IGF-1基因克隆及其產(chǎn)物的測(cè)序鑒定

基金項(xiàng)目：河南省自然科學(xué)基金（2223000420247）；2023年河南省博士后科研資助項(xiàng)目（312145）；中央引導(dǎo)地方項(xiàng)目（Z20221343023）；河南省重點(diǎn)研發(fā)與推廣專項(xiàng)（212102310813、222102310361）；河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)項(xiàng)目（LHGJ20221031）；漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校科技創(chuàng)新項(xiàng)目（2023ZD18）

第一作者簡(jiǎn)介：曹尚美（1987-），女，博士，主治醫(yī)師。研究方向?yàn)槊谀騼?nèi)科。

*通信作者：付秀虹（1967-），女，主任醫(yī)師，教授。研究方向?yàn)榕陨场?/p>

DOI：10.19981/j.CN23-1581/G3.2024.16.002

摘" 要：基因過(guò)表達(dá)在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和基因治療應(yīng)用中都是常用的手段，而質(zhì)粒的擴(kuò)增在基因過(guò)表達(dá)過(guò)程中是不可或缺的技術(shù)，如何規(guī)范、高效地對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取是基因治療應(yīng)用的前提，也是困擾很多基礎(chǔ)研究人員的難題。利用現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在降低實(shí)驗(yàn)成本基礎(chǔ)上，建立過(guò)表達(dá)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取的最優(yōu)方案。首先采用傳統(tǒng)方法制作LB培養(yǎng)基和感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)轉(zhuǎn)化后的質(zhì)粒進(jìn)行大量擴(kuò)增培養(yǎng)，之后使用商業(yè)試劑盒對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取，反復(fù)試驗(yàn)后對(duì)商業(yè)試劑盒質(zhì)粒提取過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化，提高效率，最終獲得高純度和濃度的質(zhì)粒溶液。經(jīng)超微量分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和sanger測(cè)序等多種方式檢測(cè)驗(yàn)證后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目標(biāo)基因序列一致，提示擴(kuò)增、提取成功。經(jīng)優(yōu)化后的質(zhì)粒擴(kuò)增、提取方案標(biāo)準(zhǔn)、高效，成本低廉，是質(zhì)粒基因克隆的最佳選擇。

關(guān)鍵詞：IGF-1基因；質(zhì)粒克隆；基因過(guò)表達(dá)；質(zhì)粒的擴(kuò)增；基因治療應(yīng)用

中圖分類號(hào)：Q811.4" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " 文章編號(hào)：2095-2945（2024）16-0007-05

Abstract： Gene overexpression is a common method in basic experiments and gene therapy applications， and plasmid amplification is an indispensable technique in the process of gene overexpression. How to amplify and extract plasmids standardized and efficiently is the premise of gene therapy application， and it is also a difficult problem for many basic researchers. To establish the optimal scheme of amplification and extraction of overexpression plasmid on the basis of reducing the experimental cost by using the existing experimental technology. Firstly， the LB medium and competent cells were made by traditional method， and the transformed plasmid was amplified and cultured， and then the plasmid was extracted by commercial kit. After repeated experiments， the plasmid extraction process of commercial kit was optimized， the efficiency was improved， and the plasmid solution with high purity and concentration was obtained. The sequence of the target gene was verified by ultramicro spectrophotometer， agarose gel electrophoresis and sanger sequencing， which was consistent with that in NCBI database， indicating that the amplification and extraction were successful. The optimized plasmid amplification and extraction scheme is standard， efficient and low cost， which is the best choice for plasmid gene cloning.

Keywords： IGF-1 gene; plasmid cloning; gene overexpression; plasmid amplification; gene therapy application

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growth factor 1，IGF-1）是胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor，IGF）家族成員之一，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、血管形成及抗腫瘤的作用，日益受到人們的關(guān)注[1]。IGF-1可與其受體結(jié)合，參與激活磷酸肌醇3激酶（PI3K）信號(hào)通路等，并可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為[2]。IGF-1是一個(gè)只有477 bp的基因片段，其編碼的蛋白質(zhì)只有7.8 kDa。它是一種小分子物質(zhì)，其功能類似于生長(zhǎng)因子，在促進(jìn)細(xì)胞分化、增殖和個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用[3]。

IGF-1是調(diào)節(jié)人體生長(zhǎng)與發(fā)育的因子[4]。參與了很多疾病的分子信號(hào)通路，它可以調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞質(zhì)量，改善女性生育力水平[5]。IGF-1可以通過(guò)介導(dǎo)其他信號(hào)通路比如PI3K-AKT通路調(diào)節(jié)心臟功能[6-7]，還可以直接參與腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展[8]，參與機(jī)體代謝在糖尿病疾病發(fā)展中發(fā)揮作用[9]。IGF-1基因過(guò)表達(dá)在很多疾病模型中都有應(yīng)用[10]。本研究立足分子實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，構(gòu)建IGF-1基因擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程，為IGF-1的廣泛應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 主要試劑及儀器

質(zhì)粒PUC57-Kana-IGF-1（ABM21906，上海生工生物），大腸桿菌DH5α（B528411-0001，上海生工生物），50×TAE 緩沖液（T1060，北京索萊寶科技），2×RNA Loading Buffer（R0215，上海碧云天生物），NA-Red核酸染料（D0128，上海碧云天生物），DNA ladder（D0107，上海碧云天生物），超凈工作臺(tái)（Thermo Fisher， USA），恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher， USA），低溫?fù)u床Innova40R（Eppendorf，USA），超微量分光光度計(jì)（B-500，上海元析儀器）。

1.2" 試劑制備

試劑設(shè)備方法見表1。

1.3" 感受態(tài)細(xì)胞制備

①?gòu)馁?gòu)買的菌管中挑一個(gè)DH5α菌落，轉(zhuǎn)到2 mL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中過(guò)夜。②第二天打開制冰機(jī)預(yù)制冰，將2 mL的菌液分裝轉(zhuǎn)到4個(gè)50 mL離心管中，劇烈振搖 2～3 h。③制作冰浴桶，取出處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液冰浴10～15 min。④離心（4 ℃，4 000 rpm）10 min，收集細(xì)菌，盡可能地棄去培養(yǎng)液。⑤冰浴 30 min，用20 mL無(wú)菌預(yù)冷的 0.1 mol/L CaCl2（無(wú)甘油）重懸沉淀（置于冰中）。⑥離心（4℃，4 000 rpm）10 min，棄上清，盡可能地棄去培養(yǎng)液。⑦用12 mL CaCl2（含甘油，冰預(yù)冷）重懸沉淀。⑧分裝到滅菌的1.5 mL的EP管中，200 ？滋L/管，-80℃凍存，備用。

1.4" 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與細(xì)菌擴(kuò)增

①?gòu)?80 ℃冰箱取1支含有100 μL感受態(tài)細(xì)胞，置于冰水混合物中進(jìn)行解凍，解凍時(shí)長(zhǎng)3～5 min。②吸取2～3 μL質(zhì)粒（質(zhì)粒濃度稀釋到10 ng/ μL左右），加入解凍后的感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈離心管混勻，或使用移液器進(jìn)行多次吹打混勻。③再將離心管置于冰水混合物中10 min。④將上述離心管2/3浸入42 ℃水浴鍋，熱激時(shí)長(zhǎng)90 s。⑤熱激結(jié)束，離心管冰浴3 min。⑥加入600 μL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床（200 rpm）復(fù)蘇培養(yǎng)45 min。⑦復(fù)蘇結(jié)束，吸取50～100 μL

轉(zhuǎn)化物用無(wú)菌槍頭呈田字格狀均勻涂布在含有卡那抗性的LB平板上。⑧將平板倒置放入37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。挑取平板中的單個(gè)細(xì)菌克隆，放入含有卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床6～8 h進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5" 質(zhì)粒提取

使用天根質(zhì)粒大提試劑盒（Catalog No.DP117）進(jìn)行質(zhì)粒提取，根據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行優(yōu)化步驟。溶液P1在使用前先加入RNase A，混勻，置于2～8℃保存。①向吸附柱CP6中加入2.5 mL的平衡液BL，離心（4℃，4 000 rpm）2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取200～400 mL過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管，離心（4℃，4 000 rpm）3 min收集細(xì)菌，盡量吸除上清。盡量吸除上清，為確保上清液全部吸取，請(qǐng)用干凈的吸水紙吸去瓶壁上的水滴。向留有菌體沉淀的離心管中加入8 mL溶液P1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。②向離心管中加入8 mL溶液P2，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分裂解，室溫放置5 min。向離心管中加入8 mL溶液P4，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，至溶液出現(xiàn)白色分散絮狀沉淀。然后室溫放置10 min左右。離心（4 ℃，4 000 rpm）5～10 min，使白色沉淀離至管底，將全部溶液小心倒入過(guò)濾器CS1中，慢慢推動(dòng)推柄過(guò)濾，濾液收集在干凈的50 mL的管中。③向?yàn)V液中加入0.3倍濾液體積的異丙醇，上下顛倒混勻后轉(zhuǎn)移到吸附柱CP6中。離心（4 ℃，4 000 rpm）2 min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP6重新放回收集管中。④向吸附柱CP6中加入10 mL漂洗液PW，離心（4℃，4 000 rpm）2 min，棄掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑤重復(fù)操作步驟④。向吸附柱CP6中加入3 mL無(wú)水乙醇，離心（4 ℃，4 000 rpm）2 min，倒掉廢液。將吸附柱CP6重新放回收集管中，離心（4 ℃，4 000 rpm）5 min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。⑥將吸附柱CP6置于一個(gè)干凈的50 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加1～2 mL洗脫緩沖液TB，室溫放置5 min，然后離心（4℃，4 000 rpm）2 min。⑦重復(fù)步驟⑥，每1 mL洗脫液加入1.42 mL異丙醇以及0.42 mL 5 mol/L NaCl，混勻，室溫放置5 min，離心（4 ℃，4 000 rpm）10 min，小心棄上清。⑧加入0.5 mL的70％乙醇洗滌沉淀，離心（4 ℃，4 000 rpm）5 min，小心棄乙醇。

重復(fù)操作步驟8。空氣中干燥沉淀約5～10 min，根據(jù)需要用適當(dāng)體積的TB緩沖液溶解沉淀。洗脫緩沖液體積不少于1 mL，體積過(guò)小影響回收效率。將提取好的質(zhì)粒分裝于100 μL的離心管中，保存于-20 ℃冰箱。

1.6" 質(zhì)粒DNA濃度及純度檢測(cè)

1.6.1" 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)粒的濃度與純度

開機(jī)后選擇檢測(cè)核酸，使用前用蒸餾水清洗再次清洗，吸取2 μL蒸餾水作為空白調(diào)零，擦去蒸餾水。取2 μL提取的質(zhì)粒DNA，測(cè)量濃度和純度。

1.6.2" 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度及完整性

①將清潔干燥的塑料托盤放入配膠板，置于水平面上。②配制足量的電泳緩沖液（1×TAE）用以灌滿電泳槽和配制凝膠。輕輕地旋轉(zhuǎn)以充分混勻凝膠溶液。③配制0.8%的瓊脂糖凝膠（0.24 g瓊脂糖粉末加入1×TAE 30 mL）微波爐加熱2 min沸騰，降溫到50℃左右時(shí)加入DD核酸染料1.5 μL。瓊脂糖溶液正在冷卻時(shí)，用一個(gè)合適的梳子形成加樣孔。梳齒的位置應(yīng)在托盤底面上0.5～1.0 mm，這樣瓊脂糖澆灌到托盤時(shí)將形成符合要求的加樣孔。④澆灌溫?zé)岬沫傊侨芤哼M(jìn)入模具，室溫下放置30～45 min，待凝膠溶液完全凝結(jié)，小心拔出梳子。⑤將凝膠安放在電泳槽內(nèi)，向電泳槽加入電泳緩沖液，剛好沒(méi)過(guò)凝膠約1 mm。⑥混合DNA樣品和一定比例的載樣緩沖液。DNA 5 μL+1 μL RNA lodding buffer，DNA ladder 5 μL作為對(duì)照。原始質(zhì)粒和提取質(zhì)粒均進(jìn)行10倍稀釋。⑦關(guān)上電泳槽蓋，接好電極插頭。給予120 V，30 min條件下電泳，其中距離以陽(yáng)極至陰極之間的測(cè)量為準(zhǔn)。⑧當(dāng)DNA樣品或染料在凝膠中遷移了足夠距離時(shí)，關(guān)上電源、拔出電極插頭和打開電泳槽蓋，用紫外燈在302 nm處觀察凝膠和拍照。

1.6.3" 對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行sanger測(cè)序

測(cè)序引物使用puc57-R（TAGCTCACTCATTAGGCAC）。

2" 結(jié)果

2.1" 超微量分光光度計(jì)檢測(cè)

OD260/OD280的比值為1.9，濃度為268.30 ng/μL。

2.2" 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，原始質(zhì)粒和提取質(zhì)粒電泳后位置一致。

（a）" 電泳圖" " " " " "（b）" Maker

圖1" 瓊脂糖凝膠電泳

2.3" Sanger測(cè)序結(jié)果

測(cè)序結(jié)果如圖2所示，測(cè)序序列與NCBI中IGF1基因序列一致。

IGF1基因序列（下載于NCBI）

ATGGGAAAAATCAGCAGTCTTCCAACCCAATTATTTA

AGTGCTGCTTTTGTGATTTCTTGAAGGTGAAGATGCA

CACCATGTCCTCCTCGCATCTCTTCTACCTGGCGCTGT

GCCTGCTCACCTTCACCAGCTCTGCCACGGCTGGACC

GGAGACGCTCTGCGGGGCTGAGCTGGTGGATGCTCTT

CAGTTCGTGTGTGGAGACAGGGGCTTTTATTTCAACA

AGCCCACAGGGTATGGCTCCAGCAGTCGGAGGGCGC

CTCAGACAGGCATCGTGGATGAGTGCTGCTTCCGGA

GCTGTGATCTAAGGAGGCTGGAGATGTATTGCGCAC

CCCTCAAGCCTGCCAAGTCAGCTCGCTCTGTCCGTGC

CCAGCGCCACACCGACATGCCCAAGACCCAGAAGTA

TCAGCCCCCATCTACCAACAAGAACACGAAGTCTCA

GAGAAGGAAAGGAAGTACATTTGAAGAACGCAAGT

AG。

經(jīng)過(guò)檢測(cè)，此次提取的質(zhì)粒符合使用標(biāo)準(zhǔn)。后續(xù)可直接應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染甚至動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等對(duì)DNA純度要求很高的實(shí)驗(yàn)中。

3" 討論

基因過(guò)表達(dá)在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和基因治療應(yīng)用中都是常用的手段，而質(zhì)粒的擴(kuò)增在基因過(guò)表達(dá)過(guò)程中是不可或缺的技術(shù)[11]，如何規(guī)范、高效地對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取是應(yīng)用的前提，也是困擾很多基礎(chǔ)研究人員的難題[12]。本實(shí)驗(yàn)中建立了一個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取的最新標(biāo)準(zhǔn)，使用了最新的試劑和技術(shù)，反復(fù)試驗(yàn)后優(yōu)化了質(zhì)粒擴(kuò)增、提取的步驟，制定了標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)流程，提高了常規(guī)質(zhì)粒擴(kuò)增、提取的效率，實(shí)驗(yàn)時(shí)間大大縮短，且降低了實(shí)驗(yàn)成本，為質(zhì)粒在基因過(guò)表達(dá)中的廣泛應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

大部分文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)流程不夠詳細(xì)，容易造成實(shí)驗(yàn)的失敗，反復(fù)實(shí)驗(yàn)造成資源浪費(fèi)。經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)的多次調(diào)試，總結(jié)出一套詳實(shí)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，極大減小了實(shí)驗(yàn)失敗的可能性。前期經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，有的基因過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)成本較高，比如CRISPR-Cas9技術(shù)[13]，給后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成經(jīng)費(fèi)上的負(fù)擔(dān)。有的基因克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜，不利于推廣和普及，比如文獻(xiàn)[14]中介紹的方法。而本研究中使用的方法可以大大降低后續(xù)配制試劑的時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。另外一種擴(kuò)增質(zhì)粒的方法是利用病毒擴(kuò)增[15]的方式，雖然其后續(xù)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率可能更高，但是相較于細(xì)菌擴(kuò)增不僅成本更高，風(fēng)險(xiǎn)也更大。質(zhì)粒提取的商業(yè)試劑盒中實(shí)驗(yàn)條件過(guò)于籠統(tǒng)，需要反復(fù)試驗(yàn)才能找到最佳實(shí)驗(yàn)條件，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)流程可重復(fù)性高，實(shí)驗(yàn)條件較穩(wěn)定，得到的質(zhì)粒質(zhì)量較高，提高了實(shí)驗(yàn)成功率。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用的質(zhì)粒擴(kuò)增和提取方式成本更低、獲取效率更高，又可以保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)效果，是基因克隆一種較好的選擇。

本實(shí)驗(yàn)以IGF-1質(zhì)粒為例，以較低的價(jià)格購(gòu)進(jìn)微量的質(zhì)粒母液，利用公司成功的商業(yè)質(zhì)粒為模板，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增和提取，并對(duì)提取質(zhì)粒的商業(yè)試劑盒中實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，整個(gè)過(guò)程不超過(guò)48 h。經(jīng)過(guò)檢測(cè)和驗(yàn)證后提取的質(zhì)粒質(zhì)量純度、濃度均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)質(zhì)粒母液的擴(kuò)增倍數(shù)達(dá)到了指數(shù)級(jí)。建立了重復(fù)性和成功率高的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)流程，為其他類似的基因克隆實(shí)驗(yàn)提供了有價(jià)值的參考，也為基因治療的應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)，具有很高的科研價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。

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