小膠質細胞在糖尿病視網膜病變視網膜神經血管單元中的作用

陳 志,王子佩,李 紅,2,3

0 引言

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病引起的可致盲眼部疾病,主要影響工作年齡人群。DR的基本病理改變主要為微血管病變相關的血-視網膜屏障(blood-retina barrier,BRB)破壞以及新生血管的形成[1]。但是,近年來越來越多的研究支持以神經元、膠質細胞與血管系統組合形成的視網膜神經血管單元(retinal neurovascular unit,RNVU)功能失調全程參與DR的發生發展。RNVU中小膠質細胞失衡影響單元結構中其他細胞功能障礙,調整小膠質細胞對維持RNVU正常功能至關重要[2]。本文將對DR視網膜神經血管單元中小膠質細胞的作用機制及研究進展進行綜述。

1 視網膜小膠質細胞

1.1生理功能小膠質細胞起源于卵黃囊并且能夠自我更新,在視網膜和中樞神經系統(central nervous system,CNS)監測局部周圍環境、參與主動免疫防御第一線[3]。正常情況下,視網膜小膠質細胞分布在視神經纖維層(nerve fiber layer,NFL)、神經節細胞層(ganglion cell layer,GCL)、內叢狀層(inner plexiform layer,IPL)和外叢狀層(outer plexiform layer,OPL)[4]。主要功能:(1)清除視網膜中的細胞廢物[5];(2)抵抗感染性物質的過程中參與抗原呈遞、炎癥反應和補體激活,并促進視網膜的組織修復和免疫調節[6];(3)調節祖細胞增殖、分化和神經元存活[7];(4)維持基于突觸結構和視網膜正常視覺功能的突觸傳遞[8];(5)參與血管生成;(6)維持視網膜穩態[9]。總體上小膠質細胞在哺乳動物類進化過程中發揮著基本相似的功能,與周圍的神經元之間存在相互作用,維持視網膜正常生長、發揮免疫監視、突觸修剪等作用。

1.2病理改變小膠質細胞被認為是糖尿病患者高血糖信號的第一個檢測器[10],高糖環境下小膠質細胞數量增多,移行至視網膜外核層(external nuclear layer,ONL)[11],部分學者認為顱內高糖導致腦神經血管單元(neurovascular unit,NVU)結構耦合失調,血-腦屏障破壞,小膠質細胞活化增生并向下移行至視網膜[12]。DR早期小膠質細胞激活態M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)均升高,隨著病情發展,M1/M2比例升高,M1型比例顯著高于M2型[13]。M1型是神經炎癥的重要神經毒性介質之一,分泌促炎因子,如白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)、趨化因子,導致神經元死亡或損傷[14],參與視網膜無灌注區的定位與新生血管形成[15],加劇BRB功能障礙,促進血管滲漏和內皮周細胞凋亡[16]。M2型主要分泌多種抗炎因子和神經營養因子,抑制視網膜炎癥反應、保護神經節細胞和光感受器細胞,減少新生血管形成[17],M1/M2比例異常誘導局部小膠質細胞參與各種炎癥通路,加速DR進程。

2 視網膜神經血管單元

2.1RNVU生理功能RNVU由神經元(神經節細胞、雙極細胞、水平細胞、無長突細胞及光感受器)、膠質細胞(Müller膠質細胞、小膠質細胞及星形膠質細胞)、血管細胞(內皮細胞和周細胞)共同耦合。小膠質細胞分支接觸視網膜血管,分泌營養因子和血管生成因子,控制周細胞和內皮細胞的凋亡,及時清除多余的血管碎片[18-20];Müller細胞、星形膠質細胞為神經元提供代謝支持,維持突觸傳遞[21]。與其他中樞神經系統比較,RNVU的微血管系統線粒體相對較少,視網膜血管密度較低[22]且以分層的方式組成,深血管叢位于內核層(inner nuclear layer,INL)的外表面,中間血管叢位于IPL與INL之間的邊界和NFL中的淺表血管叢[23]。光信號傳導時,RNVU中小動脈和毛細血管會隨著神經元活動而擴張,以增加血流量,并提供足夠的營養來滿足神經元的代謝需求[24-25]。RNVU各類細胞和細胞間緊密連接組成BRB,維護屏障功能;神經元和血管間緊密配合實現光信號及時快速的傳遞。

2.2糖尿病視網膜小膠質細胞激活與RNVU改變

2.2.1視網膜血管細胞變化高糖、缺血缺氧激活小膠質細胞,通過PI3K/STAT3/NF-κB信號通路釋放過量的促炎介質、細胞因子、趨化因子、補體、半胱天冬酶以及谷氨酸等誘導視網膜血管內皮細胞凋亡;活化的小膠質細胞穿透內層血-視網膜屏障(inner blood-retinal barrier,iBRB)的基底膜并吞噬iBRB內皮細胞,或誘導視網膜血管周細胞產生活性氧基團(reactive oxygen species,ROS),上調NF-κB-p65蛋白和Caspase-3蛋白,加速周細胞凋亡,重塑血管[26-29];小膠質細胞來源的旁分泌途徑產生的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)與VEGF/VEGFR-2結合介導視網膜血管內皮細胞生成反應,改變新生血管管壁完整性,促進DR中視網膜新生血管長出及血管滲漏[30];在DR的缺血缺氧條件下因BRB中的連接蛋白半通道開放促進ATP從細胞內流出,ATP過度刺激、激活P2X7受體誘導視網膜小膠質細胞活化,分泌IL-1β、TNF-α等細胞因子增加,刺激NLRP3炎癥小體自分泌激活,局部上調的炎癥因子導致血管周細胞損傷,鈣信號、鉀離子通道失調,促進DR中的炎癥反應,引發微血管細胞、神經元死亡[31-33]。

2.2.2大膠質細胞變化RNVU中包含兩類大膠質細胞,即Müller細胞和星形膠質細胞。Müller細胞主要調節視網膜代謝以及調節神經元和血管功能,正常情況下,Müller細胞可作為細胞外ATP的一個潛在來源,介導小膠質細胞的動態變化調節[34]。星形膠質細胞位于NFL,包圍血管和神經節細胞,具有提供營養和調節支持的功能[35]。長期高糖環境,活化的視網膜小膠質細胞向Müller細胞發出信號,直接影響Müller細胞形態變化和功能反應。小膠質細胞激活后上調TNF-α、IL-1β等炎癥因子表達,促進Müller細胞膠質化、VEGF表達增加[36]。反之,Müller細胞可通過趨化性和黏附性細胞接觸增加小膠質細胞誘導的視網膜炎癥反應[37]。Müller細胞通過激活CD40-ATP-P2X7/NLRP3信號通路協同小膠質細胞形成促炎反應,并使RNVU形成炎癥級聯反應,造成視網膜炎癥環境、影響視網膜內皮細胞死亡與毛細血管變性[38]。星形膠質細胞和小膠質細胞之間以層黏連蛋白依賴的方式相互作用,星形膠質細胞增生引起小膠質細胞活化,調節視網膜血管分支和內皮細胞增殖,DR進程中小膠質細胞和星形膠質細胞均發生膠質增生、轉運蛋白上調[39]。

2.2.3神經元變化DR發生發展過程中小膠質細胞對神經元有雙重作用。DR早期,激活的小膠質細胞釋放神經保護類因子,保護神經元免受Müller細胞膠質化增加引起的谷氨酸毒性作用,但隨著DR病程的進展小膠質細胞分泌過多炎癥因子加速神經元凋亡。小膠質細胞激活后上調谷氨酰胺合成酶,促進谷氨酸轉化為谷氨酰胺,降低谷氨酸毒性,增強小膠質細胞中胰島素介導的葡萄糖攝取,緩解小膠質細胞的炎癥反應,下調NO的生成[40];與此同時,作為信號分子的ROS發揮了相互矛盾的作用,包括下調減少ROS參與神經元極性的建立、生長錐延伸、突觸連接和神經網絡的形成等過程;但也增加ROS對蛋白質、脂質和DNA的有害的氧化應激作用,導致神經元死亡[41]。視網膜神經元分泌的單核趨化蛋白(monocyte chemoattractant proteins,MCP-1)刺激小膠質細胞活化,并通過p38-MAPK、ERK和NF-κB信號通路誘導小膠質細胞釋放TNF-α,分泌促炎因子(如IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α等),引起凋亡蛋白Caspase-3活化,促進視網膜神經元死亡。谷氨酸、Caspase-3、ROS等神經毒性介質的產生可導致神經細胞功能障礙,損傷視網膜血管周細胞和內皮細胞[42-44]。

總之,高糖環境可引起視網膜RNVU各個組成成分發生變化,小膠質細胞與RNVU中其他細胞相互作用,共同參與DR的發生發展,因此針對小膠質細胞作為靶向治療DR在近年的研究中備受重視。

3 DR治療方案對小膠質細胞和RNVU的影響

小膠質細胞可通過免疫防御受體(Toll樣受體、主要組織相容性復合體Ⅰ類和Ⅱ類等)、免疫監視相關受體、細胞因子受體等發揮抗原提呈功能、分泌功能、吞噬功能及與神經系統其他細胞相互作用等功能,發揮神經元的保護作用[45-46],也可通過Wnt-Fll途徑抑制深層血管叢產生過度分支。深層視網膜血管叢旁聚集的小膠質細胞可特異性表達Wnt5a和Wnt11配體等Wnt信號成分,表達VEGF抑制蛋白可溶性Fll,從而抑制視網膜深層血管叢的血管分支[47]。因此,激活小膠質細胞Wnt信號通路,有望成為抑制DR中視網膜產生新生血管的重要靶點,保護血管細胞及血管完整性。

3.1視網膜激光光凝視網膜激光光凝目前仍為經典的DR治療手段,激光可破壞無灌注區視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)層,減少視網膜需氧量,增加脈絡膜與視網膜血流溝通。動物實驗顯示,視網膜激光光凝后早期周圍視網膜以及下方脈絡膜和鞏膜中出現CD11b、F4/80和iba1等小膠質細胞標志物呈陽性的細胞增殖。激光術后炎癥主要由小膠質細胞觸發,通過釋放促炎細胞因子介導視網膜炎癥反應,通常導致原發性神經元損傷的加重[48-51]。研究顯示,視網膜疾病進行局灶性激光治療后,視網膜小膠質細胞可能以各種活動狀態存在,并且在局部損傷后可能從“靜息”狀態轉變為“激活”狀態[52]。“激活”的小膠質細胞可能會釋放神經營養因子和炎癥介質,神經營養因子發揮血管保護和神經保護作用,這也是糖尿病性黃斑水腫(DME)局灶性激光獲益的基礎[53],而小膠質細胞釋放的炎癥因子則加重局部視網膜及神經損傷。因此,雖然視網膜激光光凝可能加重小膠質細胞的激活,但通過改變視網膜激光光凝方式,減少曝光時間可抑制炎癥反應,并促使激活的小膠質細胞發揮神經保護作用[54],進而保護RNVU中的神經元,達到延緩DR進展的治療效果。

3.2藥物治療針對DR小膠質細胞被激活后出現促炎型M1及抗炎型M2兩種極化狀態,通過藥物調節M1/M2比例有望成為以小膠質細胞為靶點治療DR的一種方案。目前,臨床上治療DR使用的抗VEGF藥物及口服藥物均在一定程度上促進小膠質細胞向M2型轉化。DR中視網膜VEGF表達上調,并與VEGFR-1結合激活小膠質細胞,促進炎癥介質及促新生血管生成介質的產生[55-58],抗VEGF藥物通過抑制VEGF受體改善視網膜缺氧區域的新生血管形成,減輕視網膜水腫及出血[59-61]。此外,抗VEGF治療可顯著降低相關細胞因子和趨化因子、細胞間黏附分子(intercellular adhesion molecules,ICAM-1)的表達、緊密連接蛋白ZO-1的異常定位和變性及細胞黏附蛋白血管內皮鈣黏蛋白的表達,抑制糖尿病相關的血管滲漏、白細胞淤積和血管內皮細胞增生[58]。抗VEGF藥物可通過抑制新生血管產生、改善視網膜炎癥環境保護RNVU中血管內皮細胞。

糖皮質激素(glucocorticoids,GCs)常用于治療抗VEGF治療療效差或特殊類型的DME,GCs通過小膠質細胞上糖皮質激素受體(glucocorticoid receptors,GCR)能夠抑制炎癥反應,是GCs發揮抗炎作用的重要靶點[62]。研究顯示,低劑量的地塞米松(DEX)、曲安奈德(triamcinolone acetonide,TA)可能會使小膠質細胞向M2型轉化,從而增強神經保護作用并抑制促炎小膠質細胞的活化及浸潤,保護視網膜感光細胞及視神經[63-64]。類固醇激素可以通過抑制小膠質細胞M1型的炎癥反應、增強M2型的神經保護作用,進而保護RNVU神經元、減輕光感受器細胞損傷,但需密切監測用藥過程中眼壓變化及白內障發生情況。

目前臨床上有多項小樣本藥物研究顯示,在DR或DME治療中,抗生素類(沙星類)和四環素類藥物可通過TLR4/NF-κB途徑減弱小膠質細胞炎癥反應,抑制小膠質細胞活化,減少炎癥因子、細胞毒性物質釋放及Caspase-3活性,抑制視網膜炎癥反應及神經元損傷,進而保護RNVU各細胞單元結構[65-66]。常用的降糖藥二甲雙胍可通過下調血清胱抑素C(cystatin C,CysC)介導炎癥和氧化應激反應[67-68],褪黑素可增加小膠質細胞中磷酸化信號轉導和轉錄激活因子-3(STAT3)的表達[69],姜黃素和白藜蘆醇可減少髓細胞觸發受體2(TREM2)和Toll樣受體4(TLR4)的失衡并平衡下游NF-κB的激活[70-71],高選擇性α2-腎上腺素能激動劑右美托咪定可通過MAPK/ERK途徑[72],非選擇性ATP敏感性鉀(KATP)通道開放劑Pinacidil[73]可通過直接調節改變小膠質細胞極化M1/M2比例,將M1促炎表型轉變為M2抗炎表型,促進小膠質細胞向M2抗炎表型極化,同時下調M1促炎表型比例,抑制TNF-α和IL-1β的產生,減少視網膜炎癥,下調高糖環境中Müller細胞膠質增生。總之,通過藥物改善高糖誘導的視網膜小膠質細胞M1/M2比例,能夠促進神經保護、抑制炎癥通路、減少炎癥介質,改善局部炎癥反應,保護RNVU各結構完整性。但上述藥物轉化小膠質細胞表型在治療DR中的療效及安全性仍需進行長期、多中心研究證實。

3.3基因治療miRNA能夠調節DR基因轉錄及其相關信號通路,其中miR-124可調節神經元分化和小膠質細胞發育,使巨噬細胞和小膠質細胞向M2型分化,促進小膠質細胞的靜止,并與視網膜小膠質細胞中MCP-1 mRNA的3’-UTR結合抑制天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶(aspartylglucosaminidase,AGA)誘導的MCP-1表達[74-77]。Dong等[78]通過敲低人肺腺癌轉移相關轉錄本1基因(metastasis associated in lung denocarcinoma transcript 1,MALAT1)抑制amadori糖化白蛋白誘導的MCP-1在視網膜小膠質細胞中的積聚,并證明MALAT1可通過直接與miR-124結合調節小膠質細胞中AGA誘導的MCP-1表達,從而作為競爭性內源性RNA發揮作用。MALAT1通過增加髓細胞分化因子-88銜接蛋白(MyD88)啟動子的H3組蛋白乙酰化上調MyD88的表達,然后激活IL-1受體相關激酶(IRAK1)/腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)軸傳導促進小膠質細胞激活引起的炎癥級聯反應[79-80]。雖然MALAT1還有許多調節小膠質細胞的方式未被探索,但MALAT1有望成為抑制DR中小膠質細胞過度激活的靶點[81]。miR-124在DR炎癥的發展中起著重要作用,MALAT1-miR-124-MCP-1信號通路可能參與AGA誘導的小膠質細胞MCP-1的表達,這可能為治療DR提供一種新的途徑[78]。上述研究表明,在糖尿病環境中基因療法調節視網膜和其他組織中的小膠質細胞激活、轉化及炎癥介導并預防RNVU中神經膠質細胞功能障礙可能是治療DR炎癥的有效手段[82]。

4 小結

小膠質細胞作為RNVU組成結構之一,對于維持神經血管單元各結構之間的相互關聯、保障視網膜穩態環境具有重要意義。在DR中小膠質細胞參與炎癥反應影響RNVU中神經元、膠質細胞和血管細胞之間正常的結構與生理功能,同時也影響視網膜穩態平衡。藥物、激光治療可通過改變小膠質細胞M1/M2極化轉換,影響RNVU功能結構的完整性,改善高糖對視網膜血管、膠質細胞及神經元的作用。基因療法以RNVU中小膠質細胞為靶點調節DR炎癥反應,達到保護RNVU結構與生理功能的目的,更加精準的基因水平調控小膠質細胞向抗炎型轉換或許是未來維護DR發生發展過程中視網膜RNVU功能新的方向。