黑肩綠盲蝽的線粒體基因組結構

許常玉 劉玉娣 侯茂林

摘要

為研究黑肩綠盲蝽Cyrtorhinus?lividipennis的譜系地理和遺傳結構，本文測定并分析了其線粒體基因組全序列。結果表明：黑肩綠盲蝽線粒體基因組全長16?835?bp?（GenBank登錄號：OK149286），包括13個蛋白質編碼基因（PCGs），22個tRNA基因，2個rRNA基因和1個非編碼區，呈閉合雙鏈環狀DNA分子結構。線粒體基因組中A+T含量高達768%，G+C含量為232%，呈現明顯的AT偏向性;13個蛋白質編碼基因均以通用密碼子ATN作為起始密碼子;蛋白質編碼基因中呈現出明顯的氨基酸偏好性，異亮氨酸含量占比最高，為1078%;22個tRNA基因中有21個tRNA形成典型的三葉草式二級結構;系統發育樹顯示，盲蝽科的11個種聚為兩大分支，黑肩綠盲蝽以99％的自展支持率位于其中的一個分支內。本研究結果將為黑肩綠盲蝽作為天敵昆蟲來防治水稻害蟲提供幫助。

關鍵詞

半翅目;?盲蝽科;?黑肩綠盲蝽;?線粒體基因組;?系統發育

中圖分類號：

S?4762

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023215

Structure?of?the?mitochondrial?genome?of?Cyrtorhinus?lividipennis?Reuter?（Hemiptera：?Miridae）

XU?Changyu，?LIU?Yudi*，?HOU?Maolin

（State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

In?order?to?investigate?phylogeography?and?genetic?structure?of?Cyrtorhinus?lividipennis，?mitochondrial?genome?of?C.?lividipennis?was?sequenced?and?analyzed.?The?mitochondrial?genome?of?C.lividipennis?is?a?closed?double?stranded?circular?DNA?with?16?835?bp?in?total?length?（GenBank?accession?noOK149286），?contains?two?ribosomal?RNA?（rRNA）?genes，?22?transfer?RNA?（tRNA）?genes，?13?proteincoding?genes?and?a?control?region.?Nucleotide?composition?of?the?mitochondrial?genome?is?biased?toward?adenine?and?thymine?（A+T）?with?an?AT?content?of?768%?and?GC?content?of?232%.?All?13?proteincoding?genes?（PCGs）?start?with?a?typical?ATN?initiation?codon，?showing?obvious?amino?acid?preference，?and?Ile?is?the?most?abundant?amino?acid?（1078%）.?21?out?of?22?tRNA?genes?form?a?typical?cloverleaf?secondary?structure.?The?phylogenetic?tree?revealed?that?the?11?species?of?the?family?Miridae?clustered?into?two?major?branches，?and?the?C.lividipennis?clustered?in?one?of?the?branches?with?a?bootstrap?support?value?of?99%.?The?results?will?provide?insights?into?the?potential?of?C.lividipennis?as?a?natural?enemy?insect?for?controlling?rice?pests.

Key?words

Hemiptera;?Miridae;?Cyrtorhinus?lividipennis;?mitochondrial?genome;?phylogeny

黑肩綠盲蝽Cyrtorhinus?lividipennis?Reuter隸屬于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae，為褐飛虱Nilaparvata?lugens?（Stl）、白背飛虱Sogatella?furcifera?（Horváth）和黑尾葉蟬Nephotettix?cincticeps?（Uhler）等半翅目水稻害蟲的重要捕食性天敵，主要捕食卵和低齡若蟲。據報道，黑肩綠盲蝽對控制稻飛虱種群有重要作用，其對稻田褐飛虱卵的捕食比例約為30%，最高可達70%左右［13］。在飛虱和葉蟬類獵物不足時，黑肩綠盲蝽也可以捕食多種鱗翅目昆蟲的卵和幼蟲［45］。黑肩綠盲蝽分布范圍廣，在東南亞國家、太平洋群島、日本、澳大利亞等水稻產區均有分布，在我國主要分布于華北、華東、西南及東南等水稻種植地區［67］。目前有關黑肩綠盲蝽的研究主要集中在形態學、捕食生物學和抗藥性等方面［813］，全基因組測序分析能為我們研究多營養互作（寄主植物捕食者天敵）提供基因組信息，使我們能更好地運用天敵昆蟲防治水稻害蟲［14］。

線粒體是真核生物細胞中具有獨立遺傳物質和體系的半自主型細胞器。由于具有母系遺傳、進化速率快以及易于PCR擴增等特點［15］，線粒體基因在研究分子進化、種群遺傳結構和系統發生學分析等方面得到廣泛應用［16］。昆蟲線粒體基因組為共價閉合的環狀DNA分子，長度13～19?kb，包括13個蛋白質編碼基因（proteincoding?genes，?PCGs）、2個核糖體RNA基因（rRNA?genes）、22個轉運RNA基因（tRNA?genes）和1個長的非編碼區（又稱為控制區或AT富含區）［16］。為了給黑肩綠盲蝽的譜系地理及遺傳結構相關研究提供更加豐富的分子標記工具，從而充分發揮其作為天敵昆蟲控制水稻害蟲的作用，本研究通過二代高通量測序技術組裝了黑肩綠盲蝽線粒體基因組的全序列，分析了其堿基組成、密碼子使用情況、預測分析了tRNA結構、并基于線粒體基因組13個蛋白編碼基因構建了盲蝽科的系統發育樹。研究結果一方面可以豐富盲蝽科線粒體基因組的數據，為從線粒體基因組水平分析盲蝽科的系統發育關系提供信息;另一方面將為黑肩綠盲蝽的譜系關系研究提供有力工具，從而可以更好地發揮其在不同稻區的生物防治作用。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源和DNA提取

黑肩綠盲蝽采自農業農村部桂林作物有害生物科學觀測實驗站的稻田（25°36′?N，?110°40′?E）。樣本于－80℃冰箱保存備用。挑取20只黑肩綠盲蝽成蟲，使用DNeasy?DNA?Extraction?Kit（Qiagen，?Hilden，?德國）提取混合樣本的總DNA，提取方法參照試劑盒說明書。使用DeNovix?DS11超微量分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總DNA的質量和濃度。

1.2?線粒體基因組分析

將質量合格的黑肩綠盲蝽基因組總DNA送至北京諾禾致源科技股份有限公司，構建小片段文庫和高通量測序。采用Illumina?NovaSeq?6000平臺進行雙末端測序（pairedend?sequencing），測序長度為150?bp。對測序數據進行整理，截除測序接頭以及引物序列，過濾掉質量較低的reads，并去除N含量大于5%的reads，獲得clean?data數據集［1617］。然后使用宏基因組組裝工具IDBA?113對clean?data數據集進行組裝校正［19］，獲得黑肩綠盲蝽線粒體基因組全長序列。得到完整的線粒體基因組序列后，再利用線粒體在線注釋工具MITOS?（http：∥mitos.bioinf.unileipzig.de/index.py）和ORF?Finder（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對組裝好的序列進行注釋。

1.3?系統發育分析

從NCBI中下載半翅目盲蝽科昆蟲的線粒體全基因組，共11個。選取其中13個蛋白質編碼基因的核苷酸序列，以鱗翅目水稻害蟲二化螟Chilo?suppressalis和稻蛀莖夜蛾Sesamia?inferens作為外群，采用最大似然法（maximum?likelihood，?ML）和貝葉斯法（Bayesian?inference，BI）構建系統發育樹。利用Clustal?X對核苷酸序列進行比對后［20］，用MEGA?60軟件和MrBayes軟件分別構建ML和BI系統發育樹，計算各分支節點的bootstrap置信值（重復計算1?000次）。

2?結果與分析

2.1?黑肩綠盲蝽線粒體基因組結構

黑肩綠盲蝽線粒體基因組序列全長16?835?bp?（GenBank登錄號：OK149286），共由37個基因組成，包括13個蛋白質編碼基因（PCGs）、22個tRNA基因和2個rRNA基因，呈閉合雙鏈環狀DNA分子結構（圖1）。通常將多數編碼基因所在鏈定義為主要編碼鏈J鏈（majority?strand，?Jstrand），將另外一條鏈定義為次要編碼鏈N鏈（minority?strand，?Nstrand）。黑肩綠盲蝽線粒體基因組中J鏈編碼23個線粒體基因，包括14個tRNA基因（trnI，?trnM，?trnW，?trnL1，?trnK，?trnD，?trnG，?trnA，?trnR，?trnN，?trnS1，?trnE，?trnT，?trnS2）和9個蛋白質編碼基因（COX1，?COX2，?COX3，?ATP8，?ATP6，?ND2，?ND3，?ND6，?CYTB）;N鏈編碼14個線粒體基因，包括8個tRNA基因（trnQ，?trnY，?trnC，?trnF，?trnH，?trnP，?trnL2，?trnV）、4個蛋白質編碼基因（ND1，?ND4，?ND4L，?ND5）和2個rRNA基因（rrn12，?rrn16）。此外，N鏈還包括1個2?378?bp的非編碼區。

黑肩綠盲蝽線粒體基因組中有20處基因無重疊和間隔現象;有11處基因發生重疊，各重疊部分序列長度差異不大，其中最長重疊序列在trnW和trnC之間，長為8?bp，總共重疊序列長34?bp;有6處基因有間隔，最長間隔序列位于基因trnS2和ND1之間，長為7?bp，總共間隔序列長16?bp（表1）。

2.2?黑肩綠盲蝽線粒體基因組核苷酸組成

黑肩綠盲蝽線粒體全基因組中A、C、G、T含量分別為432%、130%、102%、336%。A+T總量高達768%，AT偏斜值（ATskew）為013，G+C含量為232%，GC偏斜值（GCskew）為-012，呈現明顯的AT偏向性。在蛋白質編碼基因序列中，T堿基的使用頻率高于A堿基，除COX3和ND3兩個蛋白質編碼基因的AT偏斜值為負值外，其余11個蛋白質編碼基因及22個tRNA基因和2個rRNA基因的AT偏斜值均為正值;GC偏斜值，只有J鏈tRNAs和整體的蛋白質編碼基因（PCGs）為正值，13個蛋白質編碼基因（ND2，?COX1，?COX2，?ATP8，?ATP6，?COX3，?ND3，?ND5，?ND4，?ND4L，?ND6，?CYTB，?ND1）和N鏈tRNAs及2個rRNA基因均為負值（表2）。

2.3?黑肩綠盲蝽線粒體基因組蛋白質編碼基因

黑肩綠盲蝽線粒體的13個蛋白質編碼基因均以通用密碼子ATN作為起始密碼子。其中7個蛋白質編碼基因（ND2，?ATP8，?ATP6，?ND4L，?ND6，?CYTB，?ND1）使用了標準終止密碼子TAA，其余6個基因（COX1，?COX2，?COX3，?ND3，?ND5，?ND4）均以不完全終止子T作為終止密碼子（表1）。

根據相對同義密碼子使用頻率（relative?synonymous?codon?usage，?RSCU）可以看出黑肩綠盲蝽線粒體基因組中密碼子使用頻率具有明顯的偏向性，比如TTA、ATT、ATA、TTT、TCA密碼子的使用頻率較高（圖2）。蛋白質編碼基因中異亮氨酸（Ile）含量占比最高，為1078%，半胱氨酸（Cys）占比最低，為123%，表明黑肩綠盲蝽蛋白質編碼基因中呈現出明顯的氨基酸偏好性（圖2）。

2.4?黑肩綠盲蝽線粒體基因組rRNA和tRNA基因

黑肩綠盲蝽線粒體基因組有2個rRNA基因（rrn16和rrn12），都位于N鏈。其中rrn16位于trnL2和trnV之間，長1?231?bp，AT含量788％，rrn12位于trnV和非編碼區之間，長761?bp，AT含量781%。

黑肩綠盲蝽線粒體基因組的22個tRNA基因的長度在62～70?bp。在預測得到的tRNA基因的二級結構中，除trnS1（GCU）因DHU臂缺失不能形成典型的三葉草式二級結構外，其余21個tRNA都形成典型的三葉草式二級結構。典型的AU和GC配對存在于22個tRNA基因的二級結構中，此外，共發現錯配tRNA?14個，共24處，均為GU錯配（圖3）。

2.5?系統發育分析

利用最大似然法和貝葉斯法構建了基于盲蝽科11個種的13個蛋白編碼基因的系統發育樹，兩種建樹方法結果一致，本研究列出了最大似然法的建樹結果（圖4）。聚類結果顯示，作為外群的二化螟和稻蛀莖夜蛾以100%的自展支持率聚在了一起，盲蝽科11個種聚為兩個大的分支。第一個大分支包含苜蓿盲蝽屬Adelphocoris、淡盲蝽屬Creontiades、后麗盲蝽屬Apolygus、草盲蝽屬Lygus和嗜卵盲蝽屬Cyrtorhinus。第二大分支包括了跳盲蝽屬Halticus和煙盲蝽屬Nesidiocoris。黑肩綠盲蝽以99%的自展支持率聚在第一個大分支內。系統發育樹各分支置信值較高，系統發育關系可信度較高（圖4）。

3?結論與討論

盲蝽科的一些種類為捕食性昆蟲，如黑肩綠盲蝽、異須微刺盲蝽Campylomma?diversicornis、食蟲齒爪盲蝽Deraeocoris?punctulatus、煙盲蝽Nesidiocoris?tenuis、中華微刺盲蝽Campylomma?chinensis等，它們作為天敵昆蟲在生物防治中發揮著巨大的作用［2124］。由于盲蝽體型小且體色多樣，對于形態相似的種類或者室內保存時間較長的樣本形態鑒定上存在困難時，可以借助線粒體基因作為輔助手段進行分子鑒定。另外黑肩綠盲蝽與其主要獵物褐飛虱、白背飛虱等有同步伴遷遷飛現象［2526］，所以作為天敵昆蟲防控水稻害蟲是很有效的。線粒體基因在天敵昆蟲捕食獵物的分子生態學研究中具有重要作用，因此黑肩綠盲蝽線粒體基因序列的研究能夠為其捕食功能的研究提供幫助。

本研究測得黑肩綠盲蝽線粒體全基因組序列長為16?835?bp，為典型的閉合雙鏈環狀DNA分子。

基因組的AT含量高達768%，蛋白質編碼基因序列AT含量高達758%，呈現明顯的AT偏向性，與昆蟲線粒體基因組中AT含量偏向性的特征一致［2731］。在密碼子的使用上，盲蝽科偏好使用ATN作為起始密碼子，終止密碼子使用頻率較高的是TAA和T［32］。本研究中黑肩綠盲蝽起始密碼子均為ATN，沒有發現TTG和GTG起始密碼子，終止密碼子全部使用TAA以及不完全終止密碼子T，與盲蝽科其他種的密碼子使用具有相似的特性。而其他半翅目物種密碼子的使用有別于盲蝽科物種，比如蝽科Pentatomidae昆蟲的線粒體蛋白質基因編碼序列除了ATN還會選擇TTG作為起始密碼子［33］，長蝽科Lygaeidae小長蝽Nysius?ericae的cob基因編碼序列以TAG作為終止密碼子，且沒有不完全終止密碼子［34］。線粒體基因組中核苷酸組成會影響蛋白質中的氨基酸組成［35］，本研究中黑肩綠盲蝽線粒體基因組RSCU值表明，使用頻率較高的同義密碼子大部分以A/T結尾，與盲蝽科其他物種一致［32］，蝽科和網蝽科Tingidae昆蟲也有具有此特征［27，34］。

黑肩綠盲蝽線粒體基因組22個tRNA基因除了trnS1（GCU）由于DHU臂缺失不能形成典型的三葉草式二級結構外，其余21個tRNA都形成了典型的三葉草式二級結構，trnS缺失DHU臂的現象在其他昆蟲中也有報道［3639］。昆蟲線粒體基因組的大多數tRNA具有典型的三葉草式二級結構，但也有例外，如高橋仁蚧Aclerda?takahashii線粒體全基因組中有12個非典型的tRNA結構［40］。蛛形綱甜果螨Carpoglyphus?lactis和伯氏嗜木螨Caloglyphus?berlesei都僅有1個tRNA的二級結構能折疊成典型的三葉草結構［4142］。

系統發育樹分析顯示，盲蝽科11個線粒體基因組序列聚為兩個大分支，黑肩綠盲蝽以99%的自展支持率聚在其中的一個大分支內。由于盲蝽科線粒體全基因組數據有限，構建的系統發育樹僅能反映出大致的譜系關系，隨著盲蝽科線粒體全基因組數據資源的不斷豐富，基于線粒體全基因組構建的系統發育樹將更加全面精確。

本研究測定了黑肩綠盲蝽的線粒體基因組全序列，明確了黑肩綠盲蝽線粒體基因的結構和組成。研究結果為探究黑肩綠盲蝽的譜系結構和利用其進行生物防治打下了基礎，也為盲蝽科線粒體基因組分析和研究提供了信息。

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