藥品中抗生素含量檢測方法研究

歐陽蕾

（廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，廣西 梧州 530011）

抗生素是一類次級代謝產物，它是由動植物、微生物產生的具有抗病原體和活性的物質，主要的作用是干擾、抑制細菌的發育功能。將抗生素添加在藥品中能夠起到抑制細胞壁合成的作用，對細菌的細胞膜具有穿透性，起到抑菌、殺菌、消炎的效果。抗生素大多數會被使用在細菌感染的治療中，有些抗生素可以治療陰性桿菌導致的感染，還有一些抗生素含有內酰胺類物質可以對抗高端螺旋體感染。四環素就是人們常見的一種抗生素，它可以用來治療螺旋體感染，對抗其它類型的惡性腫瘤。除了人體用藥之外，家畜動物感染也經常使用抗生素，例如紅霉素、替米考星治療金黃色葡萄球菌引起的各項感染病癥，又比如利用林可酰胺類抗生素可以治療壞死性腸炎和奶牛急性乳腺炎，這充分說明了藥物中抗生素的存在是不可避免的，然而抗生素的耐藥性問題終究還是爆發了出來，如果不加以控制將會影響公共健康，這里的控制不是禁止抗生素添加，而是要用科學的手段檢測抗生素的含量。

1 微生物檢測法

微生物檢測法指的是查看抗生素對微生物的生長和發育是否具有明顯的抑制作用，以此為依據來計算抗生素的活性，常用的方式和手段包括管碟法和比濁法兩種。采用微生物檢測法靈活性較高，靈敏度也較強，能夠直接顯示該項抗生素是否具有抗菌能力，因此這種方法被廣泛地使用在多種抗生素類藥物的檢測中。

1.1 管碟法

目前國際上較為常用的方式是管碟法，管碟法能夠對抗生素的效價展開有效測定，使用管碟法需要依靠瓊脂作為介質，查看抗生素的擴散作用。抗生素在瓊脂之中放置可以形成抑菌圈，計算抑菌圈的大小可以推算出生物活性以及其前后變化情況。目前管碟法在各個國家的抗生素微生物檢測中都得到了廣泛的使用并取得不錯的效果，采用管碟法時要觀察抗生素在培養皿的擴散情況[1]。一般而言，抗生素濃度由上到下會形成自然弧度和梯度，中心濃度較高，邊緣濃度較小，如果抗生素濃度已經大于最低抑制濃度，就說明樣本中的細菌已經被有效抑制，從而不能有效繁殖，說明抗生素有效，從肉眼上可以看到透明的抑菌圈。要根據擴散定律計算抗生素總量和抑菌圈直徑之間的關系，經過實踐可以發現二者之間呈現出線性關系，工作人員可以根據此項現象來計算抗生素的生物活性。我國藥典所收錄的抗生素檢測方法大多數是高效液相色譜法，其次就是微生物檢測方式，適合用微生物方式做出檢測的包括青霉素、紅霉素、氨基糖苷類抗生素，還包括卡納霉素鹽酸、大觀霉素，也包括四環素類抗生素例如土霉素。和中國藥典相比，歐盟和美國藥典采用管碟法的案例數量較多，例如在檢測大觀霉素、酒石酸泰樂菌素的時候，采用管碟法都可以有效地測試微生物含量。

除了在常規藥品中檢測抗生素含量之外，使用管碟法可以檢測飼料添加劑是否存在非法添加物，也可以檢測非法添加物質中是否含有禁用抗生素。例如，在獸藥散劑中使用管碟法展開抗生素檢測就可以查出卡納霉素生物以及其中間產物。使用管碟法的時候也可以檢測物質生物活性，測試重組蛋白是否具有生物化學活性，從而計算重組蛋白是否能有效抑制大腸桿菌的生長。有學者發現，管碟法還可以測試乳酸菌菌株對抗生素的藥物是否具有耐藥性和抵抗性，這種方法適合用來檢測組分程度較為復雜的發酵類藥物，這是它的優勢和特別之處，采用高效液相色譜法等其它方式不能完全替代。在使用管碟法的時候有一定的技術要求，工作人員需要具備較強的專業理論知識和操作經驗，同時它的操作步驟相對較為復雜，容易受到外界環境因素的不良干擾。相對于管碟法而言，使用高效液相色譜法并不存在這些問題，有一些藥物的抗生素含量測定可以采用高效液相色譜法來替代。目前在測定乳糖酸紅霉素的時候，官方建議的方式就是高效液相色譜法，在檢測的過程中會更加方便，也可以用該方法來測量分拉霉素的含量。和傳統的微生物抗生素檢測方式相比，后者在檢測時精密程度較好并且方便快捷。但必須認識到的是，雖然微生物檢測方式容易受到環境的影響，產生一定的誤差，但是將它用來測試多組分抗生素擁有其它方法不可替代的優勢，因此這種方式依然是主要的檢測手段，在未來一段時間內還會被廣泛推廣。

1.2 比濁法

比濁法也是常用的微生物檢測手段之一，它可以在液體培養基中查看抗生素是否對細菌有生長抑制作用，其主要的工作思路是測試培養細菌的培養皿濁度值大小，從而和對照組產生比較。因此，比濁法也是對抗生素有效定效定價的一種方式，這種方式特別適合懸濁液的檢測[2]。和管碟法檢測相比，比濁法不對環境做太高的要求，也不要求檢測器具和儀器具備過高的靈敏程度。有些學者利用比濁法檢測了藥品乳劑中夫西地酸的含量并通過了科學驗證，采用比濁法可以檢測對象的吸光度和濃度，并支持展開重復實驗，這種方式的精密程度和平均回收率都較好，因此可以大大提高檢測數據的準確度。比濁法還可以成功地檢測泰樂菌素的含量并計算線性關系，如果要用比濁法進行微生物的檢測，其必要條件是確保試驗菌穩定性較強，因此這一過程中對微生物數量的控制非常關鍵。將其用于抗生素含量檢測中耗時較短，在某種程度上可以替代傳統的擴散檢測法，該項檢測技術不使用有機溶劑，減少了化學污染產生的概率和可能性，但是這種方法在實際過程中不常使用，主要是由于樣品含有雜質，容易滋生細菌，不適合有色渾濁液的樣品檢測，并且比濁法試管需要具有較高的透明度，培養基要求較為清澈，若完全滿足以上要求會導致成本提升。

2 高效液相色譜法

高效液相色譜法的英文簡稱是HPLC，它是柱色譜的常用形式之一，將其運用在藥品檢測中可以有效測定抗生素含量，這種方式可以在高壓狀態下檢測樣品混合物，將其輸入色譜柱固定相之中計算吸附和分配系數的差異，達到不同介質分離的效果，再利用兩種色譜柱的相對移動進行元素交換，從而達到不同物質分離的效果。高效液相色譜法可以運用在各種類型的化工產業和醫藥產業中，除了藥品含量檢測還可以被醫學和化學藥品行業所采納[3]。我國藥典收錄了將近兩百種高效液相色譜法的測定方式，占整體測試方式的73%左右，在測試氨基糖苷類抗生素的時候這一方法特別適用，比如檢測鹽酸大觀霉素和硫酸依替米星試劑的時候就可以經常使用，也可以用高效液相色譜法檢測酰胺醇類抗生素，比如琥珀氯霉素和鹽酸林可霉素。可以用該項方法作為檢測手段的還包括四環素類藥物，例如抗生素、鹽酸土霉素、鹽酸多西環素[4]。除了人體用藥之外，獸藥質量標準相關文件也規定了高效液相色譜法可以檢測的范圍，占整體獸藥檢測技術的36%，比如在檢測大環內酯類抗生素的時候就可以用來測試酒石酸泰萬菌素的抗生素含量，經常使用的大環內酯類抗生素包括硫酸卡那霉素、泰樂菌素以及相關衍生物，還可以用來檢測阿莫西林、苯唑西林和普魯卡因青霉素等藥劑。相對于其他的檢測方式，高效液相色譜法在檢測抗生素含量時操作更加方便，對環境要求不高，成本較低，因此適用范圍較大。利用高效液相色譜法發展的反向分支可以用來檢測頭孢洛林濃度，計算其相關系數，這種方法經過驗證適合用在原料藥的檢測中。有些學者利用高效液相色譜法檢測萬古霉素的樣品抗生素含量并成功地將其運用在醫藥領域，為人體健康服務。還有一些學者設置了LiChroCARTRP-18 色譜柱，測定了硫酸頭孢喹酮的濃度含量，高效液相色譜法展開抗生素含量的測定具有較強的重復性能，尤其是對頭孢類藥物的抗生素含量檢測可以通過數據的反復比對建立驗證模型。

3 可見分光光度法

可見分光光度法也叫紫外UV 方法，在波長800m以內可以檢測待測樣本的吸光度，這種方式經常用于物質鑒別和雜質的測定，當光束穿透待測溶液和待測樣本的時候，物質的吸光程度會隨著波長的變化而發生改變，可見分光光度方法可以用在定量測量上檢測溶劑吸光程度，再和對照組的吸光度進行比較，用科學的系數計算法查看樣品溶液濃度[5]。我國藥典收錄了諸多可見分光光度法檢測抗生素含量的先例，從而將此方法確定為官方檢測手段之一。常見的包括放線菌素和注射用放線菌素，還可以用此方式來檢測酰胺醇類抗生素，例如琥珀氯霉素及其衍生物，這種方法在使用時需要借助恩諾沙星可溶性粉，它的運用方便各種藥物品質的檢測，操作方式較為便捷，并且可以有效測定抗生素含量百分比。相對于經常使用的高效液相色譜方式，可見分光光度法不需要使用昂貴的儀器，經濟性較好，性價比較高，這種方式可以運用在常規藥品的抗生素檢測中，比如在350nm 以下的波長范圍中可以檢測吸光度小于270nm 的藥品，相關系數可以設置為0.9996，回收率較好，超過100%。通過紫外方法可以檢測恩諾沙星納米乳的線性范圍和平均回收率，從而計算出抗生素含量。利用紫外法也可以測試其他霉素預混劑的含量大小。以上這些成功的運用案例都是可見分光光度法的成功表現，和微生物檢測方法相比較，這種方式較為簡單快捷，不會對環境產生過高的要求。還有一些學者利用紫外方法測試了克拉霉素含量和大觀霉素含量，它在操作時相對較為簡便，因此具有良好的推廣價值，但是其缺點也是顯著的，那就是紫外線會受到吸光度的影響而發生波動，導致待測樣本發生不平行的問題，相近波長不能彼此區分，重復性也不好。在未來隨著技術改進，這項技術可以和高效液相色譜法綜合使用。

4 毛細管電泳法

毛細管電泳法是除了管碟法、可見分光光度法和高效液相色譜法之外的又一大方法，它的工作原理是把彈性石英毛細管作為分離通道，用高壓電流作為驅動，對待測樣本藥品的分配行為差異展開檢測和分離。目前常用的頭孢菌素抗生素含量的檢測已經有了多種和毛細管電泳法相關的檢測手段，這些檢測手段并用可以同時進行多種抗生素含量的分析，使用毛細管電泳方法和高效液相色譜法一樣，其效率都較高，分離能力較強，但是毛細管電泳方法相對于前者不會消耗大量的試劑，但是這種方法也有一點缺陷，那就是不太靈敏，因此在未來還要對毛細管電泳法展開技術革新與拔高。隨著現代科技的手段發展，更多的新方法將被用于抗生素含量的測定。比如有些學者采用干燥綠植片作為工具，對傳統的微生物檢測方式展開替代，檢測了恩拉菌素預混劑中有效成分的含量，這項技術在使用時相對較為簡單，也可以重復實驗，最大限度地避免了微生物檢測法容易出現的外界干擾因素，大量樣品也可以同時檢測，不需等待。還有些學者利用催化劑例如金納米顆粒檢測了卡納霉素的含量，TMB 物質可以氧化于過氧化氫，產生吸光度較強的藍色物質，在加入一定的試劑之后，檸檬酸可以催化過氧化氫的反應，從而快速靈敏的測量微生物的含量。更關鍵的是，檢測抗生素含量的方式和手段也可以用來臨床使用，為醫生提供新的治療工具，在治療后有利于患者的康復和保健。并且學者發現，大觀霉素利用中性介質可以產生更多的衍生物，從而補充了傳統的光譜測定方式，建設了熒光法。熒光法的測試又是一大進步，目前在藥物監測系統和抗生素含量檢測中都發揮了不錯的作用。

5 結語

抗生素檢測對藥品的療效有著非常重要的作用，檢測藥品中的抗生素含量可以采用多元化的檢測方法，這些抗生素的檢測方法各有自身的特點，并且都能滿足不同藥品中抗生素的檢測要求，藥品檢測中常見的抗生素的檢測方法有：微生物檢測法、高效液相色譜法、可見分光光度法，不同的檢測方法也有不同的工具和分支，有關工作人員要酌情選擇，以提高抗生素含量檢測的準確性。在未來更應加大研發力度，研制出更加高效、便捷、精準且經濟的抗生素檢測方法。