苧麻CCCH基因家族生物信息學及表達譜分析

關鍵詞：苧麻;CCCH;基因家族;表達模式

鋅指蛋白（Zinc-fingerprotein）是一類具有序列特異性的轉錄因子，通常含有不同數目的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基，因其可以結合Zn2+ 來穩定一種很短的，可自我折疊形成“手指”結構的一類蛋白質而得名[1]。鋅指結構CCCH 基因作為各種生物體中廣泛存在的調節因子，通過與DNA、RNA 或蛋白質相互作用，在植物發育和應激反應中發揮作用[2]。鋅指蛋白根據保守的Cys和His殘基的數量和位置，可分為C2H2、C8、C6、C3HC4、C2HC5、C4、C4HC3和CCCH。CCCH 鋅指蛋白一般含有1個或多個鋅指基序，3個Cys和1個His殘基是該基序最重要的組成部分。CCCH 基序的共有序列可定義為C-X4-15-C-X4-6C-X3-4-H（其中X代表任意氨基酸，數字表示氨基酸的數目，C代表Cys，H 代表His）[3]。

鋅指蛋白在植物不同的發育階段、不同的組織具有多種不同的功能。CCCH 鋅指蛋白可參與植物的發育、適應、激素調節以及生理逆境相關過程的調控，尤其是對生物和非生物脅迫的響應[4]。目前，CCCH基因家族在擬南芥、大豆、水稻、小麥、矮牽牛和棉花等多種植物中有詳細的報道[5-8]。ABA 和鹽脅迫可以透過誘導擬南芥CCCH 鋅指蛋白AtTZF1，At-TZF2 和AtTZF3 的表達來增強植株對干旱、氧和鹽脅迫的耐受性[9]。煙草CCCH 類鋅指蛋白家族基因可以響應干旱和激素脅迫，NtC3H-39 基因對干旱和激素脅迫應答顯著[10]。小麥TaZFP5 基因可能參與了種子萌發過程中對高鹽、干旱和高溫脅迫的應答[11]。芝麻SiC3H1 基因也參與了芝麻對滲透、高鹽、低溫、高溫和淹水5種逆境脅迫的響應[12]。大豆串聯CCCH 鋅指蛋白GmZF351 基因受組蛋白去甲基化酶GmJMJ30-1和GmJMJ30-2調控，當大豆遭遇環境脅迫時，GmZF351基因在根和葉中被“打開”，參與耐逆應答，提高大豆抗逆能力[13]。

苧麻（Boehmerianivea L.）是蕁麻科苧麻屬多年生韌皮纖維植物，在中國、印度、東南亞、環太平洋地區廣泛種植[14]。苧麻因其生物量高、生長速度快、非糧經濟作物的地位，被認為是我國南方鎘污染土壤植物修復的潛在資源[15]。CCCH 基因家族受鎘脅迫的相關報道較少，苧麻CCCH 基因家族鎘脅迫領域的研究更是罕見。苧麻雖然是一種耐鎘且高富集鎘的植物，但鎘脅迫苧麻分子調控機理方面的研究還不全面。因此，基于基因組數據和轉錄組數據，我們對CCCH 基因家族進行了全面的生物信息學分析，這將有助于進一步研究CCCH 家族成員調控鎘脅迫的機制，為理解CCCH 家族的分子機制及該家族在逆境脅迫和調控鎘富集能力方面有重要意義。

1 材料與方法

1.1 苧麻CCCH 基因家族的提取與鑒定

為識別苧麻基因組的BniCCCH 基因，在植物轉錄因子數據庫TFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/family.php？ fam=CCCH）網站上下載了全部擬南芥、水稻和棉花的CCCH 基因的氨基酸序列，并以之為模板，利用blastp搜索苧麻的全基因組數據庫（PRJNA663425），設定e-value值為1e-20。將得到的苧麻BniCCCH 候選基因提交到pfam 數據庫及NCBI的保守域數據庫（CDD）用于確定每條序列是否包含保守結構域。

1.2 苧麻CCCH 基因家族基本理化性質分析

對預測的BniCCCH 基因序列進行基本理化性質預測分析。所有預測基因長度，編碼序列和預測長度的蛋白質計算在NCBI數據庫（http：//www.ncbi.hlm.nih.gov）完成。蛋白質理論分子量和理論等電點（PI）通過計算PI/MW 進行預測（http：//au.expasy.org/tools）。通過http：//www.psort.org/網站鑒定CCCH 蛋白質完整氨基酸序列中的亞細胞位置。

1.3 苧麻CCCH 基因家族系統發育分析

苧麻的所有CCCH 蛋白質序列以及擬南芥的CCCH 蛋白質序列均通過MEGA7.0軟件的CluatalW功能進行多序列比對。系統進化樹采用IQtree軟件計算，使用最大似然法（ML）方法生成，有10000個引導復制。Figtree軟件用于繪制苧麻和擬南芥基因組中CCCH 蛋白的系統發育樹及美化。

1.4 苧麻CCCH 基因家族的基因結構和保守結構域分析

將預測的CCCH 基因的氨基酸序列提交到MEME網站進行保守氨基酸序列分析，設定motifs數為10，其他參數使用默認參數，輸出結果使用TBtools繪圖。獲取苧麻CCCH 基因的全長DNA序列和cDNA 序列，以及基因組注釋文件GFF3文件，利用GSDS分析和展示內含子和外顯子的位置。

1.5 苧麻CCCH 基因家族染色體定位分析

在苧麻基因組數據庫中搜索全部苧麻CCCH家族基因的起始位點和終止位點，利用MapChart軟件根據基因在染色體上的相對位置來完成這些基因的染色體定位。

1.6 苧麻CCCH 基因家族內部共線性分析

將苧麻基因組上的全部基因的氨基酸序列建立blastp（蛋白質比對）數據庫，然后利用blast程序進行自比對，設定e值為le-10，每個基因5個比對結果，找尋基因組內最相似的序列。然后將比對結果利用MXScanX軟件進行苧麻的染色體共線性分析。

1.7 苧麻CCCH基因家族啟動子順式作用元件預測

將苧麻CCCH 轉錄因子上游2000bp的基因序列提交到PlantCARE 網站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行啟動子順式作用元件預測，最后結果用TBtools軟件進行可視化。

1.8 苧麻CCCH 基因表達模式分析

本研究以“湘苧三號”為材料，采用盆栽栽培技術，以添加25mg·L-1鎘為脅迫條件。在頭麻時期葉面噴施50mg·mL-1乙烯利（ethephon，ETH）、0.2%磷酸二氫鉀（KH2PO4）及50mg·mL-1乙烯利和0.2%磷酸二氫鉀復配液（ETH+KH2PO4），以水（H2O）做對照（CK），藥劑噴施48小時后取苧麻幼嫩葉片進行轉錄組測序，進行差異基因表達分析。采用FPKM 值表示BniCCCH 的表達水平。所有FPKM 值均使用log2（FPKM+1）進行歸一化，并將所得數據用于使用TBtools構建熱圖。

2 結果與分析

2.1 苧麻CCCH 基因鑒定與基本理化性質分析

從苧麻基因組中鑒定了59個CCCH 基因，并獲得了這些基因的DNA 序列、CDS序列和氨基酸序列。將苧麻CCCH 基因根據與擬南芥的同源關系和在苧麻染色體上的相對位置信息以及利用BlastP比對到SwissProt數據庫的結果進行了重新命名，后續對這些基因進行了序列分析（表1）。苧麻CCCH 基因家族成員的理化性質差異很大，氨基酸組成和氨基酸的數量顯著不同，其家族成員作用位點或功能靶基因有較大差異。苧麻CCCH 基因家族成員的ORF長度范圍為654～12978bp。所有苧麻CCCH 成員的蛋白質包含217～4325個氨基酸。分子量大小范圍從22.56kD到475.59kD，18.64%的苧麻CCCH 基因分子量大于100kD，等電點分析表明59.32%的CCCH 蛋白質為堿性蛋白，40.68%為酸性蛋白。苧麻CCCH motif數量最多5個，最少為0個，有69.49%的基因含有1個motif（26個）或2個motif（16個）。亞細胞定位預測發現，23個苧麻CCCH 基因定位在細胞核中，占比38.99%;18個苧麻CCCH 定位在細胞質中，占比30.51%;其他苧麻CCCH 基因定位于微體，線粒體膜、高爾基體、胞外等區域。

2.2 苧麻和擬南芥CCCH 基因的系統發育分析

為揭示苧麻和擬南芥CCCH 基因之間的進化關系，采用最大似然法構建蛋白序列的系統發育樹（圖1），發現CCCH 家族成員分為Clade-I和Clade-II。Clade-I包含30個擬南芥基因和28個苧麻基因，Clade-II包含36個擬南芥基因和31個苧麻基因。苧麻和擬南芥CCCH 家族一半以上成員在Clade-II中。

2.3 苧麻CCCH 基因保守結構域與基因結構分析

為進一步探索CCCH 基因的進化關系和發掘其潛在功能，對苧麻CCCH 基因的基因結構、保守基序和結構域進行分析。如圖2所示，有一些保守基序單獨存在于大多數家族成員中，如motif1，這可能與他們的特定功能有關;還有一些保守基序存在于少數家族成員中，有特異性，如motif2和motif3，僅存在于亞組Ⅱ中。大部分苧麻CCCH 基因存在多個motif，但也有一些基因僅存在2個motif，如BniC3H1 存在motif1 和motif3，BniC3H40 存在motif1和motif2，而且BniC3H1和BniC3H40序列高度保守。大多數亞組的保守基序都存在motif1，與亞組分類對應，這更進一步說明苧麻CCCH 家族基因的系統發育樹分類結果具有準確性。

有關苧麻CCCH 基因不同亞組之間的基因結構的差異分析，為探查基因在進化中多功能發展提供可能。使用NCBI的ConservedDomainDatabase數據庫對上述6種蛋白的氨基酸序列進行保守結構域分析，并通過TBtools處理得到可視化圖形（圖3），CCCH 家族基因編碼的蛋白含有zf-CCCH 結構域。CCH家族的成員的CDS區（外顯子）和UTR區（內含子）結構較為復雜（圖4），60%以上成員存在多個間斷的CDS區域和UTR區域。整體來說，苧麻的CDS和UTR的結構差異與進化樹相對應，說明苧麻的進化過程中，CCCH 家族的成員在功能上可能存在功能進化分支，預示基因功能的多樣化發展。

2.4 苧麻CCCH 基因染色體分布及共線性分析

基因所在的染色體物理位置定位分析顯示（圖5），苧麻59個CCCH 基因（除BniC3H5外）隨機、不均勻分布在14條染色體上，其中不乏物理位點較近或可能重合的基因。苧麻CCCH 基因在不同染色體位置的數量分布差異較大，2號染色體和8號染色體下部多達7個基因;13號染色體存在一個基因集群，為BniC3H2和BniC3H3。苧麻染色體上存在基因集群，可能是基因的復制和串聯重復生成的。通過分析苧麻中CCCH 基因家族的共線性，探索CCCH 可能的關系和潛在的復制事件。使用BlastP軟件進行比對，MXscanX軟件進行多重共線掃描，AdvancedCircos軟件構建了苧麻物種內比較共線性圖譜（圖5），以及苧麻與擬南芥、水稻和棉花進行比較共線性圖譜分析（圖6），結果表明水稻染色體與苧麻8號染色體存在較多共線性關系，大部分共線性分析集中在苧麻染色體的中下端;僅有2號、3號、5號、6號、8號、10號和13號染色體與水稻染色體有共線性關系，可能是單子葉植物和雙子葉植物在進化過程中的某一分歧導致了CCCH 基因家族成員發生了丟失或阻礙了基因家族的擴張過程。苧麻與擬南芥的共線性關系比水稻多，沒有共線性關系的染色體數量比水稻少，僅有2個，如5號和13號染色體;苧麻2號和8號染色體與擬南芥的共線性關系較多，主要集中在染色體的中下端，與水稻相似。與棉花的共線性的基因數量和染色體分布較水稻和擬南芥多，棉花和苧麻的每一條染色體上都存在共線的區塊，這可能與苧麻、棉花都是纖維作物有關。

2.5 苧麻CCCH 基因家族啟動子順式作用元件預測

從苧麻基因組中提取59個CCCH 基因上游2000bp啟動子序列，通過PlantCARE 網站預測它的順式作用元件。結果表明，共有1518個CAEs，可分為17種類型和4個功能模塊。這4個功能模塊包括：光響應、脅迫響應、激素響應和植物生長發育響應元件（圖7）。光響應元件包括G-box、GT1-motif、Box4、ATC-motif和ACE等元件;脅迫響應元件包括低溫脅迫（LTR）、厭氧誘導（ARE，GCmotif）干旱脅迫（MBS）和wound-responsiveelement（WUN-motif）;激素響應元件包括生長素（TGA-element，AuxRR-core）、赤霉素（TATC-box，P-box，GARE-motif）、ABA （ABRE）、茉莉酸甲酯（TGACG-motif，CGTCA-motif）和水楊酸響應元件（TCA-element）;植物生長響應元件包括晝夜節律控制（circadian）、類黃酮生物合成基因調控（MBSI）和分生組織（CAT-box）等順式作用元件。對這些預測結果進行統計發現，59個苧麻CCCH 基因啟動子區都被檢測到光響應和激素響應。58 個苧麻CCCH 基因啟動子區檢測到脅迫響應，其中厭氧誘導響應元件占59.5%;36個苧麻CCCH 基因啟動子區檢測到植物生長發育響應，其中比例最大的是分生組織響應元件（33.8%）。以上結果表明，苧麻CCCH 基因家族可能在響應光、激素和逆境脅迫以及調節苧麻的生長發育方面起重要的作用。

2.6 苧麻CCCH 基因表達模式分析

從本實驗室前期轉錄組數據庫中，獲取了苧麻CCCH家族基因響應鎘脅迫下單施乙烯利和磷酸二氫鉀及混合施用乙烯利和磷酸二氫鉀的表達譜（圖8）。結果表明，苧麻CCCH 基因在不同處理的葉片中表達有明顯的特異性，BniC3H14、BniC3H38、BniC3H39 和BniC3H49 在所有處理中均不表達。BniC3H2、BniC3H27、BniC3H44 和BniC3H56 在所有處理中的表達FPKM 值都小于1（圖8A）。BniC3H1、BniC3H22 和BniC3H24 在各個處理下表達顯著，且在KH2PO4 處理下表達量顯著高于CK，而在ETH、ETH+ KH2PO4 處理下表達顯著低于CK，這些基因有可能受到KH2PO4正向調控。BniC3H18、BniC3H36、BniC3H52 在ETH、KH2PO4 及ETH+ KH2PO4 處理下均顯著低于CK，其中BniC3H52 在KH2PO4 處理下與CK無差異，因此該基因有可能不受KH2PO4 的調控。BniC3H48、BniC3H53和BniC3H57 在ETH+ KH2PO4 處理后表達顯著。BniC3H57 在ETH 處理下表達不顯著，而在KH2PO4 處理下表達顯著，在ETH+ KH2PO4 處理下表達更顯著，推測該基因可能受KH2PO4 正向調控。BniC3H48 和BniC3H53 在ETH、KH2PO4 單獨處理下表達不顯著，但在ETH+KH2PO4 兩者混合噴施處理下高表達，其表達FPKM 值比CK高2.7和0.28倍，推測這兩個基因可能受ETH和KH2PO4 共同誘導（圖8B）。

3 討論

轉錄因子在植物非生物逆境脅迫的調控中發揮著重要作用，它們參與特定生理或生化過程的調控[16]。CCCH 基因家族在大豆、擬南芥、矮牽牛和水稻等多種植物中開展了研究[8]，但在苧麻中未見報道。該基因家族可能在激素響應和干旱、低溫和鹽漬等非生物逆境應答中發揮重要作用[3]。生物信息學分析苧麻CCCH 基因家族，確定其CCCH 基因家族成員59個，各家族成員在理化性質上有很大差異。染色體定位發現，除BniC3H5 之外，苧麻CCCH 家族成員分布于14條染色體，在chr2，chr8，chr10，chr13條染色體上存在基因簇，這可能是通過基因的復制和串聯重復擴大了苧麻CCCH 基因家族成員的數量從而使功能更加豐富。系統發育樹分析將苧麻CCCH 基因與擬南芥CCCH 基因進行了分類，苧麻CCCH 家族成員可以分為兩組，每個組都含有擬南芥的CCCH 基因;基因結構分析表明，同一分支下的基因具有相似的保守基序、內含子和外顯子結構，表明CCCH 家族基因結構在植物中高度保守。類似結果也普遍存在于其它植物中，如：玉米[17]、擬南芥和水稻[18]，這一結果保證了苧麻CCCH 基因家族成員在演化過程中的保守性。在分析過程中發現該基因家族存在“超大基因（gt;1000aa）”的現象，該現象可能由于以下情況出現，一是由于基因組數據來自于NCBI，數據在注釋過程中有可能發生基因組注釋錯誤，導致出現超大基因;二是物種進化過程中經歷了基因的串聯復制，造成了“超大基因”現象。但對于這一現象還未見相關文獻報道，后期我們會對這幾個“超大基因”進行進一步的探索和核實。

啟動子是基因表達調控的重要元件，而轉錄因子需要與啟動子順式作用元件進行特異性結合，才能調控基因的轉錄[19-20]。順式作用元件分析發現，苧麻CCCH 基因啟動子區主要包含光、干旱、赤霉素、水楊酸、晝夜節律調控等順式作用元件，表明苧麻CCCH 基因與光、激素響應和脅迫應答相關。這與煙草[10]、柳枝稷[21]、龍眼[22]研究結果相似，表明苧麻CCCH 基因調控機制復雜，廣泛參與了植物的生命過程。

土壤中的鎘污染是世界范圍內的一個主要環境問題[23]。苧麻因生物量大、繁殖迅速等特點被認為是鎘富集植物，是一種較好的修復鎘污染土壤的纖維作物[24]。有研究表明，植物調節劑乙烯和葉面施磷酸二氫鉀對修復土壤鎘污染有一定的作用[25-26]。因此為了解BniCCCH 基因家族成員在外源乙烯利和磷酸二氫鉀作用下的表達模式，我們對轉錄組數據中的基因表達水平進行了差異表達分析，結果表明BniC3H18 在ETH、KH2PO4 及ETH +KH2PO4 處理下均顯著低于CK，而BniC3H48 在ETH+ KH2PO4 處理下高表達，比CK高1.95倍，我們推測該基因有可能受乙烯和磷酸二氫鉀共同誘導，而該基因同源蛋白主要參與細胞壁的次生加厚過程，與細胞次生壁合成中的木聚糖乙酰化酶RWA1蛋白互作;也會與纖維素合成酶A 催化亞基（IRX1）互作。研究表明，IRX1基因調控木質部細胞壁增厚并增加擬南芥的干旱抵抗能力，參與非生物脅迫調控[27]。因此，推測ETH 和KH2PO4 復配處理可能會調控BniC3H48 的表達參與細胞壁對鎘離子的固定，但對于苧麻CCCH 基因調控苧麻鎘脅迫的分子機制還需要進一步的探究。

4 結論

本研究鑒定出苧麻CCCH 基因家族的59個成員可分為二個亞組，不均勻地分布在14條染色體上;苧麻與棉花的共線性基因數量最多。基因啟動子區包含多個與光、激素、逆境脅迫以及生長發育相關的響應元件。在此基礎上，結合苧麻轉錄組數據，篩選出在鎘脅迫下噴施ETH、KH2PO4 及ETH+KH2PO4 后的差異基因，尤其是BniC3H48、BniC3H53和BniC3H57 在ETH 和KH2PO4 混合噴施處理下表達量呈上調趨勢，為深入研究ETH 和KH2PO4 互作調控苧麻鎘富集的分子機理和苧麻修復鎘污染土壤提供理論基礎，也進一步推動CCCH基因的研究與發展。