林火強度對興安落葉松林土壤氮循環功能基因的影響

關鍵詞：火燒強度;氮循環功能基因;興安落葉松;土壤養分循環

林火作為森林生態系統中的一個重要影響因子，隨著全球氣候變暖，林火發生的頻率、火燒面積和火燒強度將會持續增加[1-2]。氮素是限制北方針葉林植被生長恢復的首要營養元素，而氮循環直接影響著土壤對植物本體的供氮能力[3]。研究表明高強度火燒會導致北方森林土壤中氮素大量損失，嚴重破壞該地區的土壤氮素循環，進而減緩火后植被的恢復更新[4-5]，所以探究火干擾對土壤氮素循環的影響機制始終是眾多學者研究的熱點之一。土壤微生物通過自身代謝過程產生的酶來控制土壤氮素循環轉化，通常用nifH ，amoA-AOA/amoA-AOB，nirK/nirS 和nosZ 基因豐度分別表征固氮酶、氨單加酶AOA/氨單加氧酶AOB、含銅離子/細胞色素cd1亞硝酸鹽還原酶和N2O 還原酶的活性，這些酶分別對應著土壤氮的固持、硝化和反硝化過程[6]，因此火干擾對土壤氮素循環的影響可以通過探究火燒跡地土壤氮素循環功能基因與火燒強度之間響應關系來解釋。

火燒通過控制土壤溫度對土壤微生物活性產生直接的影響，火燒時產生的高溫可達1500℃，直接導致土壤微生物大量死亡，且很難在短時間內恢復[7]。已有研究表明，火燒導致土壤中的nirK，nosZ，narG 和nifH 基因豐度顯著增加，進而導致土壤氮的總礦化率降低[8]。雖然火災發生后森林土壤中N 含量降低，但參與N 固定的基因（nifH ）的相對豐度卻不受火災的影響[9]。除此之外還有研究發現火災影響的表層土壤中亞硝酸鹽還原基因（nirS）的相對豐度提高了70%（P=0.043），硝酸鹽還原基因（narG ）的相對豐度顯著降低（P =0.013）[10]。這主要是由于火燒強度、土壤類型、植被類型和氣候環境的不同導致土壤微生物對溫度的耐受性存在差異，因此在探究火干擾對土壤氮素循環的影響過程中還需要根據當地的氣候條件進行多次的分析，并且火后土壤理化性質的改變也會對土壤氮循環基因產生顯著的間接影響[11]。目前國內學者圍繞火燒對土壤氮素循環的影響機制展開大量研究，但研究主要偏重于對火后土壤氮組分含量、土壤氮的礦化、硝化等方面進行探討[12-13]，而基于分子生物學層面，對土壤氮循環功能基因與火燒強度的響應關系研究報道較少，亟需加強火干擾對北方森林土壤氮素循環功能基因豐度影響相關課題開展研究。

大興安嶺林區作為我國北方森林火災發生最為頻繁的地區之一，每年都會受到森林火災的干擾，而興安落葉松（Larixgmelinii）由于具有抗寒的特性成為了林區內分布最廣泛、種植最多的優勢樹種之一[14-15]。本研究選取火燒前以興安落葉松林為優勢樹種的火燒跡地為研究對象，在火燒跡地內分別設置重度火燒、輕度火燒、未火燒三種火燒強度樣地，對不同火燒強度樣地土壤理化因子[容重（Bulkdensity，BD）、含水率（Soilmoisturecontent，SMC）、pH 值、有機碳（Soilorganiccarbon，SOC）、全氮（TotalN，TN）、銨態氮（AmmoniumN，NH4+-N）、硝態氮（NitrateN，NO3--N）、速效磷（AvailableP，AP）、速效鉀（AvailableK，AK）、微生物量碳（MicrobialbiomassC，MBC）和微生物氮（MicrobialbiomassN，MBN）]以及參與土壤氮循環的微生物功能基因（固氮nifH，硝化amoA-AOA和amoA-AOB、反硝化nirS，nirK 和nosZ）進行量化測定，探討土壤理化性質和土壤氮循環基因對火燒的敏感程度，并采用冗余分析（Redundancyanalysis，RDA）和Pearson相關性分析方法對土壤理化因子與土壤氮循環基因進行分析，從而找出驅動基因豐度變化的主要因子，旨在為火燒跡地土壤氮素循環、植被快速更新及火燒跡地的恢復管理提供重要數據支撐和建議。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區位于內蒙古自治區根河市（121°41'19″E，50°52'49″N）。該地區氣候為典型的寒溫帶大陸性氣候，年降水量在450～550mm 之間，晝夜溫差變化大，冬季長夏季短，冰凍期長達9個月，年均氣溫-5.3℃，素有中國冷極之稱。土壤類型主要以弱酸性棕色針葉林土為主，植被類型喬木為興安落葉松（Larixgmelinii）、白樺（Betulaplatyphylla），灌木主要有紅豆越桔（Vacciniumvitis-idaea）、山刺玫（Rosadavurica）、興安杜鵑（Rhododendrondauricum）等[16]。

1.2 采樣點的鋪設

根據內蒙古根河森林工業有限公司防火辦撲火記錄，選取2019年上央格氣林場火燒跡地為試驗區，其過火面積為120.15hm2，起火原因為雷擊火。在火燒跡地內進行火燒強度調查劃分時，根據火燒強度劃分特征（表1）在火燒跡地內設置了重度火燒、輕度火燒和未火燒三種火燒強度的標準樣地[17]。樣地大小為20m×20m，每種火燒強度各設置3塊重復樣地，一共9塊樣地，各樣地信息如表2所示。

1.3 樣品采集和測定

樣品采集時間為2022年7月，對每個樣地按照“S型”分別挖取3個土壤剖面，并對土壤分層取樣0～10cm 和10～20cm。取土前用鐵鏟對土壤枯枝落葉層進行清除，避免樣本受到外部污染。先用鐵鏟將環刀砸入不同土層中，取出密封好并進行編號，帶回實驗室進行稱重、烘干。然后進行取土，取土采用先下后上的原則，并在采集過程中要盡量剔除石礫、植物殘根等，每層采集的土壤樣品不少于200g。將3個土壤剖面相同土層土壤進行混勻，裝入無菌的自封袋內，將18個土壤樣品放入帶有冰袋的保溫箱中帶回實驗室測定分析。將每袋土壤樣品分為三份，一份樣品用于測定土壤pH 值、土壤有機碳含量、土壤全氮含量、土壤速效磷和土壤速效鉀含量;一份樣品儲存在-4℃的冰箱中，用于測定土壤含水量、土壤銨態氮和土壤硝態氮含量;最后一份樣品儲存在-80℃的冰箱中，用于測定土壤微生物量碳氮和土壤微生物氮循環功能基因豐度。

1.3.1 土壤理化性質測定 土壤容重用環刀法測定;土壤含水率用烘干法測定;土壤pH 值用玻璃電極法測定（水土比為2.5∶1）;土壤有機碳含量采用重鉻酸鉀氧化法測定;土壤全氮含量用凱式定氮儀測定;土壤銨態氮和硝態氮含量采用流動分析儀測定;土壤速效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定;土壤速效鉀含量采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定[18]。土壤微生物量碳氮含量采用氯仿熏蒸法進行測定[19]。

土壤微生物量碳含量（mg·kg-1）的計算公式：MBC=EC/kEC。

式中：EC=熏蒸土壤提取的有機碳含量—不熏蒸土壤提取的有機碳含量。

kEC為轉換系數，取值0.45。

土壤微生物量氮含量（mg·kg-1）的計算公式：MBN=EN/kEN。

式中：EN =熏蒸土壤提取的全氮含量—不熏蒸土壤提取的全氮含量。

kEN 為轉換系數，取值0.45。

1.3.2 土壤氮循環基因測定 稱取0.5g土壤樣品用DNeasy PowerSoil ProKit（QIAGEN，美國）試劑盒進行DNA的提取。使用NanoDrop2000微光分光光度計（ThermoFisherScientific，美國）檢測DNA純度，使用TBS-380微型熒光計（TurnerBioSystems，USA）檢測DNA濃度。1%（質量分數）瓊脂糖凝膠電泳，電壓5V·cm-1，時間為20min，檢測DNA完整性。通過熒光定量PCR儀（ABIGeneAmp9700型，ABI，美國）對土壤固氮（nifH ）、硝化（amoA-AOA，amoA-AOB）、反硝化（nirS，nirK，nosZ）氮循環過程相關功能微生物基因進行擴增，擴增所用引物及擴增程序見表3，擴增產物經2%（質量分數）的瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后進行純化，使用NEXTFLEXRapidDNA-SeqKit進行測序文庫構建，使用IlluminaNovaSeq測序平臺進行宏基因組測序[20]。

1.4 統計分析

采用SPSS26統計軟件對不同火燒強度后土壤氮循環基因的豐度數據進行顯著性分析，并運用CANOCO5.0軟件對土壤氮循環基因進行冗余度檢驗分析。分析方法包括描述性統計分析、單因素方差分析（ANOVA）、FisherLSD 檢驗、Pearson相關性分析和RDA（冗余度分析）檢驗分析。采用Origin2020制圖軟件制作圖。

2 結果與分析

2.1 不同火燒強度對土壤理化性質的影響

如表4所示，不同火燒強度對土壤理化性質影響顯著（Plt;0.05）。重度火燒和輕度火燒樣地土壤BD，pH值，NO3--N，AP和 AK 含量相較于未火燒樣地分別增加了15.87% 和3.10%，5.86% 和4.08%，41.89% 和10.25%，28.88% 和3.10%，49.64%和10.36%，說明火燒提高了土壤BD，pH值，NO3--N，AP和 AK含量，并隨著火燒強度的增加而增加。重度火燒和輕度火燒樣地土壤SMC，TN，NH4+-N，MBC和 MBN 含量相較于未火燒樣地分別減少了12.27% 和4.35%，38.94% 和15.66%，20.59% 和11.76%，8.38 和3.27%，13.12%和10.73%，說明火燒降低了SMC，TN，NH4+-N，MBC和 MBN含量，并隨著火燒強度的增加而減少。輕度火燒提高了SOC含量，重度火燒降低。顯著性分析表明，土壤各理化性質含量在重度火燒與未火燒之間存在顯著差異（Plt;0.05），且在不同土層之間也有顯著差異。重度火燒對10～20cm土層土壤理化性質有顯著的影響，而輕度火燒只影響了0～10cm 土層。

2.2 不同火燒強度對土壤氮循環功能基因豐度的影響

火燒強度對土壤氮循環功能基因豐度的影響如圖1所示。固氮nifH 功能基因豐度在不同火燒強度樣地之間由大到小依次為未火燒、輕度火燒、重度火燒，隨著火燒強度的增加而降低。硝化amoAAOA和amoA-AOB 功能基因豐度在不同火燒強度之間的變化趨勢與固氮nifH 功能基因相反。輕度火燒提高了反硝化nirK，nirS 和nosZ 功能基因豐度，重度火燒降低了其基因豐度。顯著性差異分析表明，土壤氮循環功能基因豐度主要在重度火燒與未火燒之間存在顯著差異（Plt;0.05）。重度火燒對10～20cm 土層土壤氮循環功能基因豐度有顯著的影響，而輕度火燒只影響了0～10cm 土層。

2.3 土壤氮循環功能基因的影響因子分析

Pearson相關性和RDA 分析結果發現，土壤氮循環功能基因與土壤理化性質之間存在著密切的聯系。具體如下（圖2）：固氮nifH 功能基因豐度與SMC，pH 值分別呈顯著正相關和負相關關系（Plt;0.05）;硝化amoA-AOA 功能基因豐度與BD，pH值呈顯著正相關關系（P lt;0.05），與TN 含量、NH4+-N含量、MBN含量、SMC，SOC含量、MBC含量呈顯著負相關關系（Plt;0.05）;硝化amoA-AOB功能基因豐度與BD，pH 值呈顯著正相關關系（Plt;0.05），與TN含量、SMC，NH4+-N含量呈顯著負相關關系（P lt;0.05）;反硝化nirS 功能基因豐度與TN含量、SMC呈極顯著正相關關系（Plt;0.01）;反硝化nirK 功能基因豐度與SOC含量、SMC，TN 含量、NH4+-N 含量、MBC含量、MBN 含量呈顯著正相關關系（Plt;0.05）;反硝化nosZ 功能基因豐度與TN含量呈顯著正相關關系（Plt;0.05）。RDA 分析結果表明，第一、二軸的特征值分別為0.5702，0.1473，共解釋了總方差的71.75%。表明土壤理化性質能夠較好的解釋與土壤氮循環功能基因的關系。從圖3可以看出，SOC，AP，TN，pH 值對不同火燒強度土壤氮循環功能基因具有最大解釋度（SOC：29.0%，P=0.008。AP：33.0%，P=0.002。TN：8.3%，P=0.03。pH：9.5%，P=0.01）。

3 討論

3.1 火燒強度對土壤理化性質的影響分析

本研究通過對不同火燒強度后土壤基礎理化性質測定分析發現，火燒會對土壤環境產生嚴重的破壞，尤其是重度火燒會對土壤環境恢復造成一個嚴重的甚至失去恢復能力的影響。研究發現火燒對BD有顯著性的影響（Plt;0.05），BD 隨著火燒強度的增加而增加，重度火燒影響最大，并且這種影響隨著土壤深度的增加而減少，這與陳小偉等的研究結果相似[27]。同樣Phillips等[28]對橡樹林地進行規定火燒發現火后BD 也呈增加的趨勢，這可能與土壤有機質大量損失有關。研究發現SMC與BD 之間有著密不可分的聯系，隨著BD的增加，土壤變得越來越緊實，導致SMC降低[29-30]，而本研究對火燒后SMC的測定也得到了相同的結果。

目前大量研究報告表明火燒會導致pH 值增大[31]，但也有少部分研究表明火燒對pH 值沒有影響[32]。本研究發現土壤pH 值隨著火燒強度的增加呈現出上升的趨勢。范雪松等[33]也發現該地區重度火燒跡地土壤pH 值比未火燒地增加了7.7%，分析其原因可能是大興安嶺興安落葉松林土壤呈弱酸性，林火燃燒地上植被所產生的灰燼中富含的鈣鎂等堿性離子隨雨水浸入土壤中從而導致pH 值上升。本研究結果顯示，輕度火燒導致SOC 含量增加，重度火燒導致SOC 含量減少。陸剛[34]和周文昌等[35]的研究均也得到了相同結果，分析其原因可能是重度火燒造成地表植被完全燒毀，并且植被燃燒時產生的高溫導致土壤表層的有機碳被大量分解導致的;而輕度火燒后大量的植被沒有被完全燒毀，產生的可燃物進入土壤，加之燃燒時產生的高溫促進了微生物對可燃物的分解，進而對SOC進行了有效補充[36]。土壤TN 隨著火燒強度的增加而減少，這可能與火燒時產生的溫度有關，研究表明氮在溫度達到200℃時就會開始揮發，而森林發生火災時的溫度可達1500℃[37]，并且火后SOC的減少同樣也會對TN 產生影響，谷會巖等[36]研究發現SOC與TN 呈正相關關系，這在本研究中也得到了證實。

本研究發現火后 NO3--N 含量顯著增加，并隨著火燒強度增加而增加，這與Albert-Belda等[38]研究結果相似，同樣張琳等[39]研究也發現火后 NO3--N含量顯著增加，并且火后 NH4+-N 含量也明顯高于對照樣地，這與本研究的結果存在差異，本研究發現重度火燒后 NH4+-N 含量降低，而輕度火燒后NH4+-N含量增加，這可能與溫度有關，張琳的研究區為草地，火燒時產生的溫度低于森林火災。當土壤溫度升高時，有機態氮和銨態氮會分解釋放出氨氣，氨氣在空氣中會迅速轉化為氮氣并釋放掉。火燒會破壞土壤中的有機質，使其更易于降解和轉化。有機物中所含的銨態氮容易被微生物分解和轉化為其他形式的氮，從而降低土壤中的銨態氮含量[40]。參與土壤不同氮循環過程的土壤微生物功能基因豐度在不同火燒強度之間的變化同樣也是影響 NH4+-N和NO3--N含量的主要因素之一。

土壤中的AP和AK是能夠直接被植被吸收利用的營養元素，本研究發現林火干擾后土壤AP和AK 含量均顯著增加，這是由于植被和有機質燃燒產生的灰燼中富含大量的養分滲入土壤中，進而使土壤速效養分含量增加。Fernández-García等[41]發現高強度野火后與未燒毀的地塊相比，燒毀地塊的表層土壤中的有效磷含量更高;同樣，Moya等[42]也觀察到，與對照地塊相比，被燒毀森林的0～10cm土壤中的有效P含量顯著增加，冉益倩等[43]研究發現火干擾后土壤速效磷和速效鉀含量都顯著高于對照樣地，這些結果與本研究一致。土壤微生物對溫度有較高的敏感度，研究發現土壤微生物最高可忍受的溫度在50℃～300℃之間，高強度火燒可直接導致土壤微生物大量死亡，且短時間內很難恢復到火燒前的水平[6]，因此土壤MBC和MBN 含量在火燒后降低，本研究中也都得到了相同的結果，同樣么中元等[44]和孔健健等[45]的研究也發現火燒后土壤MBC和MBN 含量顯著降低。

3.2 火燒強度對土壤氮循環功能基因的影響分析

土壤微生物對溫度具有強烈敏感性，本研究發現參與土壤氮循環功能基因（固氮nifH 功能基因、反硝化nirS，nirK 和nosZ 功能基因和硝化amoA-AOA和amoA-AOB 功能基因）在不同火燒強度下有著不同的變化趨勢。其中火燒導致固氮nifH 功能基因豐度顯著下降，且隨著火燒強度的增加而減少，研究發現土壤微生物量氮（MBN）對土壤微生物氮素固持作用均有較好的指示性[46]。李偉克[47]與張亨宇[48]的研究均發現火燒后土壤MBN 含量顯著低于對照樣地，火燒產生的高溫使得固氮植物急劇減少和固氮微生物大量死亡，進而導致固氮能力降低。

本研究也得到了相似的結果，硝化amoA-AOA和amoA-AOB 功能基因豐度隨著火燒強度的增加而增加，分析其原因可能是：（1）林火提高了土壤溫度，為硝化細菌提供了適宜的生存環境[49];（2）火后的植被灰分中富含大量的營養物質，如碳源和氮源，有利于微生物的生長繁殖;（3）黑碳是火后的產物，黑碳進入土壤中提高了土壤的透氣性，為硝化細菌提供了充足的氧氣，且黑碳對土壤中天然硝化抑制化合物（酚類化合物）有著很好的吸附性[50]。火后pH 值的增加也會提高土壤的硝化速率，相關性結果表明土壤硝化amoA-AOA 和amoA-AOB 功能基因與pH值呈顯著的正相關關系[51]。火后 NH4+-N含量的增加，提高了土壤硝化作用的底物濃度，進而有利于土壤硝化amoA-AOA 和amoA-AOB 功能基因豐度的增加，許多研究結果也均表明底物濃度是影響氨氧化細菌（amoA-AOB）和古菌（amoA-AOA ）在土壤中生長并發揮氨氧化功能的主要因素[52-53]，這在本研究也得到了證實。

本研究發現重度火燒導致反硝化nirS，nirK 和nosZ 功能基因豐度顯著降低，而輕度火燒使其增加，這可能與有機質含量存在較大的相關性。輕度火燒加速了地表枯枝落葉中的難分解組分降解，提高了土壤中有效養分濃度，增加土壤硝酸鹽含量，進而使土壤反硝化細菌數目增加[54]。同樣曹林樺[55]的研究也發現土壤反硝化細菌功能基因豐度與有機質含量呈顯著的正相關關系。婁煥杰等[56]研究發現，土壤的全氮含量也是影響土壤反硝化作用的主要因素。土壤反硝化作用大多是在缺氧的條件下進行的，火后土壤容重增加，土壤氧氣含量也隨之降低，有利于土壤的反硝化作用的進行。

3.3 影響土壤氮循環功能基因的土壤理化因子

微生物作為土壤氮素循環過程中主要的驅動力，是通過自身代謝產生的酶參與土壤的氮循環過程。火干擾通過改變土壤理化環境進而對土壤微生物的數量、多樣性和群落結構產生間接且長期的影響[57]。冗余分析結果土壤氮循環功能基因解釋比例最多的土壤理化因子，分別是SOC（55.4%，P=0.008）、AP（28.5%，P =0.022）、TN（8.3%，P =0.03）和pH（9.5%，P=0.01），說明SOC，AP，TN和pH 值是影響火后土壤氮循環功能基因豐度差異的主要土壤理化因子。有機碳中有著豐富的養分，是土壤微生物進行生長和代謝活動的主要影響來源，而火干擾會導致土壤有機碳大量損失，對土壤微生物的活性和多樣性造成嚴重影響[58]，因此SOC含量與多數氮循環功能基因呈正相關關系。燃燒后的植被灰分在短期內會顯著提高土壤的速效養分，加速土壤養分循環。速效養分含量的變化不但顯著影響森林植被的生物量，同時也是影響細菌群落結構變化的關鍵因子之一[59]。AP是微生物合成生物體DNA，RNA 和ATP等關鍵生物分子的重要成分，它作為微生物的營養物質，可以刺激微生物的生長和繁殖[60]。雖然火燒后土壤中的AP 含量顯著增加，但AP在土壤中容易與鐵、鋁等離子形成難溶性磷酸鹽，并且興安落葉松林土壤為棕色針葉林土，其pH 呈弱酸性，AP在土壤中的溶解度相對較低，使其難以被微生物直接利用[61]，因此AP與大多數氮循環功能基因豐度呈負相關關系。同樣，朱光艷等[12]研究中也發現AP是土壤氮凈礦化率（NMR）的主要影響因子之一。TN 是土壤氮素循環的綜合產物，與氮循環功能基因之間存在著密切的聯系，因此也是影響土壤氮循環功能基因的主要理化因子之一。土壤pH 值會直接影響著土壤微生物群落的活性，火后土壤pH 值的增加使硝化速率也得到了提高，研究發現硝化amoA-AOA 和amoA-AOB 功能基因豐度與土壤pH 值呈顯著正相關關系[53，62]，這在本研究中也得到了證實。同時pH 值也會改變有機質的溶性，為土壤微生物提供大量生活所需的C，N 等營養基質，提高了土壤微生物的活性。

4 結論

火燒對興安落葉松林土壤氮循環功能基因有著顯著的影響，其中固氮功能基因豐度隨著火燒強度的增加而降低，硝化功能基因豐度隨著火燒強度的增加而增加，反硝化功能基因豐度在輕度火燒后增加，重度火燒后降低。火后土壤理化性質的改變也會對土壤氮循環功能基因產生間接的影響，SOC，AP，TN 含量和pH 值是影響火后土壤氮循環功能基因豐度差異變化的主要理化因子，因此可以對森林生態系統進行定期適當的計劃火燒，有利于清除地表死可燃物，減少重特大森林火災發生概率，促進土壤養分的釋放，促進植被生長和營養物質循環，同時加強火災監控預警技術，及時進行林火撲救，避免造成嚴重的火災，對土壤環境產生不可逆轉的影響。