病毒性肺炎病證結合動物模型的制備與評價

【摘 要】 文章對現有病毒性肺炎病證結合模型的動物種屬、雌雄選擇、模型構建方法及評價指標4個方面進行了總結比較，認為目前主要研究的病毒性肺炎證型有濕熱證、寒濕證、風熱郁肺證、腎陽虛證、肝郁脾虛證，在造模方法上主要選用病因模擬法先復制證型后選用病毒或病毒模擬物誘導疾病模型的造模方法，常選用小鼠作為研究對象，復制周期在5～24 d。通過分析病毒性肺炎病證結合各造模方法的優缺點，對改進完善模型的評價指標提出建議，同時為深入研究中醫藥防治病毒性肺炎具體作用機制奠定模型基礎，以促進病毒性肺炎的臨床研究。

【關鍵詞】 病毒性肺炎；病證結合；動物模型選擇；模型建立與評價

【中圖分類號】R563.1+9"" 【文獻標志碼】 A""" 【文章編號】1007-8517（2024）09-0033-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2024.09.zgmzmjyyzz202409009

Establishment and Evaluation of Viral Pneumonia Animal Model in Combination of Disease and Syndrome

YANG Shangsong1，2 ZHANG Tingrui1，2 WEN Weibo1，2 LI Qin1，2*

1.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650500，China;

2.Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Chronic

Diseases in Yunnan Province，Kunming 650500，China

Abstract：

This paper summarized and compared the VPanimal model in the combination of disease and syndrome from four aspects，includingselection of model animal species sexual selection，preparation methods of VP animal model in the combination of disease and syndromeindicators of model evaluationby summarizing studies.Research shows that VP syndrome mainly studied at present includes damp-heat syndrome，cold and wet syndrome，wind and heat depression lung syndrome，kidney Yang deficiency syndrome，liver depression and spleen deficiency syndrome. In the modeling method，the etiology simulation method is mainly used to first copy the syndrome type before the virus or virus mimics were used to induce the disease model，and mice were often selected as the research objects，and the replication cycle was 5 to 24 days. By analyzing the advantages and disadvantages of each modeling method of VP， this study provides suggestions on improving the evaluation index animal model，for further research on prevention and treatment of VP specific mechanism of action of TCM model basis to promote clinical research of VP.

Keywords：Viral Pneumonia；Combination of Disease and Syndrome；Animal Model Selection；Model Establishment and Evaluation

病毒性肺炎（viral pneumonia，VP）是呼吸道病毒感染并蔓延引起的肺實質炎癥。由于病毒具有高度變異性和復雜的致病機制等特點，使得疫苗及抗病毒藥物的研發受到了嚴重制約。中醫對疫病的治療，并不以病原體的確定為先決條件，而是從患者感疫戾之邪后出現的癥狀和體征出發，進行辨證論治。中醫藥對于呼吸道病毒感染的防治具有十分重要的意義。

由于中藥制劑在VP治療過程中具體機制不明確，加之中藥的使用需要精準辨證用藥才能有的放矢以提升臨床治療有效率，因此研究簡單易行，可操作性強，易于復制的“病證結合”VP動物模型，對于闡述中藥治療VP具體作用機制及治療效果，開發新型中藥制劑具有重要的意義。既往研究中發現不同動物的種屬、性別在病理及臨床表現上存在一定差異，對中醫證候的復制具有一定影響，而不同的病證結合造模方式同樣影響著動物模型的建立。本文從動物種屬、性別選擇、VP常見證型病證結合動物模型制備方法，模型“證”的評價及相關變化因子評價指標5大方面對VP病證結合動物模型進行歸納比較研究，為探索更加符合病證結合的VP動物模型提供參考。

1 VP模型動物選擇比較

1.1 VP模型動物種屬的選擇 VP模型動物建立種屬的選擇上遵循與人類臨床表現及病理變化更加貼合的動物，從而更好地反映藥物在人體治療中的機制以及疫苗的開發。同時在模型動物的選取上應該遵循動物可穩定復制、來源易得且經濟的原則。目前國內外在研究VP時選擇的動物種屬包括小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、豬、貓和犬、雪貂、猿猴等動物，其中鼠類在VP模型中運用最為廣泛。Chen F等［1］給予C57BL/6雄性小鼠氣管緩慢注射Poly （I∶C），3 d后可見支氣管上皮結構破壞、肺實質損傷、嚴重肺泡破壞和塌陷以及間質性水腫，與病毒性肺炎的病理表現一致。小鼠個體差異小，遺傳譜系清晰，品系純正，價格相對低廉，容易獲得，易于飼養，并且更易于采用外部條件構建中醫藥證候模型，但是小鼠不是流感的天然宿主，不能傳播流感病毒，且氣管滴注造模易造成小鼠死亡，造模過程具有一定的局限性［2］。Huang Z等［3］選用Wister雌性大鼠滴鼻感染呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）病毒，造模后可見大鼠精神狀態差、呼吸急促、支氣管周圍炎癥浸潤、肺葉斑片狀滲出。采用大鼠模型動物來源廣，容易獲得，成模時間短，但由于大鼠體積相對較大，證候造模時間長，且對部分病毒缺乏易感性，在VP造模動物選擇上沒有小鼠廣泛。張坤［4］在豚鼠鼻內接種H5N1禽流感病毒液后1～5 d可檢測到病毒的復制，到第7 d未檢測到病毒的排除，且癥狀表現不甚明顯，豚鼠對流感病毒具有高度易感性，成本低，易飼養，可以彌補小鼠間不能傳播的不足［5］，且豚鼠可以在感染后5～7 d清除流感病毒，為宿主利用先天性免疫應答機制清除流感病毒提供了十分理想的動物模型。除此之外，中國倉鼠對多種細菌、病毒和寄生蟲具有高度敏感性，可作為傳染性疾病研究的候選模型動物，廣泛應用于傳染病學研究［6］。且與敘利亞金黃倉鼠模型相比，中國倉鼠造模具有臨床癥狀更明顯，遺傳基因特征良好的優勢，但中國倉鼠的研究歷史較短，基礎研究資料相對稀缺，缺乏特異性強的檢測試劑盒和方法，國內外應用有局限性。

豬是一種研究流感病毒性的良好動物模型。Halbur P G和王承宇在豬體內接種豬生殖和呼吸綜合征病毒，兩周后出現不同程度的食欲不振、嗜睡和發熱，并且發現發熱有利于病情的恢復［7-8］。豬與人的氨基酸同源性高達84.1%，在解剖學、生理學、疾病特征等方面與人類極為相似［9］。豬作為禽流感的中間宿主，其動物模型的研究對于防治禽流感及疫苗的開發具有重要的價值，但因其價格較高，藥物干預劑量大，操作難度高，用于豬細胞因子檢測的方法和試劑的缺乏等均是進行豬模型研究的主要障礙。貓和犬與人類密切接觸，了解它們對病毒的易感性對于控制傳染性疾病較為重要，貓和犬體型大，易感染，且操作難度大，不是常規的動物模型［10-11］。

雪貂是甲型流感病毒（influenza a virus，IAV）感染的理想動物，在IAV研究中廣泛應用［12］。Kim等［13］報告通過鼻腔接種SARS-CoV-2的雪貂模型，8 d后出現體溫升高和病毒復制的情況，在排泄物中可檢測到病毒，通過直接或間接接觸可感染幼小雪貂。雪貂與人類唾液酸受體種類、呼吸道受體分布相似，對不同亞型的IAV易感性強，有明顯的和人類感染類似的臨床體征和癥狀，呼吸道病理變化與人類相似，能夠更加真實地接近人VP的特征等優勢［14］。但是雪貂作為國家級保護動物，價格昂貴不易獲得，飼養條件要求較高，缺少特定的免疫抗體，實驗使用數量有限，結果可能存在一定的誤差，不能廣泛應用于動物模型的構建。非人類靈長類動物解剖以及生理結構與人類相似，受到了醫學科研工作者的青睞。Lu等［15］研究表明恒河猴、食蟹猴對SARS-CoV-2的感染較為敏感，影像學變化、肺組織病理改變、病毒載量、抗體水平等變化方面與人體感染相似，并且有自愈的傾向。目前，非人類靈長類動物作為與人類遺傳學最為接近的動物，是最有參考價值的動物模型，可適用于發病機制的研究，疫苗開發及治療性藥物的評估，但其價格極為昂貴，不易獲得，操作難度大，研究數量少，同樣具有一定的局限性。不同的種屬模型動物對VP的呈現貼合度具有一定差異，選取合適的動物制作VP模型，是研究中的重要一環，在研究中應綜合各因素選擇最適宜的動物種屬為研究奠定基礎。詳見表1。

1.2 VP模型動物雌雄選擇 性別差異對醫學研究具有重要的生物學意義。既往有研究［16］表明新型冠狀病毒感染肺炎（corna virus disease2019，COVID-19）在男性中發生率更高，老年男性比女性更容易感染新冠肺炎，重型患者中男性也更為多見。然而，大多數研究［17］都忽視了性別相關因素的關鍵意義，不同種屬和品系的動物對同一致病因素易感性不同，如Wistar大鼠和SD大鼠雌雄間體質有明顯的寒熱差異，不同體質中醫證型的轉化也有一定的差異［18］。因此，在動物模型復制上需注意性別差異對中醫證型和疾病的影響，不同疾病最適宜的證型動物種屬還需要進一步研究。

2 VP常見證型“病證結合”動物模型制備

目前VP研究比較多的證型包括濕熱證、寒濕證、肺熱證、腎陽虛證、肝郁脾虛證。在病證結合動物模型的制備上，多采取復合制備方法，比如目前濕熱證動物模型大多使用“外濕”結合“內濕”的造模方法，可同時復合“體質”或“外邪”因素，單因素化學藥物干預造模較少。

復合因素造模雖不能完全模擬出中醫證候發生機制，但可反映出大部分中醫證候表現。通過方證對應的有效性來判定證候模型復制的有效性也是一種模型制備的新思路［19］。對以上證型“病證結合”動物模型制備方法進行比較和評價見表2。

3 模型評價指標

3.1 VP模型證候評價標準 對動物模型證候的評價，由于無法通過問診及難以結合舌脈象對模型動物進行四診合參判定具體證型，動物的主觀感受如頭痛、乏力、咽痛無法得知，咳嗽癥狀也難以表現，故在動物模型證候的判定中主要依據疾病在人中所表現的證候進行判定，輔以動物一般情況如體質量、飲水量、體溫、毛色、活動情況等綜合對VP動物的證候進行判定。見表3。

4 VP病證結合動物模型不同證型主要相關因子

判定是否成功建立符合中醫VP機制的動物模型，大多文獻采用癥狀觀察如毛色、精神狀況、活動度等，以及可測量的體質量、飲水量、體溫等表示病證結合動物模型的建立成功，而這一判斷標準存在一些主觀偏倚，不夠嚴謹。應該盡可能的多收集客觀資料，通過不同證型的主要相關變化因子檢測來客觀評價中醫證型，同時，通過對“病證結合”動物模型施加相關中藥方劑干預后，研究相關因子變化，闡釋中醫藥發生機制，有機地將中醫臨床的有效性和基礎研究的創新性聯系起來，形成良性循環。見表4。

5 結論

中醫藥在VP防治中具有理論基礎和實踐經驗豐富，治療手段多樣化、且多靶點整體調節、療效穩定等優勢，在新型冠狀病毒肺炎疫情防治中早期介入、全程深度參與，從參與者變成了主力軍［35］。隨著中醫藥運用越來越廣泛，對中醫藥的研究也越發深入和細化，凸顯出建立符合中醫辨證特色的“病證結合”模型的必要性，既需要具備西醫病理發展過程，也應當具備中醫證型特征，從而能全面地反映出中醫藥作用機制。目前，在建立符合病證模型的動物類型選擇、造模方式、時間及藥物制劑相關的機制上，研究者們進行了積極地探索和驗證。在實驗研究方面目前主要研究的VP證型有濕熱證、寒濕疫毒證、風熱郁肺證、腎陽虛證、肝郁脾虛證，在造模方法上主要選用內因、外因或者化學試劑聯合模擬復制證型后選用病毒或病毒模擬物誘導疾病模型的造模方法。常選用鼠類作為研究對象，復制周期在5～24 d，造模方式主要以（高脂飼料+人工氣候箱+病毒滴鼻+游泳）、（腹腔注射苯甲酸雌二醇、利血平+病毒滴鼻/點眼）為主。這種模型復制方法不僅可同時兼顧VP的西醫病理和中醫病機特征，且對于闡釋中醫的“證”和西醫的“病”更微觀層面的聯系及中醫藥治療VP相關機制具有重大的意義。

通過對現有的病證結合VP動物模型復制方法分析發現仍然存在一些不足：第一，動物選擇局限于小鼠、大鼠；第二，現有的病證結合模型研究集中在濕熱、寒濕等證候模型，缺乏VP早期痰熱郁肺證及恢復期肺脾氣虛證、氣陰兩虛證病毒感染的動物模型，值得繼續進行相關實驗的研究；第三，病證結合模型復制時序問題。在病證結合模型復制中是在中醫證型模型復制基礎上予以生物因素復制疾病模型，但是在臨床實際發病過程中，疾病和證候并非呈先后發展順序，且會發生證型轉化，一病多證；第四，于動物與人在種屬上的固有差異，且在動物身上只能用望診、聞診，因此尋找客觀、特異性的癥狀和指標成為判斷病證結合動物模型造模成功與否的關鍵，而證型的評估缺乏客觀化指標，同一證型缺乏統一的相關變化因子作為判定標準。各個造模因素如外濕因素溫度、相對濕度、誘導時間，內濕造模因素飼料的具體配比等無統一標準，同樣的實驗變量增加，可復制性低，實驗結果可信度不高。目前，以宏基因組學、轉錄組學、蛋白組學、代謝組學結合生物信息學的新形式，通過分析其高通量數據芯片，可以獲得“病證結合”模型生物學靶標，未來可以此為導向繼續建立一系列符合中醫發病機制的VP證候模型，為中醫藥微觀深入研究奠定可持續的模型基礎。

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（收稿日期：2023-11-14 編輯：陶希睿）

基金項目：國家自然科學基金地區基金項目（編號：82260930） ；高海拔地區中醫藥治療新冠病毒感染重癥臨床研究，國家中醫藥管理局新型冠狀病毒感染中醫藥應急專項課題（編號：2023ZYLCYJ02-24）；云南省科學技術廳中醫聯合專項-面上項目（編號：202101AZ070001-020）；云南省教育廳科學研究項目（編號：2023Y0440）。

作者簡介：楊上松（1998—），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為中醫治則治法。E-mail：1046504205@qq.com

通信作者：李欽（1981—），女，漢族，副教授，博士，研究方向為新發突發傳染病中醫理論及臨床研究。E-mail：736870541@qq.com