納米孔靶向測序在分枝桿菌鑒定和耐藥基因檢測中的研究進展

楊晨 高衛衛 郭羿成 曾誼

2023年世界衛生組織(WHO)全球結核病報告顯示,全球結核病發病率在2020—2022年估計增加了3.9%[1],扭轉了過去20年結核病發病率每年下降約2%的趨勢。2022年全球估計結核病新發患者例數有1060萬例,然而確診并被報告的結核病患者僅為750萬例,一部分患者未能得到及時診斷。同時,2022年全球耐多藥/利福平耐藥結核病患者估計有41萬例,與過去兩年的數據相仿。可見,進一步提升結核病和耐藥結核病的診斷能力仍舊是迫切需要解決的問題。

目前,涂片鏡檢、培養、表型藥物敏感性試驗(phenotypic drug susceptibility testing,pDST)等傳統的實驗室檢測方法,由于耗時長、敏感度低、生物安全水平高等原因[2-3],難以滿足疾病早期診斷的需求。分子生物學方法雖能同時兼顧結核病診斷和耐藥性判斷,但是依舊存在耐藥基因位點檢測有限等問題,限制其進一步推廣應用[4]。因此,臨床亟需開發更加便捷、高效、準確的檢測技術,滿足結核病早期診斷和指導治療的需求。2023年7月,WHO發布了《應用新一代靶向測序技術檢測耐藥結核病:快速通告》,對新一代靶向測序技術在耐藥結核病診斷中的應用前景給予了高度的重視[5]。納米孔靶向測序作為一種便捷、高效、準確的基因測序新技術,將為結核病及耐藥結核病的早期診斷提供新的技術支持。

納米孔靶向測序的原理及現狀

納米孔靶向測序是一種新興的三代測序技術,測序速度較快,可以進行幾十甚至上百kb(千堿基序列數)的長讀長測序,并實時高效地讀取并分析測序數據[6],因此,在結核病、埃博拉疫情等傳染病監測、人類基因組學研究等方面具有廣泛的應用[7-9]。該技術的檢測過程僅需一個MinION納米孔測序儀即可完成,且機器方便攜帶。MinION配備的流通池有512個通道,每個通道有4個納米孔,共計有2048個納米孔可用于DNA或RNA測序。在每個通道中,納米孔都被固定在與傳感器芯片相連的耐電聚合物膜中,并由特定的集成電路單獨控制和測量。在電解質溶液中,施加恒定電壓通過納米孔產生離子電流,就可以利用一個馬達蛋白牽引帶負電荷的單鏈DNA或RNA分子通過納米孔,而不同堿基在易位過程中通過納米孔引起的不同離子電流變化,會被傳感器記錄下來,并經由一定的算法獲得核苷酸序列,以便能實時、快速進行生物信息學分析[10]。在分枝桿菌鑒定與耐藥基因檢測中,納米孔靶向測序可通過特定的捕獲技術,對臨床標本中結核分枝桿菌/非結核分枝桿菌的核酸及耐藥基因進行靶向富集,以獲得更多用于檢測的數據信息,實現結核病及耐藥結核病的早期、快速診斷[11]。

納米孔靶向測序在分枝桿菌鑒定中的應用

一、納米孔靶向測序檢測結核分枝桿菌

1.呼吸道標本的檢測效能:目前關于納米孔靶向測序診斷疑似肺結核的小樣本研究正陸續開展[12-14],結果顯示,該技術對痰液和肺泡灌洗液檢測的敏感度可達75.9%～94.8%,特異度可達80.8%～97.9%,整體性能明顯優于GeneXpert MTB/RIF檢測(敏感度:26.4%～62.9%;特異度:97.7%～100.0%)和培養法(敏感度:18.6%～57.8%;特異度:65.4%～100.0%)。不過,目前尚缺乏多中心大樣本研究的數據進一步驗證納米孔靶向測序對呼吸道標本的檢測效能。

2.低菌載量標本的檢測效能:納米孔靶向測序可通過靶向擴增富集結核分枝桿菌特征性核酸序列,提供更多的數據信息用于檢測,旨在為低菌載量的結核病(比如涂片陰性肺結核[15]和肺外結核[16])的臨床診斷提供實驗室證據[11, 17]。許多研究報告了納米孔靶向測序在診斷涂陰肺結核患者方面具有較高的陽性檢出率,且比其他常用檢測方法具有顯著優勢。Yu等[18]使用納米孔靶向測序對涂陰肺結核患者的臨床標本進行檢測,陽性檢出率高達91.7%,而經結核分枝桿菌培養的涂片陰性標本的陽性檢出率僅為32.6%。閆曉婧等[19]以50例涂陰疑似肺結核患者的肺泡灌洗液為研究樣本,發現納米孔靶向測序的陽性檢出率為44.0%,高于Xpert檢測(16.0%)和培養法(26.0%)。Yang等[13]對13例結核性胸膜炎患者的胸腔積液標本進行納米孔靶向測序,檢測敏感度為84.6%,比Xpert檢測和培養法分別高出69%和77%。不過,目前使用納米孔靶向測序檢測的臨床標本主要為痰液、肺泡灌洗液及胸腔積液,有關肺外結核的病理組織學標本的研究比較缺乏,亟需進一步探索納米孔靶向測序對病理組織學標本的檢測效能。

二、納米孔靶向測序鑒定非結核分枝桿菌

目前,非結核分枝桿菌的陽性分離率在不斷上升,非結核分枝桿菌病已逐漸成為值得關注的公共衛生問題。不過,傳統的檢測方法無法直接對非結核分枝桿菌的亞群亞種進行鑒定,仍需開展進一步的菌種鑒定(如直接同源基因或序列比較法)[20]。而納米孔靶向測序可以直接對分枝桿菌菌種進行鑒定,實現非結核分枝桿菌的快速診斷與非結核分枝桿菌全基因組構建[11]。Huang等[21]使用納米孔靶向測序快速并準確診斷了1例海洋分枝桿菌病患者,彌補了非結核分枝桿菌分離培養耗時長且要求復雜、PCR技術無法將其與潰瘍分枝桿菌精準區分的缺陷[22],為患者提供了更優的治療時機。Bouso和Planet[23]通過納米孔靶向測序在鳥分枝桿菌復合菌群中完成了鳥分枝桿菌亞種的完整環狀基因組構建,突破了以往短讀長測序可能遺漏非結核分枝桿菌關鍵基因組特征的局限性[24],為納米孔靶向測序用于輔助診斷非結核分枝桿菌感染與探索其致病機制提供了重要依據。此外,還有研究認為,可以將納米孔靶向測序與宏基因組學結合,直接從樣本中檢測全部核酸,同時提高對病原體感染譜中多種病原體的檢測敏感度,為臨床診斷混合感染提供可靠的依據[25]。

納米孔靶向測序在耐藥基因檢測中的應用

一、納米孔靶向測序檢測耐藥基因的技術特色

1.準確識別多種耐藥基因:目前,許多分子檢測技術(比如Xpert檢測[26]和線性探針檢測[27])對耐藥基因的檢測僅限于一個或兩個基因,在實際臨床應用中有所局限[28],而納米孔靶向測序可以將多達幾十種的耐藥基因作為檢測靶標,對十余種抗結核藥物的敏感性進行判斷,包括一些新型抗結核藥物(如利奈唑胺、貝達喹啉、氯法齊明等)[29]。國外已有許多研究報道了納米孔靶向測序在耐藥基因檢測方面的準確性。Mariner-Llicer 等[30]對結核分枝桿菌臨床分離株中的9個耐藥相關基因進行納米孔靶向測序,結果發現與全基因組測序的檢測一致性為100%;Tafess 等[31]使用納米孔靶向測序對結核分枝桿菌的19個耐藥相關基因區域進行耐藥性檢測,結果發現納米孔靶向測序的平均敏感度和特異度分別為94.8%和98.0%。但是,目前國內有關納米孔靶向測序在耐藥基因檢測方面的研究還比較缺乏,仍需進一步探討。

2.進行長讀長測序:由于結核分枝桿菌基因組序列的GC含量高達65%且存在大量基因重復區域,以短讀長測序為特點的二代測序技術被認為可能存在較大的檢測誤差[32]。而納米孔靶向測序可以對GC重復區、堿基修飾區的識別保持高精確率[33-34],因此,適用于檢測具有大量重復區域(如PE_PGRS基因[35])及復雜多樣(如pncA基因[36])的耐藥基因序列。Bainomugisa等[35]比較了納米孔靶向測序與二代測序技術對PE_PGRS基因中單核苷酸多樣性的檢測效能,結果表明,納米孔靶向測序可以鑒定出88個單核苷酸多態性,相比二代測序技術多發現57個。Liu等[37]通過納米孔靶向測序發現了35個散在分布于pncA基因上的突變位點,但由于無法進行表型藥物敏感性試驗[36],納米孔靶向測序對吡嗪酰胺耐藥性的判斷仍需謹慎對待。此外,Bainomugisa等[35]使用納米孔靶向測序對一種廣泛耐藥的結核分枝桿菌菌株進行研究時,發現了3個二代測序技術過去并未識別到的基因組缺失,從而完善了該耐藥菌株所有耐藥突變的記錄。 不過,由于納米孔靶向測序在識別單核苷酸突變過程中容易出現測序錯誤[38],因此,在發現新型(未知)耐藥突變時應首先排除測序錯誤的可能,再謹慎地解釋納米孔靶向測序的檢測結果。

3.實時、快速地進行耐藥基因檢測:由于文庫制備過程簡單,可直接對DNA或RNA進行檢測,節約了操作時間也降低了測序成本,越來越多新的分析軟件與測序平臺開始支持并推廣納米孔靶向測序在檢測耐藥基因方面的應用。Tafess等[31]使用基于納米孔靶向測序的商用測序平臺,對163株結核分枝桿菌分離株進行耐藥基因檢測,達成了與基于二代測序技術的測序平臺一致的檢測效能,但納米孔靶向測序平臺的整個工作流程僅需15 h,比二代測序平臺節省了23 h。Chan等[39]設計了一個可以直接從臨床標本中檢測結核病耐藥性的納米孔靶向測序平臺,整個檢測過程僅需6～9 h,遠少于培養法+表型藥物敏感性試驗的平均耗費時間(69.5 d)及二代測序技術的平均耗費時間(46.85 h)。

二、納米孔靶向測序檢測耐藥基因的不足之處和改進方法

1.識別單核苷酸突變:納米孔靶向測序識別單堿基變異的能力較差[40],被認為很可能是由于納米孔原始數據的高錯誤率,而測序原始數據錯誤源于DNA的不均勻易位速度、低信噪比和多個核苷酸同時通過納米孔[41]。目前,有許多讀取優化方法和糾錯工具,可以用于提高納米孔測序數據的準確性和可靠性[42-43]。(1)加入DNA聚合酶。許多研究表明,摻入DNA聚合酶(如Phi29 DNA聚合酶)可以減緩DNA通過納米孔的異位速度,進而提高納米孔靶向測序數據質量[44-46];(2)改善馬達蛋白/流通池。以在2020年1月發布的最新版R10.3流通池為例,當使用R10.3流通池時,與相同的Sanger序列(一代測序)相比,納米孔靶向測序的檢測準確度可以提高至99.83%,特別是均聚物錯誤平均減少了57%[47];(3)提高讀取深度。有研究建議,可以通過減少MinION部分的測序時間來容許更大的讀取深度,使得MinION可以在稍長的測序時間中,從DNA濃度較低的結核分枝桿菌樣本中產生更可靠的測序數據[48];(4)開發新式分析算法。無論是Sahlin和Medvedev[49]開發的用于轉錄組學讀數錯誤校正的IsONcorrect算法,還是Oxford Nanopore公司近期發布的專門用于提高單分子堿基識別準確性的分析算法Bonito CRF[50],都匯報了納米孔靶向測序經改良后可達到超過98%的準確率;(5)利用文庫糾錯工具。有研究指出,一種文庫適配器CAPTOR可以定量檢測文庫制備過程中的準確性和偏差,并對基因序列的測序錯誤進行經驗建模,進而協助納米孔測序數據集的單核苷酸錯誤的校正和解釋[51]。

2.識別異質性耐藥:異質性耐藥情況指的是患者體內同時分離出敏感菌株和耐藥菌株或是不同耐藥譜菌群在患者體內共存的現象[52]。由于耐藥位點與其他功能位點不一致的突變頻率,以及給藥治療過程中患者自身的不確定進展[53-55],耐藥基因突變的變化過程往往是動態的,因此,可能出現表型耐藥與基因型耐藥不相符或是患者在不同時間對治療藥物表現不同耐藥情況的結果,這就使得常規檢測手段及納米孔靶向測序很難對異質性耐藥群體作出可靠的臨床診斷[56]。如何提高納米孔靶向測序對異質性耐藥群體的檢測效果,是一個值得關注的方向。有研究提出,可以通過提高納米孔靶向測序在未經培養標本的測序深度,來減少因培養導致的遺傳多樣性失真,從而快速準確得到患者的異質性耐藥情況[57]。還有研究認為[58-59],加強納米孔靶向測序在耐藥結核病患者表觀遺傳學領域的研究,以識別DNA不同的甲基化模式對耐藥性發展的影響[60],可能有助于解釋復雜多樣的耐藥機制。

總結與展望

納米孔靶向測序具有便捷高效、長讀長測序等優勢,在分枝桿菌菌種鑒定、檢測高度重復與復雜多樣的基因序列,以及發現新型(未知)耐藥突變方面發揮關鍵作用。隨著納米孔靶向測序技術準確率與通量大小的不斷改善,未來很可能構建出一個開放和集成的系統,來儲存所有類型結核病耐藥基因突變以及相應的臨床診療結果的數據庫,以允許基于納米孔靶向測序技術的全基因組測序能夠很快地更新基因突變的預測算法,從而實現更多結核病患者的精準治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻楊晨:起草文章;高衛衛和郭羿成:對文章的知識性內容作批評性審閱;曾誼:對文章的知識性內容作批評性審閱、獲取研究經費、行政/技術/材料支持、指導、支持性貢獻