二肽基肽酶I抑制劑的研究進展

摘 要 中性粒細胞是先天免疫系統的重要組成部分，其功能失調和多種疾病密切相關. 二肽基肽酶I是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，介導中性粒細胞相關炎癥過程，在多種炎癥性疾病中發揮關鍵作用，因此成為炎癥性疾病治療藥物開發的新穎靶點. 文章從基于經驗的藥物設計、基于靶標的理性設計和靶標設計位點新選擇三個方面綜述了二肽基肽酶I抑制劑的研究進展，旨在為開發新型高效、低毒的二肽基肽酶I抑制劑提供參考.

關鍵詞 二肽基肽酶I；抑制劑；中性粒細胞；炎癥性疾病

中圖分類號 R914.2 文獻標識碼 A

中性粒細胞（neutrophils，PMNs）是先天免疫系統重要組成部分，通過脫顆粒作用釋放蛋白酶顆粒，吞噬作用降解病原體以及排出中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NETs）等方式實現宿主免疫防御機制，在對抗病原微生物入侵過程中發揮先鋒作用[1]. PMNs異常累積和激活，引起炎性因子水平升高、蛋白酶過度分泌以及NETs形成失控等事件的發生，導致多種炎癥性疾病[1]. 二肽基肽酶I（dipeptidyl peptidase I，DPPI），也叫組織蛋白酶C（cathepsin C），參與PMNs的募集和激活，介導PMNs相關事件，在炎癥過程中發揮重要作用[2]. 值得強調的是，DPPI缺失和抑制不干擾PMNs的存活與正常功能，并且不會導致宿主出現嚴重副作用. 人體內DPPI的功能喪失會導致Papillon-Lef èvre綜合征和Haim-Munk綜合征，都是由于人類DPPI基因功能喪失性突變導致，以手掌和腳底皮膚角化脫落和嚴重牙周炎為特征，但是這兩類患者均未表現出明顯的免疫缺陷和病原體反復感染[1-3]. 這一事實為靶標DPPI疾病治療策略安全性提供了堅實證據. 因此，DPPI成為治療多種炎癥性疾病的可靠靶標[1-3].

本文梳理了近年來DPPI的相關研究成果，尤其關注DPPI在疾病中所扮演的關鍵角色和DPPI抑制劑的開發，并支持將DPPI作為更多疾病的治療靶點.

1 二肽基肽酶I的結構特征和基本功能

在人體中，DPPI在組織間的表達差異很大，在肺、脾、腎、肝、小腸和大腸內高表達，在食道、胃和心臟內中等表達，在大腦、胰腺、腎上腺和睪丸內低表達. DPPI在髓系細胞譜系中，特別是在PMNs、肥大細胞、單核細胞、巨噬細胞中高表達[4]. 起初DPPI以單鏈糖基化單體酶原形式存在，分為四個區域：排他域（Asp1-Gly119），前肽區（Thr120-His206），重鏈區（Leu207-Arg370）和輕鏈區（Asp371-Leu439）[5]. 四個亞基完全相同，并且依靠非共價作用結合在一起（圖1A）[5]. 成熟DPPI將和生理作用相關的活性狹縫完全暴露于溶劑之中，該活性狹縫由重鏈和輕鏈交叉組成，構成一個被稱為S2口袋的位點[5]. 在口袋入口處，由重鏈上的Cys234和輕鏈上的His381構成硫醇鹽-咪唑鎓離子對，是生理作用相關的關鍵催化殘基. 在S2口袋上方，存在一個廣闊且表淺的S1位點，位于蛋白質暴露區域表面[5]. 排他域的Asp1用于識別和錨定特定催化底物，維持氨基肽酶活性.

DPPI作為肽酶催化底物中酰胺鍵的斷裂，并且底物的氨基酸組成、構型、末端暴露游離氨基等因素均影響水解反應的發生及速率[6]. N-端氨基的暴露和質子化是水解所必需的. DPPI對水解底物的苛刻要求是其參與特定多肽或者蛋白質修飾的化學基礎，也是其介導復雜生理或病理機制的重要原因. 早期研究發現，DPPI在體外環境下可以參與凝血酶、血小板因子XIII和神經氨酸酶的激活，參與胰高血糖素活化[7-10]. 最重要是，DPPI是三種中性粒細胞絲氨酸蛋白酶（NSPs）活化過程中最關鍵的因素，這三種NSPs分別是組織蛋白酶G（Cat G）、彈性蛋白酶（NE）和蛋白酶3（PR3）[11]. 藥理學抑制研究表明，對DPPI的長時間高效抑制，幾乎可以完全抑制包括NSPs在內多種絲氨酸蛋白酶的活性[11-13].

2 二肽基肽酶I在多種炎癥性疾病進展中發揮作用

DPPI通過介導PMNs相關炎癥事件，參與多種炎癥性疾病的進展，這些疾病涉及骨關節、呼吸系統、心血管系統和神經系統等多個領域.

PMNs浸潤是類風濕關節炎（RA）最顯著特征，被認為是該疾病中軟骨破壞的原因[14]. 通過對DPPI+/+和DPPI-/-小鼠構建膠原抗體誘導的急性和慢性關節炎模型，研究發現DPPI-/-小鼠對關節炎進展有抵抗作用[11]，這種抵抗作用與NSPs失活直接相關. 通過使用DPPI選擇性抑制劑實施藥理學抑制，確認了DPPI通過調節肥大細胞和PMNs的激活以及調控蛋白水解酶的活性水平參與RA進展[15].

SARS-CoV-2感染引起新冠肺炎（COVID-19），并有極大的可能發展為具有高死亡率的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[16]. DPPI的缺失可以抑制由仙臺病毒感染引起的炎癥反應，并伴隨著肺中PMNs浸潤顯著減輕和局部炎癥因子產生顯著減少，這是DPPI依賴性的PMNs招募和細胞因子反應的結果[17]. DPPI在COVID-19中的重要作用在SARS-CoV-2肆虐之初就受到重視. Gangqiao Zhou等揭示了DPPI基因位點是中國人群對COVID-19嚴重程度易感性的遺傳決定因素[18]. Brice Korkmaz等的研究確認了DPPI和NSPs的表達在非肺炎ARDS患者和COVID-19患者之間沒有顯著差異[16]. 以上數據強烈支持靶標DPPI治療COVID-19的策略.

動脈粥樣硬化（AS）和腹主動脈瘤（AAA）的特征是主動脈壁的慢性炎癥和破壞性結締組織重塑. DPPI在動脈瘤發展的早期階段表達顯著增加，并且在動脈瘤擴張后期階段出現了二次表達增加，并伴隨內源性抑制劑胱抑素C表達下降[19]. 進一步研究發現，在彈性蛋白酶灌注后誘導AAA急性期，DPPI招募PMNs到病變主動脈，負責CXCL2產生和NETs形成，維持炎癥反應，最終導致組織破壞和動脈瘤擴張[20]. 此外，在AS小鼠模型中，DPPI缺乏影響病變進展，具有一定的部位特異性[21].

多種中樞神經系統疾病被認為和神經炎癥密切相關，普遍表現為膠質細胞過度活化、促炎因子濃度增加、血腦屏障通透性改變和炎癥細胞侵襲[22-24]. Jianmei Ma的研究小組發現在脂多糖誘導的神經炎癥模型中，小鼠腦內小膠質細胞的充分激活、腦內炎癥介質的大量釋放，伴隨小膠質細胞內DPPI整體性表達上調[25]，并進一步揭示了DPPI通過介導FAK誘導的p38/MAPK/NF-κB信號通路和Ca2+依賴的PKC/p38/MAPK/NF-κB通路的激活促進巨噬細胞和小膠質細胞的M1極化，加重小鼠抑郁癥模型和低溫腦損傷模型中的神經炎癥[26-29].

一些獨立研究報道DPPI可能在急性胰腺炎[30]、糖尿病腎病[31]和壞死性小腸結腸炎[32]等其他疾病中發揮作用. 這些研究結果暗示，DPPI可能對更多類型炎癥性疾病的緩解和治療具有重要意義.

3 二肽基肽酶I抑制劑的開發

DPPI抑制劑的開發普遍遵循的策略是在肽基骨架上引入能夠和Cys234形成共價鍵的彈頭結構，以獲得對DPPI具有高效抑制作用和高選擇性的肽基-共價化合物. DPPI蛋白質結構解析加速了DPPI抑制劑的基于靶標的理性設計.

3.1 基于經驗的藥物設計指導二肽基肽酶I抑制劑的開發

Gly-Phe-p-nitroanilide （1）是DPPI的活性檢測底物[33]，以其為出發點，在底物上引入能夠和Cys234形成共價鍵的親電彈頭結構，得到第一批DPPI共價抑制劑（圖2）. 1981年公開的Gly-Phe-CHN2 （2）是一種重氮甲基酮類化合物，對DPPI具有強抑制作用，但是其半衰期很短[34]. 通過將重氮甲基酮結構進行替換，更多DPPI共價抑制劑被報道，其中化合物3b，以氰基為彈頭的可逆型共價抑制劑表現出中等活性水平（3b Ki＝2.7 μM），以乙烯基酯和乙烯基砜為特征的化合物3c和3d表現相同活性水平（3c Ki＝220 μM，3d Ki＝180 μM），且都遠優于化合物3a[35]. 以化合物3a為出發點，通過改變彈頭類型，獲得了以O-酰基羥胺為特征的DPPI抑制劑，這類化合物活性遠優于3a，其中以化合物4活性最優（4 Ki＝4.3 nM）[36]. 一系列和3d具有類似特征的二肽乙烯基砜類化合物先后公開，它們大部分不具有細胞毒性，其中活性最佳的是化合物5，對細胞內的DPPI抑制作用的IC50值為4.7 μM，是化合物3d（IC50＝21 μM）的4倍，引起這種活性差異的因素是末端氨基酸組成[37]. 此外，還報道了酰氧甲基酮類和氟甲基酮類DPPI抑制劑[38]. 酰氧甲基酮類化合物與O-酰基羥胺類化合物4的結構差異雖然很小，但是彈頭結構上的微小變化導致酰氧甲基酮類化合物表現更好的DPPI抑制作用，其中化合物6活性最佳，對U937細胞內DPPI的IC50值為4 μM. 然而，由于酯水解性質，酰氧甲基酮類化合物儲存和測試過程中均易分解. 氟甲基酮類化合物7雖然同樣表現中等活性，但受抑制的DPPI能迅速恢復. 與肽基衍生物不同的氨基脲類衍生物是另一類潛在的DPPI抑制劑. 以化合物8（IC50＝31 nM）為代表的高效的、可逆型DPPI抑制劑，抑制作用的IC50值處于納摩爾水平，并且對Cat B/G/H/L、胰蛋白酶和糜蛋白酶具有很好的選擇性，對細胞色素P450酶系沒有抑制作用，但是代謝穩定性較差[39].

將膦酸基團作為彈頭取代肽基合成底物獲得DPPI抑制劑的策略由Pawel Kafarski提出. 化合物9是首批被公開的膦酸多肽類DPPI抑制劑中活性最佳的一個，通過將氨基（金剛烷基）甲基膦酸引入二肽而獲得的（圖3）[40]. 這一策略被應用于更復雜的肽基結構，獲得了膦酸三肽類DPPI抑制劑化合物10a-10d[40-41]. 將膦酸多肽類化合物和脫氫氨基酸類化合物進行雜交，得到一類磷酸脫氫肽類化合物11作為非競爭性、中等活性的DPPI抑制劑，并通過分子對接指出磷酸脫氫肽類化合物的游離氨基與膦酸基團分別和Asp1與Cys234形成電荷作用和氫鍵作用[42]. Marcin Kamierczak最近研究得到了氟化氨基膦酸鹽類化合物12，同樣表現出非競爭性、中等活性的DPPI抑制作用[43]. 一些天然產物也被發現具有DPPI的抑制作用. 雷公藤多葡萄糖苷、亮太素Leupeptin、綠原酸（CGA）和咖啡酸（CA）都被報道在高濃度下具有DPPI活性抑制作用[13，44-45].

3.2 基于靶標的理性設計

DPPI蛋白質結構解析促進了基于靶標的理性設計的進展. Gly-Phe-CHN2（2）與DPPI的結合模式指出，重氮甲基酮結構與Cys234形成了共價鍵，游離的氨基與Asp1形成了電荷相互作用（圖4A，PDB ID：2DJF）[46]. 這種理想的結合模式鼓勵靶標S2活性口袋，尤其靶標Cys234，開展DPPI抑制劑設計（圖5）.

氰基具有形成共價作用的能力，化學性質溫和，沒有明顯細胞毒作用，因此是優秀的彈頭結構. 相比于化合物3b，化合物13的活性提高了368倍（3b IC50＝4 787 nM，13 IC50＝13 nM），然而13存在代謝不穩定性. 阿斯利康公司解析了化合物13和DPPI的結合模式并指出，在與Cys234和Asp1形成關鍵相互作用的基礎上，13的乙基結構占據了S2口袋，聯苯結構伸向S2口袋外側下方敞開空間（圖4B，PDB ID：4CDC）[47]. 為了解決代謝穩定性問題，針對肽基結構的殘基側鏈實施環化策略，導致嗎啉環的出現[47]. 最終化合物14（AZD5248）被選為適合體內研究的候選化合物. AZD5248和DPPI的共結晶信息指出，嗎啉環在S2口袋中，通過環上氧原子和酰胺基上NH分別與Thr379和Asn380形成額外的氫鍵作用（圖4C，PDB ID：4CDE）[47]. AZD5248表現出一系列優秀的藥學性質，AZD5248的臨床前研究指出，大鼠每天口服AZD5248連續8 d后，NE、PR3和Cat G的活性分別被抑制了90%、64%和88%，這意味著AZD5248可以在體內發揮預期藥效[48]. 然而，Jonathan Tugwood等指出AZD5248的骨架特征導致其和主動脈組織中的原彈性蛋白結合，產生主動脈結合毒性[49]. 因此，AZD5248并沒有開展進一步的臨床試驗，而是針對主動脈結合毒性進行進一步改造，最終獲得化合物15（AZD7986）[50]. AZD7986在醛反應性測試中是穩定的，并且在體外主動脈組織勻漿試驗和體內實驗中均顯示不存在主動脈結合. 體內研究表明，大鼠每日口服AZD7986連續8 d，可以將NSPs活性抑制到10%～30%. 隨后，AZD7986被轉讓給Insmed生物公司，并更名為Brensocatib（INS1007），順利進入臨床試驗. I期臨床研究（NCT0230357）指出，Brensocatib可以誘導健康受試者體內NE活性的持續性降低，但是掌部和足底表面表皮脫屑無法避免[51]. 針對NCFBE開展的II期臨床試驗（NCT03218917）中，與安慰劑相比，Brensocatib顯著延長治療期間發生首次病情加重時間，降低了病情加重風險[52]. 藥物代謝動力學臨床試驗和針對NCFBE的藥效學臨床試驗均提供了樂觀的數據[53-54]，III期臨床試驗（NCT04817332）將其用于治療COVID-19，然而，Brensocatib沒有為COVID-19患者帶來臨床受益，并且接受Brensocatib治療的患者在第29天的臨床狀態比安慰劑組患者更差[55].

勃林格殷格翰公司構建了基于氰基結構的DPPI抑制劑化合物16（BI9740，IC50＝1.8 nM），在結構上顯示出和AZD7986極大的類似性，其特征在于末端橋環結構的引入使其能更充分占據S2口袋. AZD5248和原彈性蛋白結合的化學基礎是酰胺鍵上的NH和末端游離氨基同時面向同一側并和原彈性蛋白上的醛基形成咪唑內酯-4-酮，因此格倫馬克研究中心利用構象限制策略，對AZD5248進行結構改造，限制目標化合物形成咪唑內酯-4-酮. 在此思路指導下得到化合物17（IC50＝9 nM），一種新型高效DPPI抑制劑，且不具有主動脈結合毒性[56].

默克公司設計了一類以噻吩環為特征的基于氰基結構的DPPI抑制劑. 通過篩選化合物庫，化合物18（IC50＝11 μM），一種弱DPPI抑制劑被確認為命中化合物[57]. 氰基彈頭以及噻吩環的引入得到了高效化合物19（IC50＝5.8 nM），但其血漿穩定性差. 為解決這一問題，環丙基被引入得到了化合物20（IC50＝14 nM），活性略有降低，但是表現出血漿代謝穩定性和對組織蛋白酶家族高選擇性[57]. 硫原子或者噻吩環似乎在靶向抑制DPPI過程中發揮重要作用，因為噻吩環被替換為噻唑環或苯環均會導致活性的顯著降低甚至消失，原因至今未明.

Brice Korkmaz等在化合物設計過程中引入環丙基，得到一類高效DPPI抑制劑（21-23），對U937細胞內DPPI具有極強的抑制作用[58]. 其中活性最好的化合物23，對離體DPPI和U937細胞內DPPI抑制作用IC50值分別高達6 nM和0.75 nM[58]. 化合物22與DPPI的共晶信息指出，環己烷進入S2口袋，酰胺鍵與Gly277和Asn380形成氫鍵作用，分子末端N-甲基哌嗪受到Pro3的阻擋發生折疊而伸向溶劑區域（圖4D，PDB ID：6IC7）. 化合物21（IcatCXPZ-01）被確認為用于體內研究的候選化合物. 使用IcatCXPZ-01處理的人骨髓早幼粒細胞在誘導成熟分化之后可以觀察到NSPs的完全消除[59].

葛蘭素史克公司通過環胺氰化反應構建一批氰基取代吡咯烷衍生物并篩選DPPI抑制作用和血漿穩定性[60]. 化合物24以磺酰胺為橋梁鏈接了氰基取代的吡咯烷結構和溴取代的苯環結構，表現出高活性（24 Cat C pIC50＝8.7），但是對組織蛋白酶家族選擇性不夠優秀，體內代謝穩定性和藥效學性質不佳.

張志遠教授的研究團隊通過其開發的探針修飾肽靶標鑒定技術，發現兩種表皮生長因子受體抑制劑，Canertinib和WZ4002，是DPPI的有效抑制劑，IC50值分別為0.12 μM和2.1 μM（圖6）[61]. 對WZ4002的改造獲得一種新的基于丙烯酰胺基結構的DPPI高效抑制劑25，IC50值為17 nM[62]. 對接研究發現，廣譜的半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64末端的羧酸面向Asp1的羧基，但沒有形成相互作用，而環氧乙烷結構作為彈頭靶向Cys234. 因此Norbert Schaschke等認為將E-64羧酸改造為肼基可能有利于提高選擇性和活性，并在此思路指導下獲得了E-64衍生物26，表現出更優的活性和選擇性[63].

由葛蘭素史克公司開發的GSK2793660是以α，β-不飽和酰胺結構為特征的不可逆、共價抑制劑. 在I期臨床研究中（NCT02058407），通過口服GSK2793660持續21 d，收集了有關安全性、藥代動力學、DPPI酶抑制和血液生物標志物NSPs的數據[59]. 雖然受試志愿者體內全血中DPPI的活性很快被抑制高達80%以上，但是全血NSPs的活性并沒有顯著變化. 目前無法解釋該現象產生的原因，推測GSK2793660極短的半衰期、在pH＞4環境下的結構不穩定性、α，β-不飽和酰胺結構導致的脫靶效應都可能導致這一不良結果. 此外，受試志愿者在給藥后7 d開始出現掌部和足底表皮脫屑. 盡管沒有嚴重的副作用出現，但是出于有效性和安全性的考慮，GSK2793660退出了臨床實驗.

3.3 靶標設計位點的新選擇

劉新華的研究團隊認為，DPPI的S1位點和S2口袋有待進一步開發并用于分子設計[2，64-65]. 盡管S1位點是處于溶劑暴露區域的表淺位置，沒有口袋或者狹縫包裹分子結構，但這里的氨基酸殘基類型豐富，結構多樣，理論上可以和各種化學片段有效契合. 但是S1位點位于Cys234的背側，共價DPPI抑制劑和Cys234形成的共價鍵限制了抑制劑分子結構向S1界面偏轉. 此外，S2口袋雖然是一個很好的可供分子設計的通道，但是以往報道的DPPI抑制劑只占據口袋入口處，沒有深入口袋內部. 在此分析基礎上，研究團隊報道了多個非肽基-非共價的DPPI抑制劑（圖7），其中活性最好的化合物27的IC50值為32 nM，但是在毒性研究中導致小鼠死亡. 另外一個安全有效的化合物28（IC50＝57 nM），在體內外實驗中均可以抑制DPPI和NSPs活性，并且可以在COPD模型中發揮治療作用. 他們的研究報道了和默克公司所開發的化合物20類似的活性規律，即噻吩環或硫原子似乎在化合物靶向抑制DPPI過程中發揮了某種作用，具有噻吩環結構的化合物29表現出高抑制活性，IC50值為57 nM，噻吩環被替換為呋喃環后得到的化合物30完全失去活性. Myunghee Kim等報告了一種來自中華稻蝗提取物的天然產物DAB1作為一種非共價弱DPPI抑制劑. Gln228，Thr379，Asn380和His381與DAB1的氫鍵作用和疏水作用被認為在DAB1結合和抑制DPPI過程中發揮作用[66]. 這些研究團隊正嘗試從非肽基-非共價化合物的角度，重新開發DPPI抑制劑，以試圖規避既往共價DPPI抑制劑暴露的缺陷.

4 結 論

DPPI以酰胺水解作用，通過面向NSPs、胰蛋白酶、糜蛋白酶和部分炎癥因子等廣泛水解底物，參與一系列生理功能的調節. 隨著炎癥過程中PMNs的異常積累和激活，DPPI的表達和活性水平失調，引起或加劇了涉及關節、自身免疫系統、呼吸系統、神經系統、心血管系統和其他臟器等多種疾病的進展. 但在靶標DPPI藥物設計過程中，需要考慮S1位點、S2口袋和排他域對抑制劑的結構要求. 已經有一系列高效肽基-共價DPPI抑制劑出現，但是既往DPPI抑制劑所暴露出的化學高反應性、代謝不穩定性和主動脈結合毒性，都在提示在未來DPPI抑制劑開發中，需要考慮和避免這些問題. 候選藥物臨床試驗結果帶來一些暫時無法解釋的問題也在提示靶標理論和藥物實際應用之間的差距.

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Research Progress of Dipeptidyl Peptidase I Inhibitors

WU Dan1， CHEN Xing2， FAN Gaofu1， LIU Xiushu1

（1. School of Bioengineering， Hefei Vocational and Technical College， Hefei 238000， Anhui， China; 2. Key Laboratory of Population Health Across Life Cycle， School of Public Health， Anhui Medical University， Hefei 230032， Anhui， China）

Abstract" Neutrophil is an important part of the innate immune system， and the dysfunction of neutrophil is closely related to many diseases. Dipeptidyl peptidase I is a lysosomal cysteine protease that mediates neutrophil associated inflammatory processes. Dipeptidyl peptidase I plays a key role in various inflammatory diseases， and has become a novel target for the development of therapeutic drug for inflammatory diseases. In this paper， the research progress of dipeptidyl peptidase I inhibitors is summarized from three aspects： experience-based drug design， target-

based rational design， and new selection of target design site， aiming to provide references for the development of novel high-efficiency， low-toxicity dipeptidyl peptidase I inhibitors.

Keywords" dipeptidyl peptidase I; inhibitors; neutrophils; inflammatory diseases

收稿日期：2023 - 09 - 12

作者簡介：吳 丹（1994—），女（漢族），安徽廣德人，講師，碩士研究生. 研究方向：天然藥物化學成分的提取與合成. E-mail： 296332056@qq.com

基金項目：安徽省高校自然科學研究重大項目（KJ2021ZD0159）；安徽省高校學科（專業）拔尖人才學術資助項目（gxbjZD2021116）；合肥職業技術學院校級重點項目（2021KJA07）；安徽省高校自然科學重點項目（KJ2021A1388）