mail：1754071305@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：Lmx75@hunau.edu.cn