蒙古冰草脫水素基因生物信息學識別及表達分析

關鍵詞：蒙古冰草;脫水素基因;生物信息學分析;干旱脅迫

蒙古冰草（Agropyronmongolicum Keng）屬于典型的冰草屬寒旱生、二倍體（2n=2x=14，PP）多年生禾草，多分布于中國西北部地區，在沙土、干燥草原地帶均可生長[1]，表現出較強的耐旱特性，具有分蘗多、耐風沙、耐土地瘠薄的優點，且具有作物遺傳改良的優異抗旱基因資源[2-3]，還富含極高的飼用價值[4]。

植物生長發育過程中經常遭受各種生物脅迫以及非生物脅迫，導致作物產量顯著受損，為了應對這些傷害，植物進化出了抵御不良環境的機制。1988年科學家第一次在干旱條件下的作物大麥和玉米中發現植物脫水誘導蛋白[5]。隨后，這個蛋白被命名為脫水蛋白，且被確定為植物耐干旱的生物學遺傳基礎。研究表明，脫水素（Dehydrin，DHN）有效參與植物的脅迫應答過程，在植物遭受鹽、低溫或是干旱等非生物脅迫后期會大量積累并表達，還可以對細胞膜結構和蛋白結構起到保護和抗逆的作用[6]，協助植物克服逆境脅迫[7]。脫水素是一種高度親水蛋白，廣泛存在于植物中，屬于胚胎發育晚期豐富蛋白LEAⅡ家族成員，相對分子質量在9～200kD之間。脫水素蛋白一級結構穩定，保守性強，具有3個高度保守片段，即K，Y和S段[8]，根據植物中脫水素蛋白各個片段所含數量及種類的差異，將脫水素家族分為YnSKn，YnKn，SKn，KnS，Kn 五類。這五大類中，YnSKn 是最為常見的一種，通常這類蛋白包含3個或3個以下的Y保守片段和若干個K段，這類脫水素蛋白是堿性或中性脫水素;YnKn 型脫水素包含Y段和K段，且二者所含數量在3以下，此類脫水素蛋白是典型的酸性脫水素;SKn，KnS多數屬于酸性脫水素，二者都包含1個S片段和1～3個K片段;多數Kn 型脫水素包含2～9個K片段，屬于中性或酸性蛋白[9]。脫水素蛋白具有非常高的親水性[10]以及熱穩定性[11]，能夠將水分子捕捉并鎖在植物體內，從而保護植物體細胞免受干旱的損傷[12-13]。已有研究證明當植物遭受干旱、低溫、鹽等非生物脅迫時，植物體內的脫水素基因表達量顯著上調[14-15]。

關于脫水素的功能探究發現，白刺花（Sophoradavidii （Franch.）Skeels）葉片和根中SdDHN 基因在干旱脅迫下顯著上調表達，復水后則表達水平恢復正常[16]。狗牙根‘C299’品種中DHNS 基因在離體狀態下導入E.coli 表現出明顯的耐鹽性和耐酸堿性;轉基因研究證實，DHNS 提高了擬南芥（Arabidopsisthaliana）對干旱、鹽脅迫、高滲脅迫和酸堿環境的耐受能力[17]。甘薯（IpomoeabatatasLam.）中IbDHN1 基因qRT-PCR 分析顯示，Ib-DHN1 的表達受干旱和鹽脅迫處理的顯著誘導[18]。這些結果均表明，DHN 蛋白在非生物脅迫中發揮重要作用。本研究以蒙古冰草為研究材料，基于轉錄組測序數據篩選DHN 基因，對其進行生物信息學及表達模式分析，為進一步研究蒙古冰草脫水素基因在干旱脅迫響應中的功能和作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

蒙古冰草種子采自內蒙古農業大學薩拉齊牧草繁種基地。挑選顆粒飽滿的種子萌發，于室內培養箱（BIC-300）水培[溫度為（24±1）℃、光/暗周期為16/8h]。在三葉一心期，用含25%的PEG-6000的1/5Hoagland’s營養液進行模擬干旱處理，未干旱處理的蒙古冰草設為對照（CK），分別在干旱處理12h，24h，48h，3d，5d，7d及復水24h取樣，每處理3次重復。委托杭州聯川生物技術股份有限公司進行轉錄組測序（數據登錄號為PRJNA742257）[19]。

1.2 蒙古冰草脫水素基因的篩選及結構域鑒定

從干旱脅迫下蒙古冰草轉錄組測序數據中，根據功能注釋初步篩選出11個脫水素基因，利用notepad++軟件找到對應的核苷酸序列，用NCBI中的ORFfinder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）在線軟件對基因的開放閱讀框（OpenReadingFrame，ORF）進行選擇，然后用Pfam（https：//www.pfam.xfam.org/），CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在線軟件進行結構域預測鑒定，并使用TBtools可視化脫水素蛋白結構域。

1.3 蒙古冰草脫水素基因保守基序分析及序列比對

使用在線軟件TheMEMESuite中的MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）對篩選出的蒙古冰草脫水素基因的保守基序進行預測，基序參數設定為最大值20;使用DNAMAN 軟件進行多序列比對。

1.4 蒙古冰草脫水素蛋白的理化性質分析及亞細胞定位預測

用ExpasyProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件對DHN 蛋白的氨基酸數目、等電點、分子量、總平均親水性等理化性質進行分析;利用WOLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）在線軟件對脫水素蛋白進行亞細胞定位預測。

1.5 蒙古冰草脫水素基因進化分析

將篩選出的6個蒙古冰草脫水素基因與12個已報道具有耐旱、耐低溫、耐鹽脅迫等功能的脫水素基因（表1）構建系統發育進化樹。使用MEGA11.0軟件，采用鄰位算法（Neighbor-Joining method），1000次Bootstrap測試，其他參數設置為默認值，后使用evolview在線軟件（https：//evolgenius.info//evolview-v2/#login）進行美化。

1.6 蒙古冰草脫水素蛋白不同干旱處理下的表達分析

蒙古冰草轉錄組數據使用TPM（TranscriptsPer Kilobaseofexonmodelper Million mappedreads）對樣本表達量進行歸一化處理。

用SnapGene3.03對篩選出來的蒙古冰草抗旱相關基因的特異性引物進行設計，U6為內參基因（引物序列見表2），委托生工（Sangon，上海）合成序列。

使用TRNzol試劑（TIANGEN，北京）提取蒙古冰草CK和干旱處理1d，3d，5d，7d及復水24h的總RNA，用FastQuantRT Kit（withgDNase）試劑盒將蒙古冰草試驗組及對照組的TotalRNA 反轉錄成cDNA，使用MomAmpSYBR GreenqPCRMix試劑盒（MQ10201S）進行qRT-PCR試驗，每個試驗處理4次生物學重復。qRT-PCR 試驗總反應體系為20.0μL，其中上下游引物（10μmol·L-1）各0.4μL，cDNA 模板1.2μL，Nuclease-FreeH2O8μL，MomAmpSYBR GreenqPCR Mix 試劑10μL。反應程序為預變性95℃30s，變性95℃10s，退火61℃10s，延伸72℃ 30s，循環次數為30次，在FTC-3000P上運行程序。采用2-ΔΔCT 法[32]計算基因的相對表達量，并通過SPSS26.0軟件進行表達量差異顯著分析。

2 結果與分析

2.1 蒙古冰草脫水素蛋白家族的鑒定分析

從轉錄組數據庫根據功能注釋挑選出11個基因，Pfam網站輸入11個基因的ORF序列后預測6個基因具有DHN 保守結構域（PF00257）;CDD網站輸入6個基因的ORF序列后預測6個基因均具有DHN保守結構域，其中2個基因具有Dehydrinsu-perfamily結構域，分別是TRINITY_DN27921_c1_g1，TRINITY_DN14936_c0_g6，最終確定6個基因含有脫水素保守結構域;將CDD網站蛋白結構域預測結果下載后，使用TBtools將其可視化（圖1）。

2.2 蒙古冰草脫水素基因的保守基序及序列比對分析

對6個蒙古冰草脫水素基因的ORF進行保守序列對比，并對每個亞族保守區進行分析（圖2）。結果發現，蒙古冰草脫水素基因家族整體高度保守性，所有成員均包含K 保守序列區，TRINITY _DN18948_c1 _g4，TRINITY _DN18948 _c1 _g1，TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN19347_c0_g7 包含1個S序列區（表3）。

蒙古冰草DHN 蛋白保守基序分析發現3種motif（圖3，圖4），motif1和motif2對應K 片段保守區域（EKKGIMDKIKEKPLG），歸為一類，推測是基因內結構域擴增形成的，6個基因均具有兩個富K結構域，分別是motif1和motif2，而motif3對應S片段保守區域（4～10個絲氨酸殘基組成）。6個基因根據有無S結構域可歸屬于兩大類：TRINITY_DN18948_c1_g4，TRINITY_DN18948_c1_g1，TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN19347_c0_g7 這4個具有S結構域的為一類;TRINITY _DN23361 _c0 _g4 和TRINITY _DN27921_c1_g1 這2個不具有S結構域的為一類。

2.3 脫水基因蛋白序列的理化性質及亞細胞定位分析

6個脫水素蛋白氨基酸數目在81～275個氨基酸殘基之間，TRINITY_DN23361_c0_g4 的氨基酸數目最少，為81個氨基酸殘基，TRINITY_DN18948_c1_g4 的最多，為275個氨基酸殘基;分子量在8283.39 Da～2 7476.48 Da 之間，其中TRINITY _DN23361_c0 _g4 的分子量最小，而TRINITY _DN14936_c0_g6 的分子量最大;6個脫水素基因的等電點在5.14～10.00之間，除TRINITY_DN14936_c0_g6，TRINITY_DN19347_c0_g7 外，其余4個脫水素蛋白均為堿性蛋白質;6個脫水素蛋白均為親水性蛋白，均定位于細胞核（表3），初步推測蒙古冰草脫水素蛋白在細胞核中發揮作用。

2.4 蒙古冰草脫水素基因的進化關系分析

將蒙古冰草脫水素基因與12個其他物種具有耐低溫、耐旱、耐鹽脅迫等功能的脫水素基因構建進化樹，結果將進化樹分為3個大類，其中第2類不含有蒙古冰草脫水素基因。第1大類包含2個蒙古冰草脫水素基因，分別是TRINITY_DN14936_c0_g6和TRINITY _DN19347 _c0 _g7，TRINITY _DN14936 _c0 _ g6 與擬南芥KJ000690.1（SpDHN1）聚在一個小分支上，它們的相似度為100%，SpDHN1 在擬南芥植株中過表達能夠增強轉基因植株的抗旱能力[21]，TRINITY_DN19347_c0_g7 與杜鵑CV015064（RcDhn5）聚在一個小分支上，它們的相似度為100%，RcDhn5 的過表達能夠增強擬南芥的的冷凍耐受性[29];第3類中含有4個蒙古冰草脫水素基因，TRINITY_DN23361_c0_g4和TRINITY _DN27921 _c1 _g1 聚在1 個小分支上，TRINITY _DN18948 _c1 _g4 和TRINITY _DN18948_c1_g1 聚在一個分支上，有較近進化關系，TRINITY_DN18948_c1_g4 和小麥OK094572（WDHN2）聚在一個小分支上，相似度為100%，WDHN2 受干旱、高鹽、低溫和脫落酸誘導表達[25]。SpDHN1 和WDHN2 已被證明與干旱脅迫相關，根據MEGA 分類和各類成員基因功能，推測蒙古冰草TRINITY_DN14936_c0_g6 和TRINITY _DN18948_c1_g4 也具有相似功能，參與干旱脅迫響應（圖5）。

2.5 蒙古冰草脫水素蛋白不同干旱處理下的表達水平分析

在干旱處理24h，3d，5d，7d，復水24h及對照（CK）下，對篩選出的與抗旱相關的蒙古冰草6個脫水素基因進行表達模式分析，6個DNH 基因對干旱脅迫響應程度各不相同，結果如圖6所示。轉錄組數據表明，6個蒙古冰草抗旱相關基因在25%PEG-6000處理期間表達量均高于CK，6個基因的表達量總體隨脅迫時間延長呈上升趨勢，DN18948_c1_g4 呈一直上升的趨勢，DN14936_c0_g6，DN18948 _c1 _g1，DN23361 _c0 _g4 和DN27921_c1_g1 的表達趨勢為先上升后下降再上升，DN19347_c0_g7 基因的表達趨勢為先上升后下降再上升又下降;DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1 和DN27921_c1_g1 這4個基因在復水24h表達量最高，DN23361_c0_g4在5d表達量最高，DN19347_c0_g7 在1d表達量最高。qRT-PCR 結果分析表明，6個脫水素基因均呈上調表達趨勢，DN18948_c1_g4，DN27921_c1_g1 和DN23361_c0_g4 這3個基因在3d表達量最高，DN19347 _c0 _g7 在5d 表達量最高，DN18948_c1_g1 和DN14936_c0_g6 這2個基因在復水24h 表達量最高;DN18948 _c1 _g1 和DN14936_c0_g6 的復水24h處理組與CK相比表達量差異顯著，DN18948_c1_g4 和DN27921_c1_g1 的3d處理組與CK 相比表達量差異顯著，DN23361_c0_g4 的3d，5d，7d和復水24h處理組與CK相比表達量差異顯著，其余處理組表達量與CK 的表達量相比差異不顯著，DN19347_c0_g7 表達趨勢為上調表達，然而處理組與CK 相比表達量差異不顯著，說明蒙古冰草DHN 參與蒙古冰草對干旱脅迫的響應。

3 討論

脫水素基因的表達調控機制相當復雜，徐學中等[33]發現脫水素的生物學功能與植物內源激素ABA 息息相關，植物遭受鹽、低溫或是干旱等非生物脅迫的情形下，植物體內ABA 的激素含量顯著增加[33]。

為篩選與蒙古冰草抗旱相關的DHN 蛋白，本研究基于轉錄組測序數據篩選出6 個蒙古冰草DHN 家族成員，其中2個具有Dehydrinsuperfam-ily結構域，4個具有Dehydrin結構域。生物信息學分析發現6個蒙古冰草DHN 蛋白都屬于親水性蛋白，與小麥、番木瓜（Carica papaya L.）、甘薯等[18，27，34]對DHN 蛋白親疏水性的研究結果一致，有較強的水合能力。亞細胞定位預測發現，蒙古冰草DHN 蛋白定位于細胞核，說明蛋白在細胞核中發揮作用。在蒙古冰草DHN 蛋白保守基序分析中，共出現了3種motif，motif1和motif2對應脫水素蛋白的K 保守片段（EKKGIMDKIKEKPLG），motif3對應脫水素蛋白的S保守片段（4～10個絲氨酸殘基組成的片段），與馮闖、張紅梅和趙陽[9，27，35]對DHN 蛋白的保守基序研究結果相似。大量研究表明，脫水素蛋白在植物生長發育時面臨非生物脅迫起正調控作用，例如WDHN2[27]，DHN5[22]，SpDHN1[23]等。將6 個DHN 蛋白和已知具有耐旱、耐寒和耐鹽脅迫等功能的12 個DHN 蛋白構建進化樹分析，小麥WDHN2[27]qPCR分析表明，WDHN2 基因受干旱、高鹽、低溫和脫落酸誘導表達，構建原核表達載體并轉化大腸桿菌感受態細胞，重組菌的抗性實驗表明，WDHN2蛋白可以增強大腸桿菌對滲透脅迫、高鹽等非生物脅迫的抗性。將苜蓿MtCAS31 轉入到擬南芥中，Mt-CAS31 過表達顯著降低了轉基因擬南芥的氣孔密度，顯著增強其耐旱性[25]。擬南芥植物中Sp-DHN1 的異位表達和野生型相比表現出更好的抗旱脅迫能力[23]。趙陽等對玉米的幼苗進行鹽和干旱脅迫處理下的表達模式分析，發現5個基因均表現出不同程度的響應，其中ZmDHN1，ZmDHN3，ZmDHN4 和ZmDHN5 出現大幅度的上調表達[35]。這些均證明脫水素基因與干旱脅迫響應有關，且與蒙古冰草有較高的同源性，進而推測TRINITY _DN14936 _c0 _g6 和TRINITY _DN18948_c1_g4 也具有相似功能，可能參與干旱脅迫響應。

另外，AhDHN1 在花生的葉片中對干旱脅迫起正調控作用[36]，張紅梅等對小麥WDHN2 進行qPCR擴增，表明WDHN2 在干旱脅迫下誘導表達，基因表達量存在先上升后下降的表達趨勢[27]，小麥WZY1-2蛋白的表達量隨著干旱程度增加而升高[37]，扁穗冰草Acwcs120，Acwzy2 對干旱脅迫均有響應[38]。本研究中，轉錄組測序和qRT-PCR分析均表明6個基因的表達量總體隨干旱脅迫時間延長呈上升趨勢，與前人研究結果相似，推測6個蒙古冰草脫水素基因在干旱脅迫調控網絡中具有關鍵作用。qRT-PCR 結果分析顯示，DN18948_c1_g1和DN14936_c0_g6 的復水24h處理組、DN18948_c1_g4 和DN27921_c1_g1 的3d處理組、DN23361_c0_g4 的3d，5d，7d和復水24h處理組與CK組相比表達量差異顯著，DN19347_c0_g7的處理組與CK 組相比表達量差異不顯著。以上研究表明，脫水素蛋白在植物干旱脅迫過程中具有多樣的響應模式，而且脫水素蛋白功能呈現多樣性。

綜上，本研究初步證明蒙古冰草脫水素基因受干旱脅迫誘導表達，可能參與蒙古冰草對干旱脅迫的調控過程。下一步的工作是通過轉基因的手段將脫水素基因轉入蒙古冰草和擬南芥中，進一步探究蒙古冰草脫水素基因的抗旱機制。

4 結論

本研究基于蒙古冰草轉錄組測序數據篩選得到6個參與逆境脅迫的脫水素基因，亞細胞定位預測均位于細胞核;干旱誘導脅迫下DN19347_c0_g7基因呈下調表達，起負調控作用;DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1，DN27921_c1_g1 和DN23361_c0_g4 在干旱誘導脅迫下呈上調表達，起正調控作用。