細胞焦亡在腎缺血-再灌注損傷中的研究進展

申開文 張瑞波 王 強 岑威虎 沈 俊

腎缺血再灌注損傷是一種常見的臨床并發癥,缺血導致細胞內三磷酸腺苷減少,細胞膜上鈉鉀交換功能下降,最終引起細胞水腫及細胞損傷。再灌注后,增加的活性氧(reactive oxygen species,ROS)會導致細胞再次損傷,受損細胞釋放的內源性損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMP)刺激機體細胞分泌促炎和趨化細胞因子,進一步加重細胞損傷。缺血和再灌注兩個過程均導致腎小管細胞損傷、腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)降低,并最終導致急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)[1]。AKI是一種全球常見的疾病,有著較高的發生率和病死率[2]。細胞焦亡作為程序性細胞死亡的一種形式,Gasdermin D(GSDMD)是細胞焦亡的關鍵效應物,它的主要作用是在胞膜上形成孔隙,最終導致細胞腫脹、膜溶解和炎性細胞因子釋放,眾多的研究表明,GSDMD介導的細胞焦亡是RIRI的一個重要過程[3]。本文通過總結國內外最新文獻論述,對細胞焦亡的發生機制,細胞焦亡在RIRI中的作用及臨床應用潛力做一闡述。

一、細胞焦亡定義及其途徑

1.細胞焦亡定義:細胞焦亡這個定義最早提出是在2001年,被稱作是伴有炎性反應的程序性細胞死亡。在不斷對細胞焦亡研究中,目前細胞焦亡的定義是由某些炎性小體觸發的依賴GSDMD的一種炎癥性程序性細胞死亡形式,具體過程表現為炎性小體使caspase蛋白激活,caspase蛋白激活后可加工和激活IL-1β和 IL-18,同時還切割GSDMD以釋放膜孔形成GSDMD-N結構域。GSDMD蛋白的N端結構域在細胞膜上形成孔洞,誘導細胞膜破裂及IL-1β和 IL-18炎性細胞因子釋放[4]。

2.細胞焦亡途徑

(1)細胞焦亡經典途徑:經典途徑是指NLRP3等炎性小體通過誘導caspase-1的激活觸發細胞焦亡。該途徑主要通過DAMP或病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)與模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)的結合而啟動,然后PRR可以募集凋亡相關斑點樣蛋白(ASC)和pro-caspase-1以形成炎性小體。這些炎性小體募集并結合到ASC,導致ASC聚焦并激活caspase-1。caspase-1參與pro-IL-18 和pro-IL-1β的切割和成熟,同時切割GSDMD產生N和C末端。GSDMD的N末端片段(GSDMD-NT)釋放并在質膜中形成孔隙,導致炎性細胞因子的分泌和水分子流入,產生細胞腫脹和滲透性裂解。最終誘導細胞焦亡和細胞內物質的分泌,釋放的細胞因子和DAMP會引發炎癥和隨后的免疫反應[5]。NLRP3激活后,通過其pyrin結構域,ASC與傳感器分子相互作用,胱天蛋白酶募集域蛋白(caspase recruitment domain containing protein,CARD)結構域與pro-caspase-1相互作用,使pro-caspase-1自切割形成caspase-1成熟體。一方面,活化的caspase-1識別無活性的IL-1β和IL-18前體,并將它們轉化為成熟的炎性細胞因子。另一方面,caspase-1切割GSDMD并寡聚化介導膜孔形成的31kDa氨基末端產物(GSDMD-N)。膜孔形成,細胞腫脹,炎性細胞因子的釋放,最終導致細胞焦亡[6,7]。

(2)細胞焦亡的非經典途徑:非經典途徑誘導的焦亡是對革蘭陰性菌的一種獨特的免疫反應。它是由G-細菌表面的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)誘導產生,激活了caspase-4/5/11,而caspase-4/5/11又激活了一系列下游蛋白,最終在細胞膜上形成蛋白孔,并誘導細胞裂解過程[8]。非典型途徑的焦亡是由caspase-4、caspase-5和caspase-11介導。caspase-4/5和caspase-11具有較高的特異性和親和力,可直接與LPS或脂質A結合激活。GSDMD是炎性caspase的直接底物,而活化的caspase-1/4/5/11是四聚體,可以裂解純化的重組GSDMD,生成成熟GSDMD的前焦亡N端片段,觸發焦亡誘導。caspase-11介導的GSDMD成熟有助于NLRP3依賴性caspase-1激活和IL-1β釋放。激活的caspase-4/5/11可反向激活NLRP3炎性小體,促進IL-1β和IL-18的成熟和分泌。研究推測過度激活內質網應激觸發的CHOP-caspase-11可能是參與焦亡的重要途徑[9]。caspase-11甚至可以在沒有LPS刺激的情況下激活非典型NLRP3炎性小體。此外,有證據表明,除GSDMD外,caspase-4/5/11也可作用于通道蛋白Pannexin-1,調節炎性介質的釋放[10]。

(3)細胞焦亡的其他途徑:除GSDMD外,GSDME是一種新發現的通過caspase-3的裂解產生焦亡GSDME-N的焦亡介質。Hu等[11]研究證明了敲除GSDME基因可抑制細胞焦亡,表明GSDME在此過程中起重要作用。還有研究發現,抑制GSDME可以減輕小鼠的急性腎損傷和炎癥,表現為GSDME-N表達下調,IL-1β和LDH釋放降低,細胞活力增強[12]。當GSDME高表達時,活性的caspase-3將其切割,釋放N端結構域在細胞膜上打孔,導致細胞腫脹、破裂、死亡,發生細胞焦亡。當GSDME的表達水平較低時,就會導致細胞死亡的經典機制,即凋亡[13]。

二、細胞焦亡與RIRI

1.NLRP3與RIRI:炎性小體是一組細胞內蛋白質復合物,包括NLR、ASC、caspase-1,有時還有caspase-11。一旦被激活,炎性小體就會作為觸發caspase-1、細胞因子釋放而發生細胞焦亡[14]。NLRP3炎性小體在調節腎臟炎癥方面的重要作用已在不同的腎臟疾病模型中得到證實。RIRI過程中壞死管狀細胞能夠通過釋放活線粒體激活巨噬細胞中的NLRP3炎性小體。NLRP3缺乏對RIRI后小鼠腎臟炎癥和組織損傷具有保護作用[15]。此外,有研究報道,腎臟相關的NLRP3損害影響傷口愈合。管狀細胞中NLRP3的缺失可改善再生反應[16]。研究發現,培養的腎近端小管細胞中P2X4嘌呤能受體的激活誘導了NLRP3炎性小體的蛋白質的mRNA和蛋白表達,NLRP3激活后,NLRP3蛋白復合體低聚并形成炎性小體,隨后caspase-1被激活,促進炎性細胞因子IL-1β和IL-18的成熟、蛋白水解裂解和分泌,發生細胞焦亡,造成腎功能損傷[17]。Zheng等[18]通過采用RIRI建立AKI小鼠模型,評估了缺血性AKI急性期和慢性期腎臟NLRP3的表達。通過RNA測序,發現嚴重AKI后腎臟NLRP3信號相關基因上調,CKD活檢發現NLRP3在腎小管上皮細胞中升高,說明持續的NLRP3過表達與AKI后的慢性病理改變相關。這些結果提示,NLRP3炎性小體可能是治療RIRI損傷的潛在靶點。

2.GSDMD與RIRI:GSDMD由一個242個氨基酸的氨基末端結構域組成,通過一個43個氨基酸的接頭連接到一個199個氨基酸的羧基末端結構域[19]。研究發現,轉錄誘導精子形成基因40 (Tisp40)參與了RIRI,研究結果顯示,Tisp40過表達加重了細胞焦亡,其機制是增加了GSDMD蛋白的表達,敲除Tisp40可顯著降低GSDMD的表達水平,減輕RIRI引起的腎細胞焦亡[3]。此外,GSDMD缺陷小鼠對RIRI誘導的AKI高度敏感,也證明了缺失GSDMD在RIRI中有保護腎小管免受損傷方面作用,其機制是抑制了細胞焦亡[20]。

3.caspase與RIRI:caspase在啟動細胞焦亡中起核心作用,它們通常以不活躍的pro形式存在于細胞質中,并被其他caspase的蛋白水解裂解激活。caspase-1在被各種炎性小體激活后引發細胞焦亡,并導致受影響細胞的裂解[21]。RIRI發生6h后,caspase-1、caspase-11和IL-1β的水平顯著升高,并在RIRI發生12h后達到峰值,伴隨腎臟結構和功能損傷的升高。研究表明,在RIRI細胞實驗中,低劑量束尼卡霉素預處理可緩解腎組織損傷。其機制是降低caspase-11活性來實現,證明了caspase是RIRI發生細胞焦亡的重要蛋白[9]。

三、細胞焦亡相關的RIRI治療靶點

1.PRMT5:蛋白質精氨酸甲基化轉移酶5 (protein arginine methylation transferase 5, PRMT5)是負責精氨酸單甲基化和對稱二甲基化的主要酶,在廣泛的細胞過程中的重要生物學功能[22]。研究表明,抑制PRMT5可以減少RIRI后氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的產生。而RIRI誘導ROS的產生和炎性反應決定了腎臟損傷的嚴重程度,RIRI誘導的ROS導致炎癥相關信號因子如NLRP3的釋放,它催化pro-caspase-1轉化為活化的caspase-1,隨后誘導細胞焦亡。抑制PRMT5對RIRI引起的腎臟損傷具有保護作用,防止腎細胞發生ROS誘導的炎癥和焦亡,并促進腎小管細胞增殖。因此,PRMT5可能是一個很有前途的治療RIRI的靶點[23]。

2.miR-92a-3p:miR-92a-3p是一種非編碼的內源性微小RNA,通過靶向信使RNA (mRNA)抑制翻譯[24]。研究表明,miR-92a-3p的抑制可緩解體外氧化應激,降低體內外NLRP3、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的表達水平,其機制是 miR-92a-3p的抑制是通過血紅素氧合酶-1 (heme oxygenase-1, HO-1)靶向Nrf1來防止TECs氧化應激和細胞焦亡[25]。可將miR-92a-3p作為RIRI的關鍵調節因子和潛在的生物學標志物或治療靶點。

3.柚皮素:柚皮素是膳食柑橘類水果中存在的一種多酚類成分,因其強大的藥理活性和良好的治療前景。在RIRI過程中,柚皮素可減輕腎組織損傷、Cr、BUN和KIM-1水平,其機制是柚皮素可通過激活Nrf2/HO-1信號通路抑制內質網應激,抑制NF-κB信號通路,從而減輕細胞焦亡,從而保護腎臟[26]。

4.青蒿琥酯:青蒿琥酯是由青蒿素提取的半合成化合物,除了抗瘧作用外,還具有抗炎的效果。實驗研究表明,通過青蒿琥酯預處理過的大鼠,通過免疫組化、免疫熒光、蛋白質免疫印跡法檢測NLRP3 炎性小體、caspase-1、GSDMD蛋白及相關炎性細胞因子的表達,結果均低于未使用青蒿琥酯預處理的大鼠,表明青蒿琥酯能在RIRI中發揮抗炎作用。其機制是青蒿琥酯能減少焦亡相關蛋白的表達,抑制細胞焦亡,從而減輕RIRI[27]。

5.表氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EET): EET是花生四烯酸代謝而來的一類脂肪酸代謝產物,具有舒張血管內皮、抗炎及抗細胞凋亡等作用。實驗研究表明,在RIRI小鼠模型中,使用EET干預后,RIRI+EET組腎功能損害及NLRP3炎性小體、caspase-1、IL-1β等蛋白的表達水平均低于RIRI組,表明EET能夠減輕小鼠RIRI,其機制可能是通過抑制NLRP3活化介導的細胞焦亡而產生一定的保護作用[28]。

6.β-羥基丁酸(β-OHB):β-OHB是構成酮體的主要成分,低濃度時可以保護缺血組織損傷。在一項關于β-OHB對RIRI影響的研究中,結果發現,RIRI小鼠在β-OHB處理后能夠降低了caspase-1和促炎性細胞因子的表達,其機制是β-OHB阻止了細胞焦亡[29]。因此,β-OHB可通過抗焦亡作用減弱RIRI,可能是臨床治療和預防RIRI的一個靶點。

7.水通道蛋白-2(aquaporin protein-2, AQP2):AQP2在細胞焦亡中具有調節作用,Fan等[30]探討了AQP2在近端小管細胞中過表達是否可以緩解RIRI相關的細胞焦亡。建立小鼠RIRI模型,對人腎皮質近曲小管上皮細胞進行缺氧-給氧處理。與假手術組比較,缺血再灌注組腎功能明顯下降,組織損傷嚴重,并伴有更多核溶解和壞死。缺血再灌注組Toll樣受體4、caspase-1、KIM-1、IL-1β、IL-18表達明顯升高。在人腎細胞試驗中也觀察到類似的結果。過表達AQP2可部分逆轉人腎皮質近曲小管上皮細胞缺氧-復氧誘導的細胞損傷、焦亡及分子表達變化。結果表明,AQP2過表達可能減少近端小管細胞焦亡,因此可能是緩解RIRI中細胞焦亡的新靶點。

8. ETS原癌基因1 (ETS1):Juan等[31]對AKI患者的外周血進行了分析,發現AKI患者的NLRP3水平和細胞焦亡水平明顯高于正常對照組。此外,LPS處理后腎小管上皮細胞NLRP3水平升高,轉錄因子ETS原癌基因1 (ETS1)可與NLRP3上游啟動子轉錄位點結合,使NLRP3在腎小管上皮細胞中轉活。敲除ETS1后細胞焦亡水平也降低。敲除ETS1可能通過調節NLRP3的轉錄來減輕腎小管上皮的細胞焦亡,從而緩解AKI。ETS1有望成為治療AKI的分子靶點。

9.miR-155:Wu等[32]通過建立大鼠RIRI體內及體外模型,檢測mRNA表達水平及蛋白表達水平,應用生物信息學分析來預測miR-155靶點,然后通過熒光素酶試驗證實。結果發現,RIRI后焦亡相關蛋白caspase-1、caspase-11、IL-1β、IL-18水平明顯升高,miR-155在RIRI大鼠腎組織HK2細胞中的表達顯著增加。miR-155的上調促進HK2細胞的焦亡。研究還證實,miR-155上調了caspase-1以及促炎細胞因子IL-1β和IL-18的表達,miR-155可能成為RIRI新的治療靶點。

10.丹酚酸B (SalB):SalB是從丹參中提取的化合物,對小鼠RIRI具有保護作用。Pang等[33]研究發現,SalB可以改善腎臟損傷,降低氧化應激和炎性細胞因子水平。RIRI中,顯著上調的NLRP3、caspase-1、GSDMD和IL-1β的表達被SalB有效逆轉,其機制可能是SalB通過激活核因子NF-E2相關因子(Nrf2)/NLRP3信號通路抑制細胞焦亡,從而減輕小鼠RIRI。SalB有望成為臨床治療和防治RIRI的新思路。

11.雙硫侖:雙硫侖是一種眾所周知的解酒藥,它能夠減輕小鼠巨噬細胞的焦亡。研究表明,RIRI可引起小鼠腎功能障礙,并引起腎小管上皮細胞焦亡,雙硫侖可改善RIRI后的腎損害,主要通過抑制非經典途徑(caspase-11-GSDMD)來減少細胞焦亡[34]。

綜上所述,深入研究RIRI的發病機制、探尋新的治療靶點是RIRI研究的重要方向。細胞焦亡與RIRI的發生關系密切,通過調節細胞焦亡能使腎臟功能得到改善,細胞焦亡調節可能成為RIRI治療的新靶點,為臨床工作提供更有效的診療思路。然而細胞焦亡與RIRI具體作用機制及藥物療效的發揮同細胞焦亡的聯系還需要進一步深入研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。