西伯利亞龜象取食對蕎麥不同抗感品種生化物質的影響

陳磊 常靜 王振 李清宇 周洪友 李海平

摘要

為探討抗蟲和感蟲蕎麥品種對西伯利亞龜象Rhinoncus?sibiricus取食的反應，選擇抗蟲品種‘蒙0207‘晉苦6和感蟲品種‘蒙0208‘晉苦2，研究害蟲不同程度（輕度、中度和重度）取食情況下，蕎麥葉片中營養物質（可溶性蛋白和可溶性糖）和次生代謝物質（單寧、總酚和類黃酮）含量，防御酶［過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）］以及蛋白酶抑制劑［胰蛋白酶抑制劑（TI）、胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）］活性的變化，以及西伯利亞龜象體內主要解毒酶活性的變化。結果表明，西伯利亞龜象取食48?h后，各處理組蕎麥葉片中可溶性性蛋白、可溶性糖、單寧、總酚和類黃酮的含量以及PAL、CAT、TI、CI活性均有增加。在供試的4個蕎麥品種中，抗蟲品種被取食后可溶性蛋白和可溶性糖含量上升幅度較感蟲品種更大，感蟲品種被取食后單寧含量，PAL、TI、CI活性上升幅度較抗蟲品種更大。在不同取食程度下，抗蟲品種中的TI和CI活性均顯著高于感蟲品種。西伯利亞龜象成蟲取食抗蟲蕎麥品種后體內羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽S轉移酶（GSTs）活性均顯著高于取食感蟲品種的個體。研究結果表明，西伯利亞龜象取食能誘導蕎麥抗蟲性物質含量的變化，但對蕎麥抗性品種與感蟲品種的影響不同。

關鍵詞

蕎麥;?西伯利亞龜象;?取食;?抗蟲性;?抗性物質;?防御酶

中圖分類號：

S?435.17

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023149

Effects?of?Rhinoncus?sibiricus?feeding?on?biochemical?substances?in?different?resistant?cultivars?of?buckwheat

CHEN?Lei1，2，?CHANG?Jing1，?WANG?Zhen1，?LI?Qingyu3，?ZHOU?Hongyou1，?LI?Haiping1*

（1.?College?of?Horticulture?and?Plant?Protection，?Inner?Mongolia?Agricultural?University，?Hohhot?010019，?China;

2.?Plant?Protection?and?Plant?Quarantine?Center?of?Shanxi?Province，?Taiyuan?030002，?China;

3.?Agriculture，?Animal?Husbandry?and?Water?Conservancy?Science?and?Technology?Bureau?of

Genhe?City?in?Inner?Mongolia，?Genhe?022350，?China）

Abstract

To?investigate?the?responses?of?insectresistant?and?insectsusceptible?buckwheat?cultivars?to?the?feeding?of?Rhinoncus?sibiricus，?the?contents?of?nutrients?（soluble?protein?and?soluble?sugar），?secondary?metabolites?（tannins，?total?phenols?and?flavonoids），?and?the?activities?of?defense?enzymes?（CAT，?PAL）?and?protease?inhibitors?（TI，?CI）?in?leaves?of?two?insectresistant?buckwheat?cultivars?（‘Meng?0207?and?‘Jinku?6）?and?two?insectsusceptible?buckwheat?cultivars?（‘Meng?0208?and?‘Jinku?2）?with?different?damage?degrees?（mild?damage，?moderate?damage?and?severe?damage）?were?measured?48?h?after?damage.?In?addition，?the?activities?of?major?detoxifying?enzymes?（CarE，?GSTs，?P450）?in?Rhinoncus?sibiricus?were?tested?too.?The?results?showed?that?the?contents?of?soluble?protein，?soluble?sugar，?tannin，?total?phenol?and?flavonoids?in?buckwheat?leaves，?as?well?as?the?activities?of?PAL，?CAT，?TI，?and?CI?were?increased?by?feeding?on?R.sibiricus.?Among?the?four?buckwheat?cultivars?tested，?the?increase?of?contents?of?soluble?protein?and?soluble?sugar?in?the?insectresistant?cultivars?is?relatively?more?than?that?of?the?susceptible?cultivars，?and?the?tannin?content，?PAL，?TI?and?CI?activities?of?the?susceptible?cultivars?increased?relatively?more?than?that?of?the?insectresistant?cultivars.?The?TI?and?CI?activities?of?insectresistant?cultivars?were?significantly?higher?than?those?of?susceptible?cultivars?under?different?feeding?levels.?The?activities?of?carboxylesterase?（CarE）?and?glutathione?Stransferase?（GSTs）?of?R.sibiricus?fed?on?insectresistant?buckwheat?were?significantly?higher?than?those?in?the?individuals?fed?on?the?insectsusceptible?cultivars.?The?results?showed?that?the?feeding?of?R.sibiricus?on?both?insectresistant?and?insectsusceptible?cultivars?could?change?the?content?of?substance?related?to?resistant?in?both，?resistant?and?susceptible?cultivars，?but?demonstrated?different?effects.

Key?words

buckwheat;?Rhinoncus?sibiricus;?feeding;?insect?resistance;?resistant?substance;?detoxification

enzyme

蕎麥屬于小宗糧豆作物，具備其他主糧作物所不具備的優點和功能，素有“五谷之王”的美稱［1］。蕎麥含有特殊的營養物質和微量元素［24］，是唯一含有七大營養素的谷類作物，也是集營養、保健和醫療于一體的天然保健食品［35］。我國地域遼闊，蕎麥種質資源極為豐富［6］。內蒙古自治區是全國蕎麥的主產區之一，優越的地理環境使得該地區生產的蕎麥粒大皮薄、品質優良，成為享譽中外的明星產品［7］。

蕎麥抗逆性較強，病蟲害對其影響較小。2013年在內蒙古自治區赤峰市翁牛特旗首次發現西伯利亞龜象Rhinoncus?sibiricus?Faust嚴重為害蕎麥［8］，之后該蟲在我國北方蕎麥種植區不斷擴散，到2019年，西伯利亞龜象已擴散到東北西部，西北和華北的部分地區，并呈現迅速擴散蔓延的趨勢［9］，對我國蕎麥產業的發展構成了嚴重威脅。

植物在長期進化中形成的抗性是農業病蟲害防治體系的重要組成部分，并作為一種有效的防治策略廣泛用于病蟲害控制［10］。植物通過調控次生代謝物質的代謝對害蟲的生長發育和存活等產生不利影響，是針對取食者的一種重要防御策略［1112］。本研究團隊在長期的蕎麥調查研究中，篩選出了2個相對抗蟲的品種和2個感蟲品種，在此基礎上，本論文主要研究西伯利亞龜象取食對抗感品種蕎麥主要物質含量和防御酶活性等的影響，以及取食抗感品種蕎麥后西伯利亞龜象體內主要解毒酶活性的變化，為進一步明確蕎麥抗蟲性機制提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試蕎麥

試驗選用內蒙古地區常見的4個栽培品種?‘蒙0208‘蒙0207‘晉苦6和‘晉苦2，其中‘蒙0208‘蒙0207屬于甜蕎;‘晉苦6和‘晉苦2屬于苦蕎。‘蒙0207和‘晉苦6相對抗西伯利亞龜象，‘蒙0208‘晉苦2相對感蟲。

上述材料在實驗室用花盆（直徑25?cm）種植。

1.1.2?供試蟲源

西伯利亞龜象成蟲采自內蒙古自治區赤峰市林西縣四合村蕎麥地（43°38′N，118°12′E），帶回室內用‘通蕎2號（赤峰市當地種植品種）飼養。飼養環境條件：溫度（25±1）℃，相對濕度（60±5）%，光周期L∥D=14?h∥10?h。試驗前饑餓6?h，挑選發育良好、形態大小一致的成蟲供試。

1.1.3?試劑

考馬斯亮藍G250、Folin試劑，Fluka公司;氯化硝基四氮唑藍（NBT）、L苯丙氨酸、巰基乙醇，Sigma公司;聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、EDTANa2、5磺基水楊酸二水合物、單寧酸、N苯甲酰L酪氨酸乙酯、Nα苯甲酰L精氨酸乙酯鹽酸鹽、99%沒食子酸、N苯基硫脲、愈創木酚、甲硫氨酸（Met）、AR蒽酮、α乙酸萘酯、固藍B鹽、α萘酚、毒扁豆堿（99%）、牛血清蛋白、核黃素、還原性谷胱甘肽、1氯2，4二硝基苯（CDNB）、3，3′，5，5′四甲基聯苯胺（TMBZ），Macklin公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2?試驗方法

1.2.1?西伯利亞龜象取食

本試驗設置對照和3個取食等級，參照岳文波等［13］的方法，根據實際情況略有改動。蕎麥出苗后18?d，在每株蕎麥中部葉片接種西伯利亞龜象成蟲10頭，共接種30株，用紗網套住整株蕎麥防止其逃逸。

以未接蟲的健康蕎麥植株作為對照。

輕度取食為蕎麥葉片上有零星部分被取食;中度取食為蕎麥葉片上有1/3以下面積被取食;重度取食為蕎麥葉片上有1/3～2/3面積被取食。對照及不同處理均在取食48?h后剪取葉片測定營養物質、次生代謝物質含量及防御酶活性。同時取西伯利亞龜象測定其體內解毒酶活性。

1.2.2?西伯利亞龜象取食后蕎麥葉片營養物質和次生代謝物含量測定

營養物質含量測定：分別采用考馬斯亮藍G250法［14］、蒽酮比色法［15］測定可溶性蛋白、可溶性糖的含量。

次生代謝物質含量測定：類黃酮、總酚含量的測定分別采用蘆丁比色法和福林法［16］，單寧的測定采用福林酚比色法［17］。

1.2.3?西伯利亞龜象取食后蕎麥葉片中防御酶和蛋白酶抑制劑活性測定

防御酶活性測定：比色法測定過氧化氫酶（CAT）活性［15］，苯丙氨酸比色法測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性［18］。

蛋白酶抑制劑活性測定：蕎麥葉片胰蛋白酶抑制劑（TI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）的活性測定采用張健等［19］的方法進行測定。

1.2.4?西伯利亞龜象取食蕎麥葉片后解毒酶活性測定

羧酸酯酶（CarE）活性的測定參考van?Asperen［20］的方法，谷胱甘肽S轉移酶（GSTs）活性的測定參考Habig等［21］的方法，細胞色素P450活性的測定參考Brogdon等［22］的方法。

1.3?數據處理與分析

采用Microsoft?Excel?2010軟件對數據進行處理和繪圖，采用SPSS?25.0統計分析軟件對數據進行方差分析，采用Duncan氏多重比較檢驗各處理間測定指標的差異顯著性。

2?結果與分析

2.1?不同品種蕎麥被西伯利亞龜象取食后葉片主要生理指標的變化

2.1.1?蕎麥葉片可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化

西伯利亞龜象不同程度取食均誘導了蕎麥葉片可溶性性蛋白和可溶性糖含量的增加，取食程度越重2種物質含量增加越多。在供試的4個蕎麥品種中，抗蟲品種中可溶性蛋白和可溶性糖增加幅度較大，經重度取食誘導的抗性品種‘蒙0207和‘晉苦6可溶性蛋白含量比對照上升265%和481%，而感蟲品種‘蒙0208和‘晉苦2僅比對照上升86%和232%（表1）。

2.1.2?蕎麥葉片次生代謝物質含量的變化

無論是抗蟲品種還是感蟲品種，西伯利亞龜象不同程度取食均誘導單寧、總酚和類黃酮含量增加，其中單寧和總酚含量隨西伯利亞龜象取食程度增加而增加。在供試的4個蕎麥品種中，西伯利亞龜象重度取食后，感蟲品種‘蒙0208和‘晉苦2單寧含量分別增加80%和96%，而抗蟲品種‘蒙0207和‘晉苦6僅分別增加56%和48%，而總酚含量的變化在蕎麥抗、感蟲品種間無明顯規律。西伯利亞龜象取食誘導蕎麥葉片類黃酮含量顯著增加，但同一品種不同取食程度之間除‘蒙0208“輕度”取食顯著少于中、重度（P<0.05）外，其他品種不同取食程度間沒有顯著差異（表2）。

2.1.3?蕎麥葉片防御酶活性的變化

西伯利亞龜象不同程度取食均能誘導蕎麥葉片過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性提高，其中CAT活性在中度和重度取食下顯著提高，PAL活性在重度取食下顯著升高。在供試的4個蕎麥品種中，感蟲品種‘蒙0208和‘晉苦2被西伯利亞龜象重度取食后PAL活性上升幅度較抗蟲品種更大，其PAL活性分別增長116%和203%，而抗蟲品種‘蒙0207和‘晉苦6僅分別增長89%和72%（表3）。

2.1.4?蕎麥葉片蛋白酶抑制劑活性的變化

西伯利亞龜象不同程度取食誘導了蕎麥葉片內胰蛋白酶抑制劑（TI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）活性升高，取食程度越重，蕎麥葉片的蛋白酶抑制劑活性也越高。不同取食程度下，抗蟲品種的TI和CI活性均顯著高于感蟲品種（P<0.05）。此外，在供試的4個蕎麥品種中，感蟲品種‘蒙0208和‘晉苦2被取食后TI和CI活性上升幅度較抗蟲品種更大，其中TI活性分別是對照的5.18倍和3.09倍，而抗蟲品種‘蒙0207和‘晉苦6?TI活性分別是對照的2.07倍和1.93倍（表4）。

2.2?取食不同品種蕎麥后西伯利亞龜象體內3種解毒酶活性的變化

西伯利亞龜象成蟲取食抗蟲品種蕎麥葉片后，體內羧酸酯酶（CarE）、谷胱甘肽S轉移酶（GSTs）活性顯著高于取食感蟲品種后的活性（P<0.05）。其中取食甜蕎抗蟲品種‘蒙0207比取食其感蟲品種‘蒙0208的CarE活性上升了85%，取食苦蕎抗蟲品種‘晉苦6比取食其感蟲品種‘晉苦2的CarE活性上升了79%。取食甜蕎抗蟲品種‘蒙0207后，西伯利亞龜象體內GSTs活性是取食感蟲品種‘蒙0208的1.3倍;取食苦蕎抗蟲品種‘晉苦6的GSTs活性是取食感蟲品種‘晉苦2的1.6倍。取食不同抗感性品種的蕎麥葉片后，西伯利亞龜象體內細胞色素P450活性沒有顯著性差異（圖1）。

3?結論與討論

植物的誘導抗性是一種普遍存在的現象，大量研究表明，一些物理因素如人工修剪枝葉、針刺等機械損傷，或昆蟲取食都可以誘導植物的抗蟲性［23］。營養物質是寄主植物和植食性昆蟲進行正常生命活動所必需的能源物質，昆蟲通過取食從寄主植物中獲取能量，以滿足自身生長發育，而植物受到損傷后會調整自身營養物質含量以適應逆境。徐偉［24］的研究表明，興安落葉松受損后可溶性蛋白的含量升高。尹飛等［25］在研究小菜蛾Plutella?xylostella取食對寄主植物蛋白質和糖含量影響時發現，小菜蛾取食后白菜菜心內蛋白質含量顯著升高，葡萄糖含量明顯下降。本試驗結果表明，西伯利亞龜象不同程度取食均能誘導可溶性蛋白和可溶性糖含量升高，但只有重度取食才能誘導可溶性糖含量顯著升高，這表明損傷程度對植物的防御反應十分重要，只有在損傷達到一定程度時，才能引起植物體內物質含量的顯著變化。不同抗性品種在遭受昆蟲取食后發生的防御反應也不完全相同。周福才等［26］在棉蚜Aphis?gossypii取食對黃瓜葉片中抗生物質的影響研究中發現，棉蚜取食后，抗蟲品種黃瓜葉片中可溶性糖含量的變化幅度高于感蟲品種。李傳明等［27］研究指出，被煙粉虱Bemisia?tabaci取食后，抗蟲品種的可溶性蛋白和可溶性糖含量的變化幅度明顯高于感蟲品種。本研究發現，供試的4個蕎麥品種中，抗蟲品種受損傷后可溶性蛋白和可溶性糖含量上升幅度較感蟲品種更大，與他們的研究結果一致。陳磊等［28］研究發現，蕎麥對西伯利亞龜象的抗性與葉片蛋白質和可溶性糖含量顯著正相關，抗蟲品種通過增加營養物質的含量抵抗昆蟲的取食。

植物遭受昆蟲取食后，植株內某些防御性次生代謝物質的含量會在短時間內迅速升高，起到毒殺昆蟲或引誘昆蟲天敵的作用［29］。不同抗性品種在遭受損傷后的防御反應也不完全相同。李傳明等［27］的研究顯示，受到煙粉虱取食后，感蟲辣椒品種的酚類化合物含量上升幅度高于抗蟲品種。

任佳［30］的研究發現，不同品種黃瓜接種瓜蚜后，抗蟲品種酚類化合物及黃酮類化合物的含量始終高于感蟲品種。本研究發現，供試的4個蕎麥品種中，感蟲品種被取食后單寧含量上升幅度較抗蟲品種更大，而總酚和類黃酮2種植物次生代謝物質含量在抗蟲和感品種間沒有明顯規律。這表明在昆蟲取食誘導的過程中，植物次生代謝物質含量向著有利于提高自身抗蟲性的方向改變。

在遭受逆境時，植物細胞中會產生大量的活性氧自由基，活性氧過量累積會損傷植物，過氧化氫酶（CAT）是植物體內參與活性氧清除的重要酶系，其活性高低能反映出植物抗氧化能力的強弱［31］。植物受到損傷后產生的一系列次生代謝物質主要通過苯丙烷類代謝途徑完成，苯丙氨酸解氨酶（PAL）在苯丙烷循環中起著關鍵作用，是植物體內次生代謝反應的關鍵酶和限速酶。PAL也是一種可誘導的酶，在病原體、蟲害、低溫等一系列生物和非生物脅迫下其活性會發生變化，因此其活性可以作為評價植物抗逆性強弱的指標［3234］。研究表明，短期的昆蟲取食可以誘導植物葉片相關防御性物質含量升高，從而提高植物的抗蟲性［35］。

吳瓊［36］的研究發現，在響應豌豆蚜取食的過程中，苜?？瓜x品種的PAL、POD和SOD等防御酶活性增加量均高于敏感品種。本試驗研究表明，感蟲品種被西伯利亞龜象取食后PAL活性上升幅度較抗蟲品種相對更大，而CAT在抗、感品種間沒有明顯規律。本文研究結論與此結論不同，推測是不同寄主植物響應不同昆蟲取食的防御酶不同，另外本文中，西伯利亞龜象取食后，蕎麥感蟲品種中單寧含量及PAL活性增加量均高于抗蟲品種，這表明蕎麥可能存在特定的抗性機制來應對昆蟲的取食，尚需進一步試驗來揭示。

植物蛋白酶抑制劑是一類對蛋白水解酶有抑制活性的小分子蛋白質，在生物中普遍存在，是植物重要的防御物質之一［37］。石媛媛等［38］的研究發現，油松毛蟲?Dendrolimus?tabulaeformis不同程度取食能夠誘導胰蛋白酶抑制劑（TI）和胰凝乳蛋白酶抑制劑（CI）活性增加，進而增強油松的抗蟲性。王琪等［39］在研究剪葉或昆蟲取食對興安落葉松蛋白酶抑制劑的影響中發現，落葉松毛蟲Dendrolimus?superans取食或修剪均可誘導興安落葉松內TI和CI活性發生顯著變化，相同損傷程度下，蟲害誘導的TI活性高于修剪損傷誘導的活性。本試驗研究結果表明，西伯利亞龜象不同程度取食誘導了蕎麥葉片內TI和CI活性發生變化，相同損傷程度下，甜蕎和苦蕎抗蟲品種中TI和CI活性均顯著高于感蟲品種。這與王琪等的研究結果一致，說明在損傷程度相同的情況下，昆蟲唾液中的某些化學成分或者其特殊的取食方式，可能激發蕎麥產生了特定的防御反應。

在植物與昆蟲的長期協同進化過程中，昆蟲在面對外界環境以及植物防御機制的脅迫時，逐漸演化出許多適應機制，以保護自身免受傷害。昆蟲解毒酶系以及解毒機制在應對植物次生代謝物質的脅迫過程中發揮著重要作用。谷胱甘肽S轉移酶（GSTs）、羧酸酯酶（CarE）和細胞色素P450酶系（CYP450）是昆蟲體內最重要的解毒酶［40］。陳德霞等［41］研究了典型草原4種優勢種牧草次生代謝物對亞洲小車蝗Oedaleus?asiaticus解毒酶活性的影響，發現取食冷蒿和羊草的亞洲小車蝗體內CarE、CYP450和GSTs的活性均顯著高于取食克氏針茅的亞洲小車蝗，得出亞洲小車蝗對冷蒿和羊草具有高解毒活性，對克氏針茅具有低解毒活性的結論。王亞軍等［42］發現，苦參堿、氧化苦參堿和山奈酚等次生代謝物對舞毒蛾Lymantria?dispar?GSTs和CarE活性的抑制作用是其具有殺蟲活性的原因之一。本試驗中，西伯利亞龜象成蟲取食甜蕎和苦蕎抗蟲品種后體內CarE和GSTs活性均顯著高于取食感蟲品種的個體，而取食抗性品種和感蟲品種的西伯利亞龜象成蟲體內P450活性無顯著差異。這表明在西伯利亞龜象的解毒機制中，CarE和GSTs可能發揮著重要的作用。

本研究分別從植物和昆蟲2個方面來探索蕎麥不同品種對西伯利亞龜象的抗性機制，發現西伯利亞龜象取食能誘導蕎麥抗蟲性物質含量的變化，為蕎麥抗蟲品種的選育提供了理論基礎。通過對取食蕎麥不同抗性品種的西伯利亞龜象體內解毒酶的測定，有助于了解植物與昆蟲之間的互作機制，為蕎麥害蟲西伯利亞龜象的防治提供理論依據。

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