石榴蔗糖代謝相關酶SPS和INV基因家族鑒定與表達分析

馮立娟　李英朋　王傳增　尹燕雷　郭琳　譚偉

摘要：蔗糖磷酸合成酶（SPS）和蔗糖轉化酶（INV）是蔗糖代謝的關鍵調控酶，在植物生長發育過程中起重要作用。本研究利用生物信息學和熒光定量PCR等分子手段，鑒定石榴SPS和INV基因家族成員，分析其理化性質、保守結構域、保守基序、二級結構、亞細胞定位、系統進化關系和表達模式。結果表明，從石榴基因組中鑒定出4個SPS基因和11個INV基因，其編碼蛋白均為不穩定蛋白，具有典型的保守結構域，家族成員間特征motif數量和種類大致相同，蛋白結構高度保守：這些蛋白不均勻地分布在染色體上，均定位于葉綠體中，二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成。石榴SPS和INV基因家族成員間存在不同程度的親緣關系，與巨桉同源性較高；不同SPS和INV基因在石榴果實不同發育時期的表達模式存在差異，PgINV3在9月15日（果實增大期）表達水平最高，顯著高于其他時期。本研究結果對解析石榴果實中蔗糖代謝的分子機理具有重要意義。

關鍵詞：石榴：SPS基因：INV基因：生物信息學分析：基因表達

中圖分類號：S665.4：Q781 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）03-0011-08

石榴（Punica granatum L）是我國重要的特色果樹之一，果實營養價值高，保健功能強，越來越受到消費者青睞。山東石榴栽培歷史悠久，種質資源豐富，發展面積日益增加，成為山東省打造鄉村振興齊魯樣板的良好選擇。果實品質提升是提高石榴市場競爭力的重要途徑。蔗糖積累是決定石榴果實風味和品質的重要因子，在其生長發育和產量形成過程中起重要作用。研究石榴果實蔗糖代謝機理對其果實品質調控具有重要的理論意義。

蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）催化尿苷二磷酸葡糖（UDPG）和果糖-6-磷酸（F6P）生成蔗糖-6-磷酸（S6P），S6P在蔗糖磷酸酯酶（SPP）作用下不可逆形成蔗糖。SPS是植物體內控制蔗糖合成的關鍵酶，由多基因家族編碼，在不同物種中的成員數量不同，且同一物種中不同家族成員調控蔗糖合成的能力也不相同。目前已在柑橘和甜櫻桃中鑒定出4個SPS基因，在蘋果和梨中鑒定出8個SPS基因。蔗糖轉化酶（invertase，INV）不可逆地催化蔗糖裂解為果糖和葡萄糖，分為酸性細胞壁轉化酶（CWIN），酸性液泡轉化酶（VIN）和堿性／中性轉化酶（A/N-Inv）。在草莓中鑒定出8個Fa，A/N-Inv基因家族成員，其中4個不僅具有組織特異性，還具有果實發育階段特異性和品種特異性表達特點，受細胞分裂素、赤霉素和生長素誘導。過表達SoSPS1基因可提高轉基因甘蔗葉片的SPS活性和蔗糖含量，提高可溶性酸性轉化酶（SAI）活性及葡萄糖和果糖水平。

目前，國內外在石榴蔗糖代謝方面的研究甚少，SPS和INV基因家族成員鑒定與表達方面的研究尚未見報道。因此，本研究基于全基因組測序結果對石榴SPS和INV基因家族成員進行鑒定，分析其理化性質、保守結構、二級結構及系統進化關系等生物信息學特性，并解析其在果實發育過程中的表達模式，以期為深入研究石榴果實蔗糖積累的分子機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 石榴SPS和INV基因家族成員鑒定

從NCBI數據庫中下載PgSPS和PgINV蛋白序列，與石榴全基因組（ASM765513v2）數據庫進行同源比對，初步獲得SPS和INV候選序列。通過Pfam在線數據庫（http：//pfam.xfam.org）進行進一步的蔗糖合成結構域（PF00862）、糖基轉移結構域（PF00534）和蔗糖-6-磷酸磷酸水解酶結構域（PF05116）驗證。利用SMART（http：／／smart.embl-heidelberg.de）進行蛋白結構域分析，去除結構不完整的序列，最終確定目的基因。

1.2 石榴SPS和INV基因家族成員生物信息學分析

利用在線軟件ProtParam預測石榴SPS和INV蛋白分子量、等電點、脂肪系數等理化性質。利用CDD和MEME軟件分析保守結構域和保守基序。利用SOPMA和Plant-mPLoc軟件預測二級結構和亞細胞定位。

1.3 系統進化樹構建

使用MEGA6.0軟件，采用NJ法（neighbor-joining）對石榴、蘋果、葡萄和巨桉的SPS和INV蛋白進行系統進化樹構建。Bootstrap值設為1000，去除Bootstrap支持率低于50%的節點，顯示各分支長度。

1.4 熒光定量表達分析

2022年7月15日開始采集‘泰山紅石榴果實，分別在7月30日、8月15日、8月30日、9月15日、9月30日采1次，直至果實成熟（10月15日）。利用RNA prep Pure Plant Kit試劑盒提取籽粒總RNA，反轉錄成cDNA。使用SYBR GreenPCR Master Mix試劑盒、利用BIO-RAD IQ5實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR分析。每個樣品設3次生物學重復。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1）。以石榴Actin（GU376750.1）為內參，默認條件下讀取Ct值，相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.5 數據處理與分析

利用Microsoft Excel 2010進行數據處理及作圖，用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 石榴SPS和INV基因家族成員鑒定

從石榴中鑒定出4個SPS基因和11個INV基因，分別命筆為PgSPS1-PgSPS4和PgINV1-PgINV11（表2）。通過分析蛋白理化性質可知，4個SPS蛋白的氨基酸數量在1029-1067之間，相對分子量在114816.80-119337.14 Da范圍內：等電點在6.26-6.72之間，均在酸性范圍內：脂肪系數在84.87-87.92之間，不穩定系數在42.60-49.65范圍內，均為不穩定蛋白。11個INV家族成員的氨基酸數量在531-679范圍內，等電點在5.62-7.58之間：脂肪系數為79.48-94.80.不穩定系數介于43.62-55.16之間，也均為不穩定蛋白。

2.2 石榴SPS和INV蛋白保守結構域分析

PgSPS1、PgSP52和PgSPS3蛋白屬于PLN00142超級家族成員，其中PgSPSI和PgSP53包含糖基轉移酶（Clycos_transf_1）保守結構域，PgSPS2含GlycosVltransferase_GT保守結構域；Pg-SPS4也含有Glycos_transf_1保守結構域（圖1）。

PgINV5和PgINV10含有Glyco_hydro_100糖基水解酶結構域。除PgINV5外，其余10個INV蛋白均含有GDB1結構域。

2.3 石榴SPS和INV蛋白保守基序分析

由圖2可見，4個SPS家族成員的保守基序數量均為7，且均為Motif2、Motif9、Motif11、Mo-tif12、Motif13、Motif14和Motif15基序。11個INV家族成員均包含12個保守基序，分別為Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6、Motif7、Mo-tif8、Motif9、Motif10、Motif11和Motif12。同一基因家族成員間的保守基序數量和種類大致相同。

2.4 石榴SPS和INV各成員蛋白的二級結構與亞細胞定位

又表3可見，石榴SPS和INV蛋白二級結構主要由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和無規則卷曲組成，以α-螺旋和無規則卷曲占比較高；其中，Pg-SPS3及PgINV1、PgINV2、PgINV6、PgINV7、Pg-INVII各組分占比表現為無規則卷曲>α-螺旋>延伸鏈>β-轉角，其他蛋白則均表現為α-螺旋>無規則卷曲>延伸鏈>β-轉角。亞細胞定位預測表明，石榴SPS和INV家族成員均定位于葉綠體中。

染色體分布顯示，pgSPS1和PgSPS2位于Chr1，其余兩個SPS基因位于Chr2。PgINV1、PgINV6、Pg-INV10、PgINV11位于Chr1，PgINV4和PgINV5位于Chr4，PgINV7和PgINV8位于Chr6，PgINV2、PgINV3和PgINV9分別位于Chr2、Chr3和Chr7。

2.5 石榴SPS和INV基因系統進化樹分析

用4個石榴SPS蛋白、5個巨桉SPS蛋白、9個蘋果SPS蛋白和10個葡萄SPS蛋白構建系統進化樹（圖3A），可分為兩大類。PgSPS1、PgSP52和PgSPS4聚為一類，其中PgSPS1和Pg-SPS2聚為一小類。PgSPS3則與EgSPS2、MdSPS2和MsSPS2聚為一類，親緣關系較近。

11個石榴INV蛋白、9個巨桉INV蛋白、7個蘋果INV蛋白和10個葡萄INV蛋白的系統進化樹如圖3B所示，也主要分為兩大類。在第一大類中，PgINV2、PgINV7和PgINV8聚為一類，其中PgINV2與EgINV2聚為一小類，PgINV7和Pg-INV8聚為一小類：PgINV6、PgINV10和PgINV11聚為一類，其中PgINV6與EgINV5親緣關系較近，PgINV10和PgINV11緣關系較近。在第二大類中，PgINV1與EgINV4聚為一類，PgINV3與PgINV5親緣關系較近。PgINV4與PgINV9聚為一類，其中PgINV4與EgINV3、EgINV6聚為一小類，PgINV9與EgINV8親緣關系較近。

2.6 PgSPSs和PgINVs基因表達分析

本研究選用2個SPS基因（PgSPS2和PgASPS4）、6個INV基因（PgINV2、PgINV3、Pg-INV4、PgINV7、PgINV9、PgINV11），均以7月15日的表達量為1，分析其在石榴果實發育期的表達模式，結果（圖4）顯示，兩個SPS基因均下調表達，但隨著石榴果實發育進程的推進，其變化趨勢存在差異，PgSP52表現為降→升→降→升→降→升的較規律波動變化，PgSPS4則表現為降→升→降→升，均以9月15日的表達水平較高。PgINV2整體下調表達，隨著生育進程的推進呈先降低后升高的變化趨勢；PgINV3在7月30日、9月15日和10月15日上調表達，以9月15日的相對表達量最高，8月30日的相對表達量最低；PgINV4、PgINV7和PgINV9在石榴果實發育期間的表達水平較低，除PgINV7在8月15日下調表達較少外，其余時期均明顯下調表達：PgINV11的變化趨勢與PgINV3相似，但僅在9月15日明顯上調表達。

3 討論與結論

蔗糖是植物體內光合產物從“源器官”運輸到“庫器官”的主要形式，是影響產量和果實品質形成的重要因素。SPS和INV是蔗糖代謝的關鍵調控酶，影響植物生長發育過程中的生物量形成和糖分積累。本研究從石榴中鑒定出4個SPS基因，其編碼蛋白均為不穩定的酸性蛋白，與柑橘和甜櫻桃中的數量一致：鑒定出11個INV基因家族成員，均為不穩定蛋白，數量少于無籽蜜柚而多于草莓。

通過對蛋白保守結構域和保守基序分析發現，石榴SPS和INV蛋白均具有典型的保守結構域，家族成員間特征motif數量和種類大致相同，蛋白結構高度保守，這表明石榴SPS和INV基因家族在進化上具有保守性，這與蘋果和獼猴桃上的研究結果一致。其中，PgINV5和Pg-INV10具有中堿性蔗糖轉化酶典型的Glyco_hydro_100糖基水解酶結構域，等電點分別為6.30和6.53，有可能是中堿性蔗糖轉化酶，這與黑皮果蔗和南瓜中的研究結果相似。

蛋白質二級結構的預測與空間結構分析對了解其功能具有重要意義。石榴SPS和INV蛋白二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲組成，延伸鏈和β-轉角所占比例較低，說明α-螺旋和無規則卷曲在石榴SPS和INV蛋白結構中起重要作用，這與甘蔗中的研究結果相似。本研究發現，石榴SPS和INV家族成員不均勻地分布在染色體上，均定位于葉綠體中，其精確定位和調控功能還需深入研究。系統進化樹分析表明，石榴SPS和INV基因家族成員間存在不同程度的親緣關系，石榴與巨桉、蘋果的SPS基因家族成員同源性較高，與巨桉的INV基因家族成員同源性較高。這進一步證實了石榴與巨桉的親緣關系較近，為深入研究石榴SPS和INV基因家族成員的生物學功能奠定了理論基礎。

本研究進一步對2個SPS基因和6個INV基因在石榴果實不同發育時期的表達模式進行了分析，發現其在不同時期的表達量存在差異。在9月15日（果實增大期），PgSPS2和PgSPS4的相對表達量較高，PgINV3和PgINV11的相對表達量顯著高于其他時期。說明石榴SP^S和INV基因家族不同成員調控蔗糖代謝的功能具有特異性，這與甘蔗和萱草中的研究結果一致。

綜上，不同SPS和INV基因調控石榴果實蔗糖代謝的機理存在差異，具有發育時期表達特異性，后續將從轉錄調控、功能鑒定、蛋白互作等方面深入研究石榴SPS、INV基因家族成員調控蔗糖代謝的分子機理。

基金項目：棗莊學院山東省石榴精深加工工程技術研究中心／山東省石榴資源綜合開發工程實驗室開放課題（SLKF2021001）；山東省重點研發計劃項目（2022TZXD009）；山東省農業科學院農業科技創新工程項目（CXGC2023A12）；山東省農業科學院揭榜科技難題項目（SHJB2022-42）