高粱SBP基因家族鑒定及干旱脅迫下的表達模式分析

姜昱雯　陳滿靜　趙應　任艷　周棱波　沈佳奇　邵明波

摘要：在高等植物中，SQUAMOSA Promocer Binding Procein-Box（SBP）普遍參與植物的生長、開花調控及細胞程序性死亡等過程。本研究對高粱（Sorghum bicolor L.）SBP轉錄因子家族進行鑒定并進行生物信息學分析，同時利用qRT-PCR對高粱SBP基因在PEG-6000模擬干旱脅迫下的表達進行分析，以驗證其功能。結果表明，從高粱中共鑒定出19個SBP成員，除第8條染色體外，其他9條染色體上均分布有SBP基因：絕大部分SBP蛋白在亞細胞水平定位于細胞核，且均為親水性蛋白質。系統發育分析結果表明，與水稻類似，這19個高粱SBP基因也可分為3個亞類，分別含有7、5、7個SBP基因：相比于擬南芥，高粱SBP與水稻、玉米的SBP關系更近。啟動子順式作用元件預測結果顯示，高粱SBP可能參與了脫落酸、茉莉酸甲酯信號通路，部分成員可能與植物的低溫響應、晝夜節律調控有關。qRT-PCR分析結果顯示，高粱SBP基因的表達具有組織特異性，有17個基因受干旱脅迫誘導上調表達，且隨脅迫時間的延長存在差異化表達模式。本研究結果可為后續研究高粱SBP基因的功能提供理論依據。

關鍵詞：高粱；SBP基因家族；生物信息學分析；基因表達；干旱脅迫

中圖分類號：S514：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0001-10

轉錄因子是生物體中分子調控網絡的重要組成部分，控制著植物生長發育、脅迫響應等一系列生物學過程，不同的轉錄因子家族結合的下游基因啟動子基序存在顯著差別。SQUAMOSA romoter Binding Protein-Box（SBP）是一類植物特異性的轉錄因子家族，因其成員含有高度保守的DNA結合結構域SBP而得名。SBP保守結構域由約76個氨基酸殘基組成，參與下游基因啟動子DNA的GTAC核心基序結合及細胞核定位，并有兩個典型的鋅指結構。SBP家族成員于1996年首次在金魚草（Antirrhinum majus）中鑒定獲得，即AmSBP1與AmSBP2，且研究發現這兩個SBP成員可以直接結合到花分生相關基因SQUA-MOSA的啟動子上調控基因表達。其后在多個物種中鑒定到SBP家族成員，如藍莓（Vacciniumspp.）、甜根子草（Saccharum spontaneum L.）、黑胡椒（Piper nigrum L.）、擬南芥（Arabidopsis thali-ana）及水稻（Oryza sativa）等，其功能涉及到植物信號轉導、防御響應、花和果實發育及相變過程等。如在模式植物擬南芥中共鑒定到16個SBP家族成員，其中，SPL3、SPA和SPL5是開花調控基因LEAFY、FRUITFUL和APETALA1的上游調控子，三者功能冗余，共同調控擬南芥的花發育過程：SPL9和SPL15是植物間隔期和分枝的調控子。在黑胡椒中共鑒定到34個SBP成員，其中17個成員上發現有MiR156的結合位點。水稻中共鑒定到19個SBP成員，其中SPL14控制著水稻分蘗，SPL16可以調控水稻籽粒性狀和質量。

高粱（Sorghum bicolor L.）是禾本科高粱屬一年生草本植物，是世界第五大禾谷類作物，同時也是極為重要的旱糧作物，被廣泛應用于釀酒、食用、飼料、制糖及淀粉制造等方面，具有很高的應用價值。2009年高粱全基因組測序完成，推動了其生長發育調控關鍵基因家族鑒定工作的開展。另外，全球氣候的極端變化也使得生物基因家族的鑒定及功能研究變得尤為重要。高粱具有較強的抗旱性，挖掘其抗旱基因對加快其抗旱育種進程、提高產量具有重要意義。本研究對高粱SBP基因家族進行鑒定，并基于基本理化性質分析、系統發育分析、蛋白一級結構及啟動子基序預測等對其進行生物信息學分析，同時利用qRT-PCR分析其在高粱不同組織中及在干旱脅迫不同時間下的表達模式，以期為后續深入研究SBP轉錄因子家族在高粱生長發育過程中的功能并篩選出優良基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

受試高粱種子購白紅纓子農業科技發展有限公司。2023年10月將種子播于營養豐富的土壤基質中進行光照恒溫培養，溫度為23℃。待幼苗長出4-5片葉時進行干旱脅迫處理，即將幼苗根部直接浸在10%的PEG-6000溶液中，分別于處理0、4、12、18、24、36h采集樣品，并置于液氮中速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2 數據來源

擬南芥的SBP基因下載于TAIR（https：／／ww.arabidopsis.org/），水稻和高粱的SBP家族成員從PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）網站獲得。高粱基因組、mRNA、蛋白組及相應的GFF文件來自于Phytozome（http：//phyto-zome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數據庫。

1.3 試驗方法

1.3.1 高粱SBP家族成員鑒定

通過NCBI（ht-tps：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的Blast功能，利用擬南芥16個SBP成員的氨基酸序列在高粱蛋白組中進行序列預測（E value≤10-5），獲得SBP候選蛋白序列，再通過NCBI的保守結構域分析功能及pfam（http：//pfam.xfam.org/）網站檢測序列中是否存在SBP結構域。通過TBtools軟件提取高粱SBP成員的CDS、啟動子序列，方便后續分析。

1.3.2 SBP家族系統發育分析

獲得擬南芥、水稻、玉米及高粱的SBP氨基酸序列后，利用MEGA軟件使用鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育樹，Bootstrap設置為1000，構建好的系統發育樹使用Figtree軟件進行優化。另用高粱的19個SBP家族成員構建系統發育樹，Bootstrap設置為1000。

1.3.3 高粱.SBP基因染色體定位

使用TBtools工具箱中的Gene Location Visualize from GFT/CFF工具，按照操作指示，分別導入高粱基因組的GFF文件和.SBP基因的ID信息，獲得染色體定位圖片，并用Photoshop軟件進行美化調整。

1.3.4 高粱SBP成員的理化性質分析

在Prot-Param（http：//us.expasy.0rg/tools/protparam.html）網站上對高粱SBP成員的氨基酸序列長度、等電點、帶負電荷殘基數、帶正電荷殘基數、不穩定指數、脂肪族氨基酸指數和平均疏水性進行預測，并利用PSORT（http：//psort.hgc.jp/）對其進行亞細胞定位預測。

1.3.5 高粱SBP基因啟動子順式作用元件分析

利用TBtools提取SBP基因的2000bp啟動子序列，然后以fasta格式導入Plantcare（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht-ml/）網站分析潛在的順式作用元件，并統計各基序在.SBP啟動子上的分布。

1.3.6 SBP基因家族共線性分析

利用TBtools軟件分析高粱與擬南芥.SBP基因在染色體上的分布和共線性關系并作圖，使用Adobe IllustratorCS5軟件對圖片進行優化。

1.3.7 總RNA的提取和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

用TIANCEN RNA Easy Fast植物組織RNA快速提取試劑盒提取總RNA，用TIAN-GEN FastKingCDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄為CDNA，-20℃保存備用。用Premier 5.0設計qRT-PCR引物（表1），以SbACTIN為內參基因。PCR反應體系10μL：2xSYBRGreen5μL，上、下游引物各0.2μL，cDNA 0.5μL，ddH20 4.1μL。qRT-PCR程序：95℃30s;95℃Ss，58℃25s，72℃18s，循環40次：95℃Ss，650C1min。用2-△△Ct法進行基因表達量計算。

2 結果與分析

2.1 高粱SBP家族成員的鑒定

利用已發表的16個擬南芥SBP成員的氨基酸序列在Phytozome網站進行BLASTP序列比對，共獲得21個高粱候選SBP基因。進一步通過Pfam和NCBI在線網站分析獲得基因的蛋白結構域，去除不含SBP結構域的序列，最終得到19個高粱SBP家族成員（表2、圖1）。

理化性質分析（表2）發現，高粱SBP家族成員的氨基酸序列長度差異較大，最短的僅218aa，最長的為SORBI_3007G207000，達1119aa。預測等電點差異也較為明顯，其中酸性蛋白較少，僅有3條，堿性蛋白有16條，表明高粱SBP蛋白多為堿性蛋白。不穩定指數小于40的蛋白僅有SOR-BI_3010G254200，穩定性較高，其余蛋白的穩定性均較低。所有高粱SBP成員的平均疏水性均為負數，表明SBP蛋白都是親水蛋白。亞細胞定位預測結果顯示，除SORBI_3007G207000外，其余蛋白均定位在細胞核中，這可能與SBP轉錄因子行使功能有關。

蛋白結構域分析結果（圖1）表明，所有高粱SBP成員的氨基酸序列上均含有典型的SBP結構域，包括兩個鋅指結構和核定位信號。此外，SORBI_3001G026500、SORBI_3003G139900、SOR_BI_3007G207000及SORBI_3009G135000的氨基酸序列羧基端包含一個Ank_2 superfamily結構域，暗示著他們可能有一些共同的特殊功能。

2.2 高粱SBP家族系統發育分析

用擬南芥（16個）、水稻（19個）、玉米（28個）及高粱（19個）的SBP成員氨基酸序列，通過MEGA進行系統發育分析，結果將所有SBP大致分為3個亞類（圖2），這與在水稻中的研究結果類似。每個亞類均包含水稻、擬南芥、玉米和高粱的SBP成員，表明SBP家族的分化在物種分化前即已形成。從進化枝上看，相對于擬南芥，高粱與水稻、玉米的SBP家族進化關系更為接近。

高粱的SBP成員也分為3類，分別含有7、5、7個SBP成員（圖3）。DNA結構分析發現，在系統發育關系上比較靠近的基因，其外顯子和內含子分布結構更為相似，如SORBI_3006G247700、SORBI_3004C062100和SORBI_3010C215700均包含3個外顯子和2個內含子；SORBI_3001G026500、SORBI_3003G139900和SORBI_3007G207000分別含有10、10個和9個內含子。

2.3 高粱SBP家族成員的染色體定位分析

對高粱SBP基因的染色體定位分析發現，除第8條染色體外，其余9條染色體上均分布有SBP基因（圖4）。其中，2號染色體上分布有4個SBP基因，數量最多，且表現出聚類分布的情況，兩兩聚在一起：4號和7號染色體上均分布有3個SBP基因，3、6、10號染色體上均有2個SBP基因，1、5、9號染色體上均僅有一個.SBP基因。

對高粱染色體的基因密度及其與擬南芥的共線性分析結果（圖5）顯示，高粱與擬南芥間存在61對共線性關系，并且高粱的SBP基因在染色體上主要位于基因高密度區域，表明SBP基因在高粱染色體上呈熱點區域分布。

2.4 高粱SBP家族基因的啟動子基序分析

為了解高粱SBP基因可能參與的生物學過程，對19個成員轉錄起始位點上游2000bp的啟動子區域進行順式作用元件預測，結果（表3）顯示，高粱SBP基因啟動子區擁有豐富的順式作用元件，主要包含有脫落酸響應元件、厭氧誘導響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、光響應元件、低溫響應元件、MYB轉錄因子結合位點及晝夜節律調控位點等。這些順式作用元件的存在暗示著SBP基因廣泛參與了高粱的生物學過程。如除SORBI_3004G036900和SORBI_3002C312200外，其余17個成員啟動子上均包含有脫落酸響應的ABRE結合基序，暗示著高粱SBP家族可能普遍參與了其干旱響應過程：茉莉酸甲酯響應元件TGACG在SORBI_300IG026500等15個成員啟動子上均有分布，表明這些基因可能受到茉莉酸甲酯的誘導：此外，光響應元件G-box、MyB轉錄因子結合位點等在高粱SBP基因啟動子上的分布也較為普遍。推測高粱SBP家族可能參與了植物響應干旱、光和低溫等多種生物學過程。

2.5 高粱SBP家族基因的表達模式分析

為進一步研究高粱SBP基因的潛在功能，對19個SBP基因在高粱幼苗全株、葉、根、莖和花／種子中的表達模式進行了分析。通過Phytozome網站獲得各個成員的組織表達量，并利用TBtools軟件構建組織表達熱圖。結果（圖6A）發現，各基因在高粱幼苗不同組織中的表達量存在明顯差異，其中SORBI_3003G139900、SORBI_3007G207000、SORBI_300IG026500和SORBI_3009G135000在各組織中的表達量均最高，而SORBI_3006C171000、SORBI_3004G062100和SORBI_3010G215700在各組織中的表達豐度均較低。其中，SORBI_3003G139900、SORBI_3007G207000、SORBI_300IG026500等在莖中的表達量最高，SORBI_3007G193500在花／種子中的表達量最高，SORBI_3002G312200和SORBI_3002G312300在根中的表達量最低。表明這些SBP基因在高粱生長發育過程中發揮的功能具有差異性。

此外，本研究選取啟動子區含有脫落酸響應元件ABRE的17個SBP基因檢測其在干旱脅迫下的表達模式，結果（圖6B）發現，這17個基因在干旱處理一段時間后，均呈現出表達量上調的趨勢，暗示SBP家族基因參與高梁響應下旱脅迫的積極作用。其中SORBI_300IG026500、SORBI_3003G139900、SORBI_3004G058900、SORBI_3004_062100、SORBI_3005G120600、SORBI_3006G24770和SORBI_3009G135000均在干旱處理24h表達量最高，而SORBI_3010G254200、SORBI_3010G215700、SORBI_3002G247800、SOR-BI_3006G171000和SORBI_3007G210200在干旱處理36h表達量才達到最高。此外，SORBI_3010G254200和SORBI_3007G193500在干旱誘導初期先表現出抑制下調，隨后才逐漸上調表達。可見，高粱的SBP家族成員隨干旱脅迫時問的延長呈現出差異化的表達模式，暗示著其在響應干旱脅迫時可能有著不同的功能。

3 討論與結論

作為植物特有的轉錄因子家族，當前的研究認為SBP家族參與了植物體內多種生物學過程，不僅參與了植物的生長發育調控，而且在植物響應逆境脅迫過程中發揮著重要作用。因此，開發植物SBP家族基因并進行功能研究具有重要意義。

不同物種的SBP基因數量存在顯著差異，如矮牽牛（Petunia axillari.s）中有21個SBP基因，梅花（Prunus mume）中有15個SBP基因，白梨（Pyrus bretschneideri）中有32個.SBP基因。本研究從高粱中鑒定出l9個.SBP家族基因，與水稻的SBP基因數量相當，多于擬南芥，少于玉米。SBP基因數量的變化可能與物種的進化歷史及環境選擇相關。

本研究結果表明，高粱SBP基因的氨基酸序列均包含有典型且高度保守的SBP結構域，與在其他物種中的結果一致：部分基因的氨基酸序列羧基端包含一個Ank_2 superfamily結構域，該結構域為錨蛋白重復序列，但其在SBP行使功能過程中發揮的作用還未知。

系統發育分析發現，高粱、擬南芥、水稻、玉米的SBP家族成員可分為3個亞枝，并且每個亞枝中均含有這4個物種的SBP成員，表明SBP家族在單子葉和雙子葉植物分化前即已擴張為3個亞枝，這與之前的研究結果一致。此外，高粱與水稻、玉米的SBP基因具有更近的進化關系，且同一進化枝的SBP直系同源基因可能具有類似功能。從系統發育樹還可看出，擬南芥的SBP家族擁有更多的旁系同源基因對，如AT1 G20980.J與AT2CA7070.1，AT1G53160.1與AT3C15270.1等，表明在單雙子葉物種分化后，高粱與擬南芥^SBP基因經歷了不同的物種特異性基因復制或丟失事件。

有報道表明，SBP基因在植物響應非生物脅迫如干旱、鹽脅迫等過程中發揮重要功能。如白樺（Betula platyphylla Suk.）SBP家族成員SPL9會受到鹽和PEG-6000的誘導表達，擬南芥異源轉基因實驗發現SP/9通過清除活性氧提高植物對鹽旱的耐受性：中國野生葡萄（Vitis）的SBP16在擬南芥中表達后通過調控SOS和ROS信號通路提高植株的干旱和鹽抗性：水稻miR156k通過降低靶基因SPL3、SPL14和SPL17的表達減弱其抗冷性：玉米的部分SBP家族基因會受到干旱、冷、鹽等的誘導表達。本研究發現，高粱19個SBP成員中有17個含有ABRE脫落酸響應元件，進一步的qRT-PCR檢測顯示，這17個基因受到干旱脅迫的誘導表達，但隨脅迫時間延長的表達模式存在差異，結合這些基因在高粱不同組織中的差異化表達，推測它們可能在高梁響應干旱過程中發揮著不同的功能，這為后續探究SBP基因在高粱生長發育及非生物脅迫響應方面的作用機制奠定了一定的理論基礎。

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎-ZK[2023]一般169）；貴州省基層農技推廣項目（仁懷基地示范[2301]01號）；貴 州省科技成果應用及產業計劃項目（黔科中引地[2022]4045）