基于電子鼻技術的小麥籽粒DON含量檢測

劉艮森 聶曉 王奧霖 賈鎮宇 危學華 徐飛 范潔茹 馬東方 劉偉 周益林

摘要

為探究利用電子鼻技術對小麥籽粒中DON含量定量檢測的可行性，本研究在25℃和40℃平衡溫度下對DON含量不同的80個小麥籽粒樣品的頂空氣體進行電子鼻檢測，并結合由UPLCMS/MS測得的各樣品DON含量進行統計分析，結果發現，除4號和5號傳感器外，其余8個傳感器的響應值均與樣品DON含量具有顯著或極顯著的相關性，其中1號傳感器的響應值及其參數與樣品DON含量的相關性最強，表明1號傳感器可以作為檢測小麥籽粒樣品DON含量的關鍵氣體傳感器。以1號傳感器的參數為主，分別建立了在兩平衡溫度下樣品DON含量的回歸模型。對各模型的擬合效果分析發現，在40℃平衡溫度下基于X17（1號傳感器21～60?s響應值的和）所建一元回歸模型最好；在25℃平衡溫度下，基于X1（1號傳感器20～40?s響應值的平均值）和X12（8號傳感器1～5?s響應值的和）所建二元回歸模型擬合效果最好，其次為基于X1所建的一元回歸模型。該研究可為電子鼻技術在小麥籽粒中DON含量檢測中的應用提供理論依據和技術支撐。

關鍵詞

電子鼻;?小麥籽粒;?脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;?毒素檢測;?回歸模型

中圖分類號：

S?435.121.45

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023183

Detection?of?deoxynivalenol?（DON）?content?in?wheat?grain?using?electronic?nose?technology

LIU?Gensen1，2，?NIE?Xiao1，2，?WANG?Aolin2，?JIA?Zhenyu1，2，?WEI?Xuehua1，2，?XU?Fei2，3，

FAN?Jieru2，?MA?Dongfang1*，?LIU?Wei2*，?ZHOU?Yilin2

（1.?College?of?Agriculture，?Yangtze?University，?Jingzhou?434025，?China;?2.?State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases

and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，?Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China;?3.?Institute

of?Plant?Protection，?Henan?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Key?Laboratory?of?Integrated?Pest?Management?on?Crops?in

Southern?Part?of?North?China，?Ministry?of?Agriculture?and?Rural?Affairs，?Zhengzhou?450002，?China）

Abstract

To?explore?the?potential?of?electronic?nose?technology?for?quantifying?deoxynivalenol?（DON）?content?in?wheat?grains，?the?detection?on?the?headspace?gas?of?80?wheat?grain?samples?with?different?DON?contents?at?equilibrium?temperatures?of?25℃?and?40℃?were?conducted?using?electronic?nose，?and?alongside?the?DON?content?of?each?wheat?sample?was?measured?by?UPLCMS/MS.?The?statistic?analysis?results?showed?that，?except?for?sensors?no.4?and?no.5，?the?response?values?of?the?remaining?eight?sensors?significantly?correlated?or?extremely?significantly?correlated?with?the?sample?DON?content.?Notably，?sensor?no.1?exhibited?the?strongest?correlation，?indicating?its?potential?as?a?principal?gas?sensor?for?detecting?DON?content?in?wheat?grain?samples.?Regression?models?for?sample?DON?content?were?established?mainly?based?on?sensor?no.1?parameters?at?each?equilibrium?temperature.?The?analysis?of?the?fitting?effect?of?these?models?revealed?that?the?univariate?regression?model?based?on?X17?（the?sum?of?response?values?of?sensor?no.1?from?21?to?60?seconds）?yielded?the?best?fitting?effect?at?equilibrium?temperature?of?40℃.?The?bivariate?regression?model?based?on?X1?（the?average?response?value?of?sensor?no.1?from?20?to?40?seconds）?and?X12?（the?sum?of?response?values?of?sensor?no.8?from?1?to?5?seconds）?yielded?the?best?fitting?effect?at?25℃，?the?univariate?regression?model?based?on?X1?also?showed?promising?results.?This?study?provides?a?theoretical?basis?and?technical?support?for?detecting?DON?content?in?wheat?grains?using?electronic?nose?technology.

Key?words

electronic?nose;?wheat?grain;?deoxynivalenol?（DON）;?toxin?detection;?regression?model

近些年以來，由禾谷鐮孢復合種（Fusarium?graminearum?species?complex，?FGSC）引起的小麥赤霉?。‵usarium?head?blight，FHB）在我國廣泛發生［1］，且呈加重發生趨勢。2010年－2018年間有5年發病面積超過550萬hm2［2］。該病不僅導致小麥產量降低，還會在小麥籽粒中積累以脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，?DON）為主的毒素，對人畜健康造成威脅［3］。我國規定，小麥籽粒中DON含量在1?000?μg/kg及以上時，禁止銷售與食用［4］。因此，加強對小麥籽粒中DON含量的檢測十分必要。

目前，小麥中DON含量主要采用高效液相色譜與質譜儀聯用（HPLCMS/MS）檢測，該方法具有靈敏度高、重現性好、準確性強等優點［56］;但該技術需要對小麥樣品進行較為復雜的前處理，只能在室內進行檢測，短時間內檢測樣品的數量有限，對操作人員有較高的專業技能要求，難以實現DON現場快速檢測。

與傳統檢測方法相比，電子鼻技術不需要復雜的樣品前處理過程，具有檢測速度快、操作簡單、費用少等優點，在DON檢測方面已有報道。Olsson等［7］利用VCM?422型電子鼻對糧倉中受青霉Penicillium、曲霉Aspergillus和鐮孢菌Fusarium侵染后氣味正常和異常的大麥樣品進行檢測，發現氣味異常的樣品平均DON含量更高。偏最小二乘回歸模型（partial?least?squares?regression，?PLS）擬合結果顯示，電子鼻測定的數據與DON含量有相關性;Lippolis等［8］從意大利不同地區田間采集了105份自然發生赤霉病的硬粒小麥樣品，將DON含量分為3個類別，使用ISE?Nose?2000電子鼻結合判別函數分析（discriminant?function?analysis，?DFA）建立樣品分類模型，分類準確率最高達90.1%。這些研究表明，利用電子鼻技術可以實現對DON含量不同的小麥樣品進行一定程度的檢測區分。

基于此，本研究進一步探究利用電子鼻技術定量檢測小麥籽粒DON含量的可行性。利用電子鼻技術，在2種平衡溫度下對不同DON含量梯度下的小麥樣品進行檢測，比較分析電子鼻數據與DON含量間的關系，建立樣品電子鼻數據與DON含量的關系模型，以期為利用電子鼻技術快速定量檢測小麥籽粒中DON含量提供技術支撐。

1?材料與方法

1.1?供試材料與儀器

小麥赤霉病病粒來源于我國新疆、內蒙古、河北、河南、山東、安徽、湖北等地田間自然發病較重的小麥穗，經手工脫粒后，選取病癟粒，作為小麥赤霉病病籽粒樣品;以健康小麥籽粒‘京雙16為對照樣品。

超高效液相色譜串聯四極桿質譜聯用儀［UPLCMS/MS，XevoTM?TQS，沃特世科技（上海）有限公司］;樣品研磨儀（Tube?Mill?Control?S25，德國IKA公司）;PEN3電子鼻（德國AIRSENSE公司）：主要由1個傳感器室、2個氣泵、2個活性炭氣體過濾器以及采氣針和補氣針組成，該電子鼻通過10個金屬氧化物傳感器（編號為1～10）進行樣品氣味的檢測，這些傳感器分別對不同的氣體物質敏感。在電子鼻工作狀態下，隨著樣品氣體的進入，每個傳感器的電阻值相對應地升高或降低，與其在經活性炭過濾后的潔凈空氣中的電阻值形成一個比值響應值（以下簡稱響應值），將樣品的氣味信息轉化為電信號以供進一步分析，各傳感器的性能見表1。

1.2?試驗方法

1.2.1?樣品制備和電子鼻數據采集

前期利用UPLCMS/MS對田間采集的小麥赤霉病病麥粒樣品進行抽樣檢測，其平均DON含量約為15?000?μg/kg。已有研究發現，在小麥樣品中，赤霉病病麥粒的占比與DON的濃度呈顯著正相關［910］。因此，為使本研究中小麥樣品DON含量具有一定梯度，分別取0.2、0.4、0.6?g病粒于20?mL透明玻璃瓶中，對應加入5.8、5.6、5.4?g健康小麥籽粒，以只加入6.0?g健康麥粒的樣品為空白對照樣品，共4組處理，每組重復20個，共80個樣品。樣品裝瓶后旋緊帶橡膠密封墊的蓋子，分別在25℃和40℃下平衡3?h和30?min，使揮發性氣體在玻璃瓶中的濃度充分平衡。采用曹學仁等［11］改進的頂空吸氣法采集電子鼻數據。將帶有活性炭過濾器的補氣針和連接傳感器室的采氣針同時刺入樣品瓶蓋內，進行電子鼻檢測，在程序提示采樣結束時同時拔出。電子鼻測量參數如下：傳感器室氣流量400?mL/min，注射氣流量400?mL/min，傳感器自清洗時間40?s，自動歸零時間5?s，采樣準備時間5?s，采樣時間60?s，采樣頻率為每秒1次。每個樣品測得的響應值為600個（10個傳感器×60?s），電子鼻數據自動保存為.nos格式。

1.2.2?UPLCMS/MS測定樣品DON含量

電子鼻檢測完成后的小麥樣品用IKA樣品研磨儀粉碎成粉末狀，研磨每個樣品之前將研磨儀清掃干凈，以避免殘存樣品交叉影響。每個磨好的小麥樣品粉末過20目篩后稱取5?g到50?mL離心管中，加入20?mL?80%乙腈水溶液，旋緊蓋子搖勻，置于搖床上260?r/min浸提10?min。4?000?r/min離心10?min，取2?mL上清液，用0.22?μm尼龍濾膜過濾，過濾液放入進樣瓶以備檢測。液相色譜采用ACQUITY?UPLC?HSS?T3色譜柱（2.1?mm×100?mm，?1.8?μm），流動相A為純乙腈，B為0.1%甲酸水溶液，進樣量1?μL，柱溫40℃，梯度洗脫程序見表2;質譜采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+），噴霧電壓3?000?V，脫溶劑氣流量800?L/h，脫溶劑氣溫度500℃，其他質譜參數見表3。將DON標準濃度溶液（10、20、50、100、200、500、1?000?μg/kg）隨樣品上機一同測定，通過其DON響應峰面積計算得到標準曲線方程，再將樣品測得的DON響應峰面積代入標準曲線方程，計算得到各樣品的DON含量。

1.3?數據分析

采用Waters公司的Masslynx?V?4.1軟件對樣品的UPLCMS/MS數據進行處理，得到樣品的DON含量;采用R?4.1.2中的corrr包對樣品的DON含量與電子鼻響應值參數進行Pearson相關性分析，利用stats包對樣品的DON含量與電子鼻響應值參數進行一元線性回歸分析，利用全子集回歸法建立電子鼻響應值參數與DON含量的二元回歸模型（leaps包）。

通過計算各模型的均方根誤差（root?mean?square?error，RMSE）、平均絕對誤差（mean?absolute?error，MAE）和卡方值（χ2）等指標來評估各模型的擬合效果，RMSE、MAE和χ2值越小，模型的效果越好。

2?結果與分析

2.1?UPLCMS/MS測定的樣品DON含量

60個混有病麥樣品的DON含量在155.76～4?656.02?μg/kg，經ShapiroWilk正態性檢驗（W=0.988?89，?P=0.861?6）符合正態分布規律。其中，DON含量小于1?000?μg/kg的樣品有8個，含量在1?000～2?000?μg/kg的樣品有20個，含量在2?000～3?000?μg/kg的樣品有19個，含量在3?000～4?000?μg/kg的樣品有11個，含量大于4?000?μg/kg的樣品有2個;20個空白對照樣品的DON含量為0?μg/kg。

2.2?電子鼻傳感器響應值隨時間的變化規律

在25℃和40℃平衡溫度下，電子鼻各傳感器響應值隨測量時間變化規律分別如圖1和圖2所示。

在兩種平衡溫度下，1號和3號傳感器的響應值在0～5?s左右快速減小到最小值，6～20?s快速回升，21～60?s緩慢上升至平穩不變;且隨樣品DON含量升高，響應值有逐漸降低趨勢。2號、6號、7號、8號、9號、10號傳感器的響應值隨測量時間的變化趨勢具體表現為：在0～5?s左右快速

升高到最大值，6～20?s快速回落，21～60?s緩慢下降至平穩不變;隨樣品DON含量升高，各傳感器響應值有逐漸升高趨勢。4號和5號傳感器的響應值隨測量時間的變化沒有表現出一定的變化趨勢規律，因此，4號和5號傳感器未應用于后續分析中。

2.3?電子鼻各傳感器響應值與樣品DON含量之間的相關關系

在25℃和40℃平衡溫度下，各傳感器每秒測得的響應值與樣品DON含量之間的Pearson相關系數散點圖分別如圖3和圖4所示。在25℃平衡溫度下，各傳感器與DON相關性較好的時間段分別為：1號、6號傳感器20～40?s;2號、7號、8號、9號傳感器3～10?s;3號傳感器10～30?s;10號傳感器31～60?s。在40℃平衡溫度下，各傳感器與DON相關性較好的時間段分別為：1號和7號傳感器20～60?s;2號、3號、6號、8號、9號、10號傳感器均為10～60?s。

2.4?電子鼻響應值參數的構建和篩選結果

根據2.2電子鼻傳感器響應值隨時間及與DON含量的相關性的變化規律，將0～60?s內的電子鼻各傳感器的響

應值劃分為3個時間段：0～5?s響應值快速升高、6～20?s響應值快速下降、21～60?s平緩趨穩。對每個樣品每個電子鼻傳感器該3個時間段內的響應值分別求和，即每個樣品在每個傳感器上可得到3個電子鼻響應值參數。

根據2.3電子鼻各傳感器響應值與樣品DON含量之間的相關關系，將各傳感器相關性較好且平穩的時間段內的響應值各自計算平均值，即每個樣品在每個傳感器上可得到1個電子鼻響應值參數。

分別在兩不同平衡條件下，進一步對各傳感器計算得到的所有響應值參數與DON含量進行Pearson相關性分析，每個傳感器按參數類別分別挑選相關性最高的參數作為DON含量回歸模型的建模參數，每個平衡溫度下均篩選得到16個響應值參數（表4）。整體上，各響應值參數與DON含量相關系數在40℃平衡溫度下均較高（|r|>0.71），且均高于25℃（0.23<|r|<0.65）。