柑橘黃龍病菌亞洲種分子檢測引物評價及絕對定量PCR體系優化

謝帆 龔順 王澤瓊 肖玉雄 杜志強 仝鑄 何秀娟 邱文明 孫中海 潘志勇 肖翠

果蔬園藝作物種質創新與利用全國重點實驗室，?武漢?430070;?3.?宜昌三峽百景宜農業科技發展有限公司，?宜昌?443600）

摘要

柑橘黃龍病是對柑橘產業最具毀滅性的病害，目前沒有可用的有效藥劑和抗病品種，分子檢測對黃龍病有效防控至關重要。本研究對國內外常用的常規PCR和巢式PCR檢測引物進行評價，針對多拷貝的nrdB和16S?rDNA基因，構建質粒標準品并篩選適用于絕對定量PCR的最佳質粒。結果表明，使用Es?Taq?MasterMix對感染?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）的柑橘樣品進行常規PCR檢測時，在評價的16對引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877靈敏度最高，推薦同時使用檢測黃龍病菌含量低的樣品；各組巢式PCR檢測引物有其適用擴增體系，部分引物用Es?Taq?MasterMix擴增時出現非特異性擴增，F1/B1→F3/B3則適用Es?Taq?MasterMix體系，且最高可穩定特異檢出105倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-3?ng/μL），是靈敏度最高的引物組，OI1/OI2c→S3/S4在Es?Taq?MasterMix和Ex?Taq?DNA聚合酶體系中均可穩定特異檢出104倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-2?ng/μL），是適用擴增體系最廣的引物組；構建的5個絕對定量PCR質粒標準品中，pnrdB83擴增效率最接近100%，且在2次重復試驗中波動最小，穩定性最強，并且作為標準品對黃龍病待測樣品進行絕對定量時，各樣品在2次重復試驗中的拷貝數差值最小，是本研究篩選的最佳質粒。本研究的結果將為柑橘黃龍病菌的定性和定量分子檢測提供參考。

關鍵詞

柑橘黃龍病;?常規PCR;?巢式PCR;?絕對定量PCR;?引物評價

中圖分類號：

S?436.661.12

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023396

Molecular?detection?primer?evaluation?and?absolute?quantitative?PCR?system?optimization?of?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）

XIE?Fan1，2#，?GONG?Shun1，2#，?WANG?Zeqiong1，?XIAO?Yuxiong1，?DU?Zhiqiang3，?TONG?Zhu1，HE?Xiujuan1，?QIU?Wenming1，?SUN?Zhonghai1，?PAN?Zhiyong2，?XIAO?Cui1*

（1.?Hubei?Key?Laboratory?for?Germplasm?Innovation?and?Utilization?of?Fruit?Trees，?Institute?of?Fruit?and?Tea，?Hubei?Academy

of?Agricultural?Sciences，?Wuhan?430064，?China;?2.?National?Key?Laboratory?for?Germplasm?Innovation?and?Utilization?of

Horticultural?Crops，?College?of?Horticulture?and?Forestry?Sciences，?Huazhong?Agricultural?University，?Wuhan?430070，?China;

3.?Yichang?Three?Gorges?Baijingyi?Agricultural?Science?and?Technology?Development?Co.，?Ltd.，?Yichang?443600，?China）

Abstract

Citrus?Huanglongbing?（HLB）?is?the?most?devastating?disease?for?the?citrus?industry.?Currently，?there?are?no?effective?cure?and?diseaseresistant?varieties?available.?Molecular?detection?is?crucial?for?the?effective?prevention?and?management?of?Huanglongbing.?In?this?study，?we?evaluated?the?commonly?and?worldwidely?employed?primers?for?conventional?PCR?and?nested?PCR?detection，?and?constructed?plasmid?standards?based?on?multiplecopy?nrdB?and?16S?rDNA?genes，?and?then?screened?the?best?plasmids?suitable?for?absolute?quantitative?PCR.?The?results?showed?that?among?the?16?pairs?of?primers?evaluated?in?this?study，?OI1/OI2c，?Las606/LSS?and?HLBF468/R877?had?the?highest?sensitivity?when?using?Es?Taq?MasterMix?for?conventional?PCR?detection?of?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）?infecting?citrus?samples，?which?was?recommended?to?detect?samples?with?low?CLas?titer.?Each?nested?PCR?detection?primer?had?their?applicable?amplification?systems，?and?some?primers?showed?strong?nonspecific?amplification?when?amplified?with?Es?Taq?MasterMix，?while?F1/B1→F3/B3?were?suitable?for?Es?Taq?MasterMix?system，?and?could?stably?and?specifically?detect?the?105fold?diluted?citrus?total?DNA?samples?（2×10-3?ng/μL）?infected?with?CLas，?which?was?the?primer?set?with?the?highest?sensitivity.?OI1/OI2c→S3/S4?could?stably?and?specifically?detect?104fold?diluted?citrus?total?DNA?samples?（2×10-2?ng/μL）?infected?with?CLas?both?in?Es?Taq?MasterMix?and?Ex?Taq?DNA?polymerase?systems，?which?was?the?primer?set?with?the?widest?applicable?amplification?systems.?Among?the?five?plasmid?standards?constructed?for?absolute?quantitative?PCR，?pnrdB83?was?the?best?plasmid?whose?amplification?efficiency?was?closest?to?100%?and?with?the?least?fluctuation?and?strongest?stability?between?two?repeated?experiments.?Besides，?when?used?pnrdB83?as?a?standard?for?absolute?quantification?of?Huanglongbing?samples，?the?copy?number?difference?of?each?sample?between?the?two?repeated?experiments?is?the?smallest.?The?results?will?provide?a?reference?for?qualitative?and?quantitative?molecular?detection?of?CLas.

Key?words

citrus?Huanglongbing;?conventional?PCR;?nested?PCR;??absolute?quantitative?PCR;?primer?evaluation

柑橘是世界第一大水果［1］，目前我國柑橘產業規模位居世界首位，產量占世界的1/3左右［2］，是我國南方鄉村振興的支柱產業［3］。柑橘黃龍病是對柑橘產業最具毀滅性的病害，其病原菌是無法在培養基上分離培養的韌皮部桿菌屬Candidatus?Liberibacter細菌［4］。柑橘受到黃龍病菌侵染后樹體長勢嚴重削弱，植株表現葉片斑駁黃化，果實畸形且著色不均等癥狀［57］，目前沒有針對黃龍病的有效藥劑和抗病品種［8］，主要通過嚴格檢疫、及時砍除病樹、應用無病苗木、防治傳播媒介柑橘木虱進行防控［3，910］。

嚴格檢疫和及時砍除病樹等黃龍病防控措施均需依靠對黃龍病的準確診斷。黃龍病田間診斷多以葉片斑駁黃化、“紅鼻子果”等典型癥狀作為判斷依據，但除結果期的“紅鼻子果”外，葉片癥狀也可能由缺素等引起，故田間診斷只能作為初步判斷依據。處于黃龍病潛伏期和早期無癥狀的柑橘植株，則需要使用更為有效的分子檢測進行診斷。常規PCR、巢式PCR、熒光定量PCR是目前各實驗室常用的柑橘黃龍病菌分子檢測方法。16S?rDNA基因、β操縱子（rplKAJLrpoBC）和外膜蛋白基因（OMP）等保守看家基因被作為分子檢測靶標廣泛用于柑橘黃龍病菌常規PCR和巢式PCR檢測的特異引物設計［10］。常規PCR和巢式PCR可以對黃龍病菌進行定性檢測，但由于黃龍病菌在柑橘植株體內分布不均，各分子檢測所用組織部位不同，引物靈敏度各異，PCR反應受模板DNA質量和濃度、擴增反應體系和程序等影響，易導致同一樣品在不同實驗室檢測結果不一致而出現假陽性或假陰性。相比常規PCR和巢式PCR，定量PCR靈敏度更高，且可對病原菌含量進行定量。Li等以16S?rDNA基因為分子靶標，設計了柑橘黃龍病菌亞洲種、非洲種和美洲種特異的熒光定量PCR引物和探針［11］，并建立了絕對定量PCR體系［12］。為了提高檢測靈敏度，Zheng等針對具有5個拷貝的nrdB基因設計了RNRf/RNRr引物，檢測靈敏度可提高3倍［13］，但基于該引物的qPCR體系僅通過Ct值分析進行黃龍病菌的定量，沒有建立相應的絕對定量PCR體系。

本研究固定取樣部位和模板DNA濃度，經qPCR檢測后，篩選陽性樣品DNA并混合為單一黃龍病菌陽性樣品，用此樣品對國內外常用的常規PCR和巢式PCR分子檢測引物進行評價，分別篩選靈敏度高、特異性好、穩定性強的檢測引物，為柑橘黃龍病菌常規定性分子檢測提供參考。同時針對具有5個拷貝的nrdB基因和3個拷貝16S?rDNA基因，分別構建質粒和絕對定量PCR體系并進行評價，篩選適用于定量檢測黃龍病菌的最佳質粒及引物，為柑橘黃龍病菌定量分子檢測提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試樣品

常規PCR和巢式PCR檢測引物評價試驗所用柑橘黃龍病陽性樣品采集自廣西壯族自治區北海市合浦縣沙田鎮柑橘黃龍病重癥果園，品種為‘愛媛28號，植株具有典型黃龍病癥狀。取植株上黃龍病菌高度富集的主葉脈和葉柄，參考本實驗室改良的CTAB法［14］提取樣本DNA。用超微量核酸濃度測定儀測定樣品DNA濃度，并統一定量至200?ng/μL，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA濃度定量準確性以及DNA質量。用高靈敏度引物RNRr/RNRf［13］對樣品DNA進行qPCR檢測，以本實驗室人工氣候箱中實生播種，經qPCR檢測為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對照，以超純水作為清水對照，每樣品設置3個重復。根據qPCR檢測結果，將Ct值≤20，且熔解曲線吸收峰為單峰的樣品確定為黃龍病陽性樣品，并將這些陽性樣品DNA混合，以獲得足量單一黃龍病菌陽性樣品DNA用于后續試驗。

1.2?常規PCR檢測引物評價

根據黃龍病菌常規PCR檢測相關國內外文獻以及國家發明專利，收集了16對PCR檢測引物進行比較，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成（表1）。對上述黃龍病陽性樣品DNA進行10倍梯度稀釋，取101，102，103，104，105，106，107，108，109倍稀釋的黃龍病陽性樣品DNA分別作為模板進行常規PCR擴增，以本實驗室人工氣候箱中實生播種，經qPCR檢測為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對照，以超純水作為清水對照。反應體系：2×Es?Taq?MasterMix（Dye）12.5?μＬ，10?μmol/L上、下游引物各1?μＬ，模板DNA?1.25?μＬ，ddH2O補足至總體積25?μＬ。反應條件為：94℃預變性2?min；94℃變性30?s，53～67℃退火30?s（各引物退火溫度見表1），72℃延伸15～45?s（延伸時間根據各引物擴增片段大小進行調整，各引物擴增片段大小見表1），35個循環；72℃延伸2?min。反應完成后，取10?μL?PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，并于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.3?巢式PCR檢測引物評價

根據黃龍病菌巢式PCR檢測相關國內外文獻，收集了5組巢式/半巢式PCR檢測引物，此外根據βoperon基因序列對P535f/r、P400f/r兩對引物序列進行糾正，設計P535CORf/r、P400CORf/r兩對引物，引物由武漢天一輝遠生物科技有限公司合成（表2）。分別采用Es?Taq?MasterMix（Dye）和Ex?Taq?DNA?Polymerase（TaKaRa）反應體系進行比較。Es?Taq?MasterMix（Dye）的反應體系和反應條件參照1.2常規PCR檢測。Ex?Taq?DNA?Polymerase（TaKaRa）反應體系：TaKaRa?Ex?Taq（5?U/μＬ）?0.125?μＬ，10×Ex?Taq?Buffer（Mg2+?plus）（20?mmol/L）?2.5?μＬ，dNTPs（各2.5?mmol/L）?2?μＬ，10?μmol/L上、下游引物各1?μＬ，模板DNA?1.25?μＬ，ddH2O補足至總體積25?μＬ；反應條件為：98℃變性10?s，53～62℃退火30?s（各引物退火溫度見表2），72℃延伸30～60?s（延伸時間根據各引物擴增片段大小進行調整，各引物擴增片段大小見表2），35個循環。兩種反應體系第1輪PCR擴增模板為10倍梯度稀釋系列（101～109）黃龍病陽性樣品DNA、黃龍病陰性對照和清水對照，第2輪PCR擴增模板為第一輪PCR產物的25倍稀釋液。反應完成后，取10?μL?PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳（TaKaRa?Ex?Taq?DNA?Polymerase?PCR產物需加入2?μL?6×Loading?buffer混勻后再上樣），電泳結束后于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.4?絕對定量PCR質粒構建及標準曲線建立

圍繞具有5個拷貝的nrdB基因以及具有3個拷貝的16S?rDNA基因構建質粒。針對nrdB基因設計2對新引物RNRn1f/RNRn1r和RNRn2f/RNRn2r進行PCR擴增，擴增片段大小分別為?83?bp?和113?bp，同時對文獻已報道的引物RNRf/RNRr［13］，HLBas/HLBr［1112］，OI1/OI2c［15］進行PCR擴增，擴增片段大小分別為81、76?bp和1?160?bp。將PCR擴增獲得的目的片段，經膠回收純化后，通過TA克隆，克隆到pCloneEZTA（1?865?bp）載體中，挑取陽性克隆經測序確定后獲得用于絕對定量PCR的重組質粒，分別命名為pnrdB83（1?948?bp），pnrdB113（1?978?bp），pnrdB81（1?946?bp），p16SrDNA76?（1?941?bp），p16SrDNA1160（3?025?bp），其質粒濃度分別為123.35，118.55，140.25，255.00，121.05?ng/μL。根據公式每微升拷貝數（拷貝/μL）=［質粒濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023］/（質粒DNA長度×660），計算上述質粒的拷貝數，進而計算出質?？截悢档膶抵捣謩e為10.76，10.74，10.82，11.08，10.56。對上述各質粒進行10倍梯度稀釋，取102～107倍梯度稀釋的pnrdB83、pnrdB113、pnrdB81質粒DNA分別作為模板進行qPCR擴增，取103～108倍梯度稀釋的p16SrDNA76質粒DNA作為模板進行qPCR擴增，取103～107倍梯度稀釋的p16SrDNA1160質粒DNA作為模板進行qPCR擴增，以本實驗室人工氣候箱中實生播種，經qPCR檢測為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對照，以超純水作為清水對照，設置3孔機械重復，兩次重復試驗（第2次重復試驗將p16SrDNA76質粒稀釋為133.85?ng/μL，其質?？截悢档膶抵禐?0.80，取102～107倍梯度稀釋的質粒DNA作為模板進行qPCR擴增）。pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76質粒構建的目的片段擴增引物直接用于它們的qPCR反應，p16SrDNA1160質粒的qPCR反應引物為HLBas/HLBr。qPCR反應體系：2×SYBR?Green?qPCR?Mix（莫納生物）5μL，10?μmol/L上、下游引物各0.2?μＬ，質粒DNA?1?μＬ，ddH2O補足至總體積10?μＬ。qPCR反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性10?s，60～62℃退火10?s（各引物退火溫度見表3），72℃延伸15?s，40個循環；熔解曲線分析：95℃?15?s（1.6℃/s），60℃?1?min（1.6℃/s），95℃?15?s（0.15?℃/s）。反應完成后，以質粒拷貝數的對數值為縱坐標（Y），Ct值為橫坐標（X），利用Excel進行線性回歸分析繪制標準曲線，獲得線性回歸方程并計算相關系數R2，根據公式（10-斜率-1）計算擴增效率（AE：amplification?efficiency）。

1.5?絕對定量PCR體系在田間樣品黃龍病菌含量分析中的應用

對實驗室前期經常規PCR（引物：OI1/OI2c）和qPCR（引物：RNRf/RNRr）Ct值分析確定的19個黃龍病陽性DNA樣品［14］進一步進行絕對定量PCR分析。分別對pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76，p16SrDNA1160等5個質粒進行10倍梯度稀釋，利用各質粒對應的qPCR引物對各質粒的梯度稀釋液和19個黃龍病陽性DNA樣品（200?ng/μL）進行qPCR反應，反應體系和反應條件參考1.4，設置3孔機械重復，2次重復試驗。反應完成后，以質?？截悢档膶抵禐榭v坐標（Y），Ct值為橫坐標（X），利用Excel進行線性回歸分析繪制標準曲線，獲得線性回歸方程，將各待測樣品的Ct值代入線性回歸方程中計算出各待測樣品DNA拷貝數的對數值。

2?結果與分析

2.1?常規PCR檢測引物特異性和靈敏度比較

以同一黃龍病陽性柑橘總DNA的10倍梯度稀釋樣品為模板，使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進行PCR擴增，評價本研究收集的柑橘黃龍病菌常規PCR檢測引物。結果如圖1所示：?1）Hlbsf/Hlbsr有很強的非特異性擴增且不能擴增到目的條帶（507?bp），HLBF/R和CalsppsecF/R在陰性對照、清水對照以及所有梯度稀釋樣品中均能擴增到目的條帶，這3對引物不適宜使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進行柑橘黃龍病菌PCR檢測。2）其余13對引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS、HLBF468/R877靈104倍稀釋（濃度為2×101～2×10-2?ng/μL）感染CLas柑橘總DNA樣品。?3）引物組OI1/OI2c→S3/S4在兩種反應體系中均可穩定特異檢出101～104倍稀釋（濃度為2×101～2×10-2?ng/μL）樣品，用Ex?Taq?DNA?Polymerase進行擴增時偶爾可檢出濃度低于2×10-2?ng/μL?的樣品。4）引物組fD1/rD1→OI1/OI2c利用Es?Taq?MasterMix（Dye）進行擴增時最高可穩定特異檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），利用Ex?Taq?DNA聚合酶進行擴增時最高可穩定特異檢出103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL），偶爾可檢出濃度低于2×10-1?ng/μL?的樣品。5）引物組F1/B1→F3/B3利用Es?Taq?MasterMix（Dye）進行擴增時最高可穩定特異檢出105倍稀釋樣品（2×10-3?ng/μL），偶爾可檢出濃度低于2×10-3?ng/μL?的樣品，利用Ex?Taq?DNA聚合酶進行擴增時最高可穩定檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），但有非特異性擴增條帶。

2.3?絕對定量PCR質粒和引物穩定性比較

對構建的質粒經10倍梯度稀釋后進行qPCR反應，經2次重復試驗獲得各質粒的標準曲線和線性回歸方程并計算相關系數R2、擴增效率（AE），平均ΔCt值，如表4和圖3所示，2次重復試驗下，pnrdB81質粒的相關系數分別為0.996?9、0.998?2，擴增效率分別為111.35%、101.28%，平均ΔCt值分別為2.97、3.25；pnrdB83質粒的相關系數分別為0.995?2、0.994，擴增效率分別為99.34%、98.29%，平均ΔCt值分別為3.29、3.26；pnrdB113質粒的相關系數分別為0.995?7、0.991?8，擴增效率分別為105.49%、91.87%，平均ΔCt值分別為3.08、3.69；p16SrDNA76質粒的相關系數分別為0.994?1、0.992?1，擴增效率分別為97.61%、100.26%，平均ΔCt值分別為3.26、3.15；p16SrDNA1160質粒的相關系數分別為0.999?6、0.998，擴增效率分別為66.19%、62.97%，平均ΔCt值分別為4.51、4.75。上述結果表明，p16SrDNA1160質粒的擴增效率未能達到qPCR反應擴增效率范圍90%～110%，不適宜用于絕對定量qPCR分析；pnrdB83質粒的擴增效率最接近于理想擴增效率100%，其平均ΔCt值也最接近于理想值3.33，且在2次重復試驗下的波動最小，穩定性最強，因此pnrdB83為本研究篩選的最佳質粒。

敏度最高，最高可檢出104倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-2?ng/μL）；Omp1218f/2026r、16sf/16sr最高可檢出103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）；UP2/DP2、CQULA03F/03R、SEQIDNO.1/NO.2最高可檢出102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）；P1/P2、P535f/r、OI2/23S1最高可檢出的稀釋倍數雖然為102，但102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）擴增條帶微弱；S3/S4、A2/J5最高可檢出的稀釋倍數雖然為102，但能擴增出非特異條帶且102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）擴增條帶微弱；因此13對引物的靈敏度由高到低依次為：OI1/OI2c=Las606/LSS=HLBF468/R877＞Omp1218f/2026r=16sf/16sr＞UP2/DP2=CQULA03F/03R=SEQIDNO.1/NO.2＞P1/P2=P535f/r=OI2/23S1＞S3/S4=A2/J5。

2.2?巢式PCR檢測引物特異性和靈敏度比較

以同一黃龍病陽性柑橘總DNA的10倍梯度稀釋樣品為模板，使用Es?Taq?MasterMix（Dye）和Ex?Taq?DNA?Polymerase分別進行PCR擴增，評價本研究收集的柑橘黃龍病菌巢式PCR檢測引物。結果如圖2所示：1）A2/J5→A2/J5n這一組引物用兩種反應體系進行擴增，均在陰性對照、清水對照以及所有梯度稀釋樣品中擴增到目的條帶，因此不適宜用本研究的柑橘黃龍病菌巢式PCR檢測體系。2）引物組P535CORf/r→P400CORf/r以及P535f/r→P400f/r不宜使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進行擴增（陰性對照、清水對照以及所有梯度

2.4?絕對定量PCR體系在田間樣品黃龍病菌含量分析中的比較

利用實驗室前期鑒定到的19個黃龍病陽性柑橘DNA樣品對5個質粒的絕對定量分析效果進行比較，根據2次重復試驗結果，如表5所示，以pnrdB81質粒作為標準品制作標準曲線計算各樣品拷貝數，2次重復試驗之間樣品拷貝數最大差值為4.14，最小差值為2.93；以pnrdB83質粒作為標準品，樣品拷貝數最大差值為0.88，最小差值為0.83；以pnrdB113質粒作為標準品，樣品拷貝數最大差值為4.32，最小差值為2.61；以p16SrDNA76質粒作為標準品，樣品拷貝數最大差值為4.38，最小差值為4.05；以p16SrDNA1160質粒作為標準品，樣品拷貝數最大差值為1.37，最小差值為1.22；上述結果表明用pnrdB83質粒作為標準品對待測樣品中黃龍病菌含量進行定量分析的穩定性最強，因此pnrdB83為本研究篩選的最佳質粒。

3?結論與討論

柑橘黃龍病是對柑橘產業最具毀滅性的病害，目前沒有可用的有效藥劑和抗病品種，通過分子檢測進行黃龍病診斷對黃龍病有效防控至關重要。本研究利用同一黃龍病陽性柑橘樣品DNA，在高效便捷且價格低廉的Es?Taq?MasterMix體系中，對16對常規PCR檢測引物進行了評價。Las606/LSS和HLBF468/R877是研究人員設計的用于常規PCR的高靈敏度新引物［1617］。梁亮等［17］研究表明感染黃龍病菌的柑橘葉片DNA稀釋103倍，引物HLBF468/R877仍然可以擴增出特異性條帶，在本研究中該引物不僅可對103倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-1?ng/μL）擴增出明亮條帶，還可對104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL）擴增出微弱條帶，說明該引物的靈敏度確實高，同時利用本研究的擴增體系可將該引物的靈敏度提高10倍。Fujikawa?等［16］研究表明對田間樣品進行檢測時，Las606/LSS檢出的黃龍病陽性率高于使用OI1/OI2c檢測，且對某些樣品Las606/LSS僅用微量DNA模板即可檢出黃龍病菌，OI1/OI2c則不能檢出。在本研究中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877雖然均可檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），但OI1/OI2c對103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）擴增條帶微弱，而Las606/LSS和HLBF468/R877對103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）進行擴增時，條帶仍然非常明亮；以此來看，針對病原菌含量低的樣品，使用Las606/LSS和HLBF468/R877的檢出可能性可能比使用OI1/OI2c高，因此針對田間病原菌含量低的樣品，利用常規PCR進行檢測時，為了避免漏檢，建議同時使用OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877進行檢測。相比16S?rDNA基因在黃龍病菌亞洲種和非洲種之間高達97.5%的同源性，外膜蛋白OMP基因和β操縱子rplAJ位點在亞洲種和非洲種之間的同源性只有78.4%和70%，因此這2個基因除了可用于常規PCR檢測外，還可用于黃龍病菌的分子分型檢測［18］。基于OMP基因的Omp1218f/2026r引物在本研究中的檢測靈敏度僅次于前3對引物，Deng等［18］還根據其在不同菌系之間的SNPs，對源自柚子上的黃龍病菌菌系進行了分型分析。基于rplAJ位點的A2/J5引物可根據擴增片段大小不同區分亞洲種（703?bp）和非洲種（669?bp），且該引物可檢測稀釋103倍的黃龍病感病柑橘樣品DNA［27］，但在本研究中該引物僅可在稀釋101～102倍的感病柑橘樣品DNA中擴增到微弱的703?bp條帶，且伴隨一條500?bp左右的非特異擴增條帶，結果不一致的原因可能是本研究所用擴增體系與Hocquellet等［27］的體系不同。CalsppsecF/R、HLBF/R、Hlbsf/Hlbsr等引物也因其非特異性擴增，不適宜使用本研究的常規PCR擴增體系。

通常巢式PCR的靈敏度較常規PCR高，因此針對田間病原菌含量低的樣品，使用巢式PCR可以提高檢出率。本研究利用同一黃龍病陽性柑橘樣品DNA，對6組巢式PCR檢測引物進行了評價。本研究常規PCR大部分引物僅可檢出102倍以內稀釋樣品，但巢式PCR引物，除A2/J5→A2/J5n外，其他引物至少在一種適用體系中可穩定特異檢出104倍以內稀釋樣品，少數引物組還可檢出105倍稀釋樣品，說明巢式PCR比常規PCR靈敏度高102～103倍。本研究常規PCR中引物靈敏度最高的OI1/OI2c雖然可檢出稀釋104倍的樣品，但稀釋103～104倍以后的樣品擴增條帶微弱；S3/S4引物經常規PCR僅可檢出102倍以內稀釋樣品，且擴增條帶微弱；但以OI1/OI2c作為第1輪PCR引物，以S3/S4作為第2輪PCR引物的巢式PCR，在Es?Taq?MasterMix和TaKaRa?Ex?Taq?DNA聚合酶體系中均可穩定特異檢出104倍稀釋樣品，且擴增條帶明亮；說明此巢式PCR體系比常規PCR靈敏度至少高100倍。根據本研究巢式PCR的結果發現，不同巢式PCR引物組適用的擴增體系不同，需要根據引物組選擇合適的擴增體系。本研究利用A2/J5引物進行常規PCR時有非特異性擴增，利用A2/J5→A2/J5n進行半巢式PCR擴增時，不論Es?Taq?MasterMix還是Ex?Taq?DNA聚合酶體系，均出現非特異性擴增，該引物不適宜使用本研究的擴增體系。此外，我們對丁芳等［24］設計的P535f/r→P400f/r引物組與黃龍病菌基因組進行比對時，發現引物序列有多處堿基錯誤，因此對其進行了修正，設計了修正引物組，但結果表明2組引物均不適宜用Es?Taq?MasterMix體系，在Ex?Taq?DNA聚合酶體系中兩者靈敏度相當。

常規PCR和巢式PCR僅能對黃龍病菌的有無進行定性判斷，定量PCR不僅靈敏度高，可以對早期病原菌含量低的樣品進行檢測，而且可對黃龍病菌的含量進行定量分析。為了進一步提高檢測靈敏度，研究人員基于多拷貝基因位點開發了高靈敏度定量PCR引物RNRf/RNRr［13］和4CPf/4CPr［32］，并進一步研發了基于雙引物的雙重定量PCR檢測方法［33］，但這些研究均僅通過Ct值分析進行黃龍病診斷，沒有進一步開發基于高靈敏度引物的絕對定量PCR體系。由于不同批次的qPCR反應，即便同一樣品，其Ct值也經常會出現系統性的波動，同一批次內的qPCR反應也會因樣品初始模板量不同而導致Ct值不可比較，因此通過Ct值分析做不到精準定量分析，而基于標準質粒的絕對定量PCR，可在不同批次上利用同一標準質粒作為內標構建標準曲線，進而通過線性回歸方程計算待測樣品病原菌含量，從而剔除qPCR反應在不同批次之間的系統誤差而做到精準定量分析，因此標準質粒在不同批次之間的擴增穩定性直接影響絕對定量PCR分析的準確度。本研究針對具有5個拷貝的nrdB基因，分別構建了標準質粒pnrdB81、pnrdB83和pnrdB113，同時針對具有3個拷貝的16S?rDNA基因，分別構建了標準質粒p16SrDNA76和p16SrDNA1160，并對上述5個標準質粒在不同批次之間的穩定性進行了評價。根據本研究的結果，影響質粒和引物穩定性的核心因素為質粒和引物的擴增效率，2次重復試驗中，pnrdB83質粒擴增效率最接近100%，且波動最小，穩定性最強，因此用于田間樣品含量分析時，樣品拷貝數差值也最?。欢鴓nrdB81、pnrdB113、p16SrDNA76質粒的擴增效率波動相對大，穩定性相對弱，因此用于田間樣品含量分析時，樣品拷貝數差值也相對大；p16SrDNA1160質粒的擴增效率雖然波動較小，用于田間樣品含量分析時樣品拷貝數差值也相對小，但是該質粒擴增效率極低（66.19%、62.97%），未達到qPCR反應擴增效率范圍（90%～110%），原因可能是該質粒為長片段質粒。此外基于同一基因nrdB構建的3個質粒（pnrdB83、pnrdB81、pnrdB113）穩定性存在差異，其可能的原因是pnrdB81在擴增片段上游多出9?bp序列且在另一位點存在1個SNP，pnrdB113在擴增片段上游多出3?bp序列，且該序列包含1個SNP，而pnrdB83的擴增片段與目的基因片段100%匹配。綜上，以pnrdB83質粒作為標準品，以RNRn1f/RNRn1r進行定量PCR的體系為本研究中最穩定的絕對定量PCR體系，可應用于需要進行黃龍病病原菌含量測定和比較的各項試驗。

參考文獻

［1］?奎國秀，?祁春節.我國柑橘產業生產貿易的變化及機遇與挑戰［J］.中國果樹，?2021（6）：?9397.

［2］?鄧秀新.中國柑橘育種60年回顧與展望［J］.園藝學報，?2022，?49（10）：?20632074.

［3］?周常勇.對柑橘黃龍病防控對策的再思考［J］.植物保護，?2018，?44（5）：?3033.

［4］?BENDDIX?C，?LEWIS?J?D.?The?enemy?within：?phloemlimited?pathogens?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2018，?19（1）：?238254.

［5］?BOV?J?M.?Huanglongbing：?A?destructive，?newly?emerging，?centuryold?disease?of?citrus?［J］.?Journal?of?Plant?Pathology，?2006，?88（1）：?737.

［6］?SHOKROLLAH?H，?ABDULLAH?T?L，?SIJAM?K，?et?al.?Identification?of?physical?and?biochemical?characteristic?of?mandarin?（Citrus?reticulata）?fruit?infected?by?Huanglongbing?（HLB）?［J］.?Australian?Journal?of?Crop?Science，?2011，?5（2）：?181186.

［7］?黃世炎，?張藝琴，?楊壹，?等.?感染柑橘黃龍病對‘沃柑秋梢葉片理化指標和果實品質的影響［J］.中國果樹，?2021（12）：?4246.

［8］?MARCO?P，?KASIE?S，?CHRISTINA?D，?et?al.?Quercus?leaf?extracts?display?curative?effects?against?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?that?restore?leaf?physiological?parameters?in?HLBaffected?citrus?trees?［J］.?Plant?Physiology?and?Biochemistry，?2020，?148：?7079.

［9］?程春振，?曾繼吾，?鐘云，?等.?柑橘黃龍病研究進展［J］.園藝學報，?2013，?40（9）：?16561668.

［10］鄧曉玲，?鄭永欽，?鄭正，?等.?柑橘黃龍病菌基因組學的研究進展［J］.華南農業大學學報，?2019，?40（5）：?137148.

［11］LI?Wenbin，?HARTUNG?J?S，?LEVY?L.?Quantitative?realtime?PCR?for?detection?and?identification?of?Candidatus?Liberibacter?species?associated?with?citrus?Huanglongbing?［J］.?Journal?of?Microbiological?Methods，?2006，?66（1）：?104115.

［12］LI?Wenbin，?LI?Dayan，?TWIEG?E，?et?al.?Optimized?quantification?of?unculturable?Candidatus?Liberibacter?spp.?in?host?plants?using?realtime?PCR?［J］.?Plant?Disease，?2008，?92（6）：?854861.

［13］ZHENG?Zeng，?XU?Meirong，?BAO?Minli，?et?al.?Unusual?five?copies?and?dual?forms?of?nrdB?in?“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”：?biological?implications?and?PCR?detection?application?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2016，?6（1）：?39020.?DOI：?10.1038/srep39020.

［14］肖翠，?廖晶晶，?張滬，?等.?柑桔黃龍病菌在貢柑葉片中的分布分析［J］.中國南方果樹，?2019，?48（3）：?610.

［15］JAGOUEIX?S，?JOSEPH?M?B，?GARNIER?M.?PCR?detection?of?the?two?‘Candidatus?liberibacter?species?associated?with?greening?disease?of?citrus?［J］.?Molecular?and?Cellular?Probes，?1996，?10：?4350.

［16］FUJIKAWA?T，?IWANAMI?T.?Sensitive?and?robust?detection?of?citrus?greening?（Huanglongbing）?bacterium?“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”?by?DNA?amplification?with?new?16S?rDNAspecific?primers?［J］.?Molecular?and?Cellular?Probes，?2012，?26：?194197.

［17］梁亮，?田志清，?胡雪芳，?等.?柑橘黃龍病常規PCR檢測技術研究與初步應用［J］.植物保護，?2018，?44（2）：?149153.

［18］DENG?Xiaoling，?CHEN?Jianchi，?FENG?Z，?et?al.?Identification?and?characterization?of?the?Huanglongbing?bacterium?in?pummelo?from?multiple?locations?in?Guangdong，?P.?R.?China?［J］.?Plant?Disease，?2008，?92（4）：?513518.

［19］高玉霞，?盧占軍，?鐘八蓮，?等.?柑桔黃龍病常規PCR檢測4對引物的特異性和靈敏度［J］.中國南方果樹，?2014，?43（1）：?58.

［20］許美容，?陳燕玲，?鄧曉玲.?柑橘黃龍病癥狀與“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”?PCR檢測結果的相關性分析［J］.植物病理學報，?2016，?46（1）：?367373.

［21］胡浩，?殷幼平，?張利平，?等.柑桔黃龍病的常規PCR及熒光定量PCR檢測［J］.中國農業科學，?2006（12）：?24912497.

［22］婁兵海，?宋雅琴，?鄧崇嶺.一種柑橘黃龍病菌亞洲種聚合酶鏈式置換反應檢測方法：?CN105624312A?［P］.?20160601.

［23］田亞南，?柯穗，?柯沖.?應用多聚酶鏈式反應（PCR）技術檢測和定量分析柑桔黃龍病病原［J］.植物病理學報，?1996，?26（3）：?243250.

［24］丁芳，?王國平，?易干軍，?等.?不同引物對檢測柑桔黃龍病菌靈敏度比較［J］.植物保護學報，?2007，?34（4）：?364368.

［25］SUBANDIYAH?S，?IWANAMI?T，?TSUYUMU?S，?et?al.?Comparison?of?16S?rDNA?and?16S/23S?intergenic?region?sequences?among?citrus?greening?organisms?in?Asia?［J］.Plant?Disease，?2000，?84（1）：?1518.

［26］HONG?Yanyun，?LUO?Yongyang，?YI?Jianglan，?et?al.?Screening?nestedPCR?primer?for?‘Candidatus?Liberibacter?asiaticus?associated?with?citrus?Huanglongbing?and?application?in?Hunan，?China?［J/OL］.?PLoS?ONE，?2019，?14（2）：?e0212020.?DOI：?10.1371/journal.pone.0212020.

［27］HOCQUELLET?A，?TOORAWA?P，?BOVE?J?M，?et?al.?Detection?and?identification?of?the?two?Candidatus?Liberobacter?species?associated?with?citrus?Huanglongbing?by?PCR?amplification?of?ribosomal?protein?genes?of?the?beta?operon?［J］.Molecular?and?Cellular?Probes，?1999，?13：?373379.

［28］FELIX?M，?SILVIA?B，?BASTIN?S，?et?al.?The?challenge?of?environmental?samples?for?PCR?detection?of?phytopathogenic?bacteria：?a?case?study?of?citrus?Huanglongbing?disease?［J/OL］.Agronomy，?2021，?11（1）：?10.?DOI：?10.3390/agronomy11010010.

［29］楊毅，?姜蕾.一種柑橘黃龍病檢測用引物組及其檢測方法：?CN108950034A?［P］.20181207.

［30］趙春江，?董宏圖，?張晗，?等.一種柑橘黃龍病快速檢測方法：?CN112195223A?［P］.20210108.

［31］BHASKARA?A?S，?AHMED?B?N?J，?ADKARPURUSHOTHAMA?C?R，?et?al.?Evaluation?of?efficiency?of?heminested?PCR?assay?for?the?detection?of?‘Candidatus?Liberibacter?infecting?citrus［J］.?Journal?of?Plant?Diseases?and?Protection，?2013，?120（5/6）：?189193.

［32］BAO?Minli，?ZHENG?Zeng，?SUN?Xiaoan，?et?al.?Enhancing?PCR?capacity?to?detect?‘Candidatus?Liberibacter?asiaticus?utilizing?whole?genome?sequence?information［J］.?Plant?Disease，?2020，?104：?527532.

［33］李鎮希，?潘睿翾，?許美容，?等.?柑橘黃龍病菌雙重實時熒光PCR檢測方法的建立［J］.園藝學報，?2023，?50（1）：?188196.

（責任編輯：田?喆）