硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子生長和抗氧化系統的影響

關鍵詞：達烏里胡枝子;硫化氫;鹽脅迫;抗氧化系統

土壤鹽漬化是限制植物生長的主要環境因素，一般廣泛存在于我國華北、西北、東北等地區[1]，與健康土壤相比，鹽漬化土壤易使植物缺水萎蔫甚至死亡，這嚴重限制了我國農業生產和社會發展[2]。達烏里胡枝子（Lespedezadavurica）是豆科（Leguminosae）胡枝子屬（Lespedeza）的多年生半灌木，是我國一種優質飼用植物，具有耐薄瘠、生物量高、根系發達等良好特性[3]。同時，達烏里胡枝子是我國西北黃土高原地區的一種重要的水土保持植物，因此，在山西等華北鹽漬化地區，挖掘耐鹽達烏里胡枝子種質資源和選育耐鹽品種對保持當地水土方面有重要研究意義。然而達烏里胡枝子因種子較小、野生種發芽率較低，栽培初期產量低等因素[4-6]，造成了達烏里胡枝子擴繁和培育存在一定困難。在生長環境難以改變以及擴繁困難等情況下通過施加外源物質提高達烏里胡枝子耐鹽性就尤為重要[7]。目前，通過外源物質處理提升植物抗鹽脅迫能力主要包括兩個方面：一是植物非內源物質的外源補充，如外源補充硒、海藻糖及納米金屬粒子等[8-10];二是植物內源物質的外源補充，如植物激素脫落酸及水楊酸等[11-12]、內源過氧化氫及抗壞血酸等[13-14]以及內源氣體信號分子一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）及硫化氫（H2S）等[15]。硫化氫（H2S）又稱氫硫酸，是繼CO和NO氣體信號分子后，于動植物體內發現的第3種氣體信號傳導分子[16]。目前，人們普遍認為硫化氫是一種自然界抗氧化能力較強的信號調節物質，同時通過向植物葉片噴施硫化氫供體NaHS 可對逆境下植物生長起到保護作用[17-18]。此外，有研究表明外源施加硫化氫能夠有效促進種子萌發[19]、調節氣孔運動[20]、增強光合作用[21]、延緩植物衰老[22]、增強抗旱能力[23]、緩解高溫脅迫[24]以及抵抗鹽脅迫[25]。

本研究以鹽脅迫下的達烏里胡枝子為研究對象，通過分析外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗的生長和抗氧化系統的影響，探究外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗的緩解作用，為提高達烏里胡枝子幼苗抗鹽能力，增強達烏里胡枝子品質和產量，更高效地在鹽漬化土地上栽培達烏里胡枝子提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與植物生長條件

試驗材料為山西農業大學草業學院提供的‘晉農1號’達烏里胡枝子，千粒重2.2g。

本試驗在山西農業大學草業學院日光溫室采用沙培法栽培幼苗。采用內徑23.5cm，深14cm的塑料盆裝沙和蛭石（沙∶蛭石=3∶1）3kg，并播種50粒左右。為保證營養供給，出苗兩周后每7天澆灌一次200 mL1/4 霍格蘭氏植物營養液。待幼苗長至第5周后定苗，每盆選留壯苗30株。培養期間每5天調換塑料盆方向，確保各個盆受光條件一致。

1.2 鹽脅迫處理及NaHS濃度設定

試驗首先通過預實驗篩選出鹽脅迫半致死濃度，并對培育的幼苗進行鹽脅迫處理，當鹽濃度達到半致死濃度時，最后進行葉面噴施NaHS溶液。

鹽脅迫處理：預實驗進行鹽脅迫半致死濃度的篩選，篩選得出達烏里胡枝子鹽分脅迫半致死濃度為150mmol·L-1[26]。將幼苗培養至第6周后，開始進行鹽脅迫處理。在營養液中加入NaCl溶液，每天遞增50 mmol·L-1，當濃度升至150mmol·L-1時，記為處理的第1天。之后每3天在營養液中加入濃度為150mmol·L-1的NaCl溶液（表1）并沖灌1次，以沖刷盆內積累的鹽分從而使盆內鹽濃度保持恒定（每盆澆灌量為600mL，沖灌量為澆灌量的3倍，即1.8L）。

NaHS濃度設定：以濃度倍增的方式設置6個NaHS濃度，分別是25，50，100，200，400 和800μmol·L-1。將配好的NaHS溶液噴施在達烏里胡枝子的葉面上，在處理的第1天噴施一次，之后每3天噴施一次，以霧化水珠布滿葉片表面為準。

1.3 試驗處理

在鹽脅迫第0，10，20，30d分別取樣，每次取樣時隨機抽取4盆幼苗進行測定。本試驗設置8個處理，每個處理設置16個重復。試驗處理見表1。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 生長特性指標的測定 每個處理隨機抽取4株達烏里胡枝子幼苗，分別用皮尺和游標卡尺測定幼苗的株高、莖粗、主根長、根粗;用天平稱量幼苗莖鮮重和根鮮重。

1.4.2 細胞膜透性指標的測定 相對含水量（Relativewatercontent，RWC）：每個處理條件下，隨機選取4片大小一致的達烏里胡枝子葉片，用紗布擦拭干凈，稱取植物的鮮重（Wf）;再將其在蒸餾水中浸泡6h后取出，用濾紙擦干，稱取植物的飽和鮮重（Wt）;放入烘箱中，60℃烘12h，記為干重（Wd），RWC=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%。

相對電導率（Relative electrolyteleakage，REL）：每個處理隨機抽取4片達烏里胡枝子葉片，用去離子水沖洗干凈后，采用電導儀法測定[27]。

丙二醛（Malondialdehyde，MDA）：采用硫代巴比妥酸法測定[27]。

1.4.3 抗氧化系統指標的測定 抗壞血酸（Ascorbicacid，AsA）含量采用2，6-二氯靛酚滴定法測定[27];谷胱甘肽（Glutathione，GSH）含量采用谷胱甘肽試劑盒（索萊寶）測定;過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創木酚比色法測定[27];過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性采用過氧化氫分解量測定[27];超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性采用氮藍四唑（NBT）方法測定[27]。

1.5 數據分析

通過MicrosoftOfficeExcel2016進行數據整理，利用SPSS22.0進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗（α=0.05），采用Duncan法進行差異顯著性的多重比較（P lt;0.05），運用Origin2018進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子生長特性的影響

鹽脅迫對達烏里胡枝子株高、莖粗、莖鮮重、主根長、根粗、根鮮重等指標均有顯著影響（Plt;0.05，圖1）。試驗期間，CK 組的株高、莖粗、主根長和根粗均呈現逐漸上升趨勢，而T0組的株高、莖粗、主根長和根粗則表現為增長緩慢，除根粗外其余三個指標均與CK組存在顯著差異（Plt;0.05）。

隨著鹽脅迫時間延長，T0組的達烏里胡枝子幼苗地上部分均顯著低于CK 組（Plt;0.05，圖1a，1b，1e）。當脅迫至第10d時，T50，T100，T200組的達烏里胡枝子株高顯著高于T0組，分別提高了4.92%，9.84%和6.57%;其中T100組的達烏里胡枝子莖粗與CK組無差異，與T0組相比提高了24.77%。脅迫至第20d時，T25～T200組的達烏里胡枝子株高顯著高于T0 組（P lt;0.05），分別提高了15.84%，24.92%，32.29%和16.63%;其中T100組的達烏里胡枝子莖粗較T0組提高了27.56%;脅迫至第30d時，T50，T100組的達烏里胡枝子株高與T0組相比顯著提高（P lt;0.05），分別提高了18.00% 和29.79%;其中T100組的達烏里胡枝子莖粗和莖鮮重與T0組相比分別提高了23.66%和14.57%。

隨著鹽脅迫時間的增加，達烏里胡枝子的地下部分總體受到的影響較小（圖1c，1d，1f）。脅迫至第10d時，T25～T400組的達烏里胡枝子主根長均高于T0 組（P lt;0.05）。脅迫至第20d 時，T25～T100組的主根長顯著高于T0組（Plt;0.05）;其中T100組的根粗顯著高于T0組（Plt;0.05），提高了18.61%。脅迫至第30d時，相較于其余各組，T100組的主根長和根鮮重顯著高于T0組（Plt;0.05），分別提高了17.80%和11.28%。

2.2 外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子細胞膜透性的影響

試驗中CK組達烏里胡枝子幼苗葉片相對含水量穩定在85.57%～88.92%之間，而T0組的相對含水量則呈現出逐漸下降的趨勢。施加不同濃度的外源硫化氫對葉片相對含水量的下降有一定緩減作用（圖2a）。鹽脅迫至第20d時，T50和T100組的達烏里胡枝子幼苗葉片相對含水量較T0組分別提高了7.28% 和8.54%，呈現出顯著差異（P lt;0.05）。脅迫至第30d時，T25～T400組的達烏里胡枝子幼苗葉片相對含水量較T0組分別提高了3.87%，5.75%，7.30%，5.24% 和0.87%，僅有T100組與T0組相比呈現出顯著差異（Plt;0.05）。綜上所述，100μmol·L-1外源硫化氫可以提高鹽脅迫下達烏里胡枝子葉片的相對含水量。

試驗中CK組達烏里胡枝子幼苗葉片相對電導率保持穩定，而T0組的相對電導率則呈現出逐漸上升的趨勢。施加不同濃度的外源硫化氫對葉片相對電導率的上升有一定緩減作用（圖2b）。在試驗階段，T0組的達烏里胡枝子幼苗在第10，20，30d時葉片相對電導率較CK 組分別提高了7.84%，9.76%和13.57%，均有顯著差異（Plt;0.05）。鹽脅迫至第10，20，30d時，T25～T400處理均不同程度地降低了幼苗葉片的相對電導率，而T800處理則提高了其相對電導率。其中100μmol·L-1外源硫化氫可以有效緩解鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗相對電導率的增加。

試驗中CK 組達烏里胡枝子幼苗葉片的MDA含量穩定在17.97～24.13μmol·g-1FW 之間，而T0組的MDA 含量則呈現出逐漸上升的趨勢。施加不同濃度的外源硫化氫對葉片的MDA 含量的上升有一定緩減作用（圖2c）。鹽脅迫至第10，20，30d時T0組的MDA 含量較CK 組呈現出顯著差異（Plt;0.05），并于第30d時達到最大值，此時較CK組增加了283.47%。脅迫至第10d時，T25～T400組較T0組MDA 含量均顯著降低（Plt;0.05）。脅迫至第20d和30d時，T25，T50，T100，T200和T400組較T0組均顯著降低（P lt;0.05）。綜上所述，25～400μmol·L-1外源硫化氫可以顯著降低鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗的MDA 含量。

2.3 外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗葉片抗氧化系統的影響

試驗中CK 組達烏里胡枝子幼苗葉片的AsA含量穩定在0.84～0.88μg·g-1FW 之間，隨著鹽脅迫時間的延長，T0組的ASA 含量在第10，20，30d時較CK 組有顯著差異（Plt;0.05，圖3a），并于第30d時達到最小值，較CK 組減少79.86%。脅迫至第10d時，T50和T100組的達烏里胡枝子葉片的AsA 含量較T0組顯著提高（Plt;0.05）。脅迫至20d 時，T100 組的AsA 含量較T0 組提高了4.34%;而T400和T800組的AsA 含量較T0組顯著降低（Plt;0.05），分別降低了6.74%和8.28%。脅迫至30d時，T50和T100組的達烏里胡枝子幼苗葉片AsA 含量與T0 組相比顯著提高（P lt;0.05），分別提高了8.48%和11.03%。施用一定濃度的外源硫化氫可以有效提高鹽脅迫下達烏里胡枝子葉片的AsA 含量，其中100μmol·L-1外源硫化氫的效果最佳。

試驗中CK 組達烏里胡枝子幼苗葉片的GSH含量穩定在3.34～3.68mmol·g-1FW 之間，而T0組的GSH 含量則呈現出先升高后降低的趨勢，并于第10d時達到最大值，于第30d時達到最小值，較CK組顯著減少了27.27%（Plt;0.05，圖3b）。鹽脅迫至第20d時，T25，T100，T200和T400組的GSH 含量較T0組顯著提高（Plt;0.05），分別提高了12.53%，14.16%，11.55%和12.57%。脅迫至30d時，T25～T400組的GSH 含量相較于T0組顯著提高（Plt;0.05）。

2.4 外源硫化氫對鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗抗氧化酶活性的影響

鹽脅迫會影響達烏里胡枝子幼苗葉片的抗氧化酶活性（圖4）。在試驗過程中，CK 組的SOD，POD，CAT 酶活性均穩定在一定的范圍內，而T0組的這三種酶活性則呈現出先上升后降低的趨勢，與CK組有顯著差異（Plt;0.05）。

試驗中CK組達烏里胡枝子幼苗葉片的SOD酶活性基本穩定在233.47～248.54U·g-1FW 之間，而T0組的SOD酶活性則呈現出先上升后降低的趨勢，并于第20d時達到最大值（圖4a）。脅迫至第20d時，T25～T200組的達烏里胡枝子幼苗葉片的SOD酶活性較T0組有所提高，但僅有T25組呈現出顯著差異（Plt;0.05）。脅迫至第30d時，T100組的SOD酶活性較T0組顯著提高了13.34%（Plt;0.05）。

試驗中CK 組達烏里胡枝子幼苗葉片的POD酶活性基本穩定在3.12～3.28U·g-1·min-1之間，而T0組的POD酶活性則呈現出先上升后降低的趨勢，并于第10d時達到最大值（圖4b）。脅迫至第20d時，T50和T100組的POD酶活性較T0組顯著提高（Plt;0.05），分別提高了7.84%和7.65%。脅迫至第30d時，T100組的POD 酶活性較T0組顯著提高了11.38%（Plt;0.05）。

試驗中CK組達烏里胡枝子幼苗葉片的CAT 酶活性基本穩定在72.53～77.34U·g-1·min-1之間，而T0組的CAT 酶活性則呈現出先上升后降低的趨勢，并于第10d時達到最大值（圖4c）。脅迫至第10d時，T25，T50和T100處理對CAT 酶活性具有一定的促進作用，與T0組相比存在顯著差異（Plt;0.05）。脅迫至第20d時，T100組的CAT 酶活性較T0組提高了8.75%，而T25，T50，T200，T400和T800組的CAT 酶活性較T0組均有所降低。脅迫至第30d時，T25～T200組的CAT 酶活性較T0組提高了16.78%，22.12%，24.16%和23.44%，呈現出顯著差異（Plt;0.05）。綜上所述，100μmol·L-1外源硫化氫對提高SOD，POD，CAT 酶活性效果較好。

3 討論

3.1 鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗生長特性對外源硫化氫的響應

對于植物地上部分，鹽脅迫導致植株吸收水分能力下降，使植株生長緩慢，植物的株高、莖粗等指標可以直觀反映鹽脅迫對植物的影響程度，而施加外源硫化氫可以有效減少鹽脅迫對植物地上部分造成的傷害。本試驗研究結果表明：與正常生長的植株相比，隨著鹽脅迫時間延長，幼苗的株高、莖粗、莖鮮重顯著下降。因為在植物生長過程中其需水量不斷增加，但受鹽脅迫影響，其吸收水分能力下降。經試驗發現，施用濃度為100μmol·L-1的外源硫化氫能有效提升達烏里胡枝子幼苗的株高和莖粗，這表明，一定濃度的外源硫化氫能促進植株生長，增強植株葉片吸收水分的能力緩減了鹽脅迫對植株造成的傷害。這與王紅燕等[28]研究結果一致，該研究發現鹽脅迫使棉花（Gossypiumhirsutum ）生長受阻，影響其地上部分的形態建成，而通過施加外源硫化氫有效地促進了棉花幼苗的生長發育，緩減了鹽脅迫對棉花幼苗造成的傷害，并指出施加濃度為100μmol·L-1外源硫化氫效果最好。

對于植物地下部分，通過對植株主根長、根粗等指標的分析研究發現：施加外源硫化氫對植株地下部分影響較小。雖然施用100μmol·L-1的外源硫化氫效果較好，但是該濃度下根系指標表現并不顯著，產生該現象的主要原因可能是由于葉面噴施直接作用于植物地上部分，而地下部分必須通過極性運輸才能獲取硫化氫，因此對地下部分影響較小。高曉蘭等[29]在對桃樹（Prunuspersica）根系的研究中發現，通過澆灌方式施加外源硫化氫顯著增加了根長、根表面積以及體積，并提高了根系活力。高雙紅等[30]研究結果表明，外源施加硫化氫可以有效緩減弱光脅迫對高羊茅（Festucaarundinacea）幼苗的生長限制。李東波等[31]研究也表明，硫化氫直接作用于根部，可以有效促進豌豆（Pisumsativum）胚根的伸長。由此表明，葉面噴施硫化氫主要依靠氣孔吸收，而通過維管束及篩管等途徑運輸到地下部分的硫化氫較少，因此葉面噴施硫化氫對地下部分影響較小。

3.2 鹽脅迫下達烏里胡枝子細胞膜透性對外源硫化氫的響應

植物細胞膜為細胞的生命活動提供了一個相對穩定的內部環境，是植物細胞的保護屏障，當植物受到非生物脅迫危害時，植物細胞膜往往最先受到影響[32]，通過分析植物的相對含水量、相對電導率、丙二醛含量等指標可以反映出植物細胞膜受影響程度。植物葉片相對含水量的高低反映植物體內水分的多少，相對含水量越高，植物耗水量就越少，抗非生物脅迫能力也就越高;相對電導率反映的是植物細胞膜透性的大小，植物細胞損傷越嚴重，葉片相對電導率值就越大，引起膜脂過氧化程度就越大，反之越小[33];丙二醛含量反映的是植物細胞膜的膜脂過氧化程度，隨著鹽脅迫過程中其含量的增加，細胞膜透性增大導致電解質外滲，從而使得植物葉片相對電導率也隨之增大[34]。本試驗中，達烏里胡枝子幼苗在鹽脅迫處理下相對含水量下降，相對電導率和丙二醛含量升高。這表明鹽脅迫下達烏里胡枝子細胞失水，細胞膜結構和功能受損，膜透性增大，膜脂過氧化程度加深;與T0組相比，施加了不同濃度的外源硫化氫葉片相對含水量增大，相對電導率和丙二醛含量下降。因此，可以認為施加外源硫化氫可以通過維持細胞較高的相對含水量和減小細胞膜透性的方式來緩解鹽脅迫造成的傷害。鄭州元等[35]通過對鹽脅迫下番茄（Solanumlycopersicum ）幼苗施加不同濃度的硫化氫處理也闡明了這一觀點。

3.3 鹽脅迫下達烏里胡枝子抗氧化系統對外源硫化氫的響應

鹽脅迫會誘導植物體內產生大量的活性氧如超氧陰離子自由基（O2-）、過氧化氫（H2O2）等，這會導致植物細胞質膜過氧化，細胞質膜透性增大以及細胞液外滲[36]，這是鹽脅迫能夠對植物造成傷害的主要原因之一。植物通常依靠兩套抗氧化系統來清除自由基，降低鹽脅迫對其造成的傷害，一類是抗氧化酶進行的酶促抗氧化系統，另一類是低分子物質進行的非酶促抗氧化系統[37]。

酶促抗氧化系統中抗氧化酶的活性變化表明了植物抗氧化損傷程度，是研究植物非生物脅迫的關鍵指標[38]。在抗氧化酶體系中，SOD是活性氧最有效的清除劑，它是抵御活性氧損害植物細胞的第一道防線。SOD可以將 O2- 代謝為 H2O2，然后通過CAT，POD等其他抗氧化酶將 H2O2 代謝為 H2O和O2[39]。在此過程中，外源硫化氫通過影響植物抗氧化酶體系中細胞膜的極性轉運，并迅速抵達線粒體和葉綠體基質，從而增強抗氧化酶的活力[40]，使達烏里胡枝子幼苗中過量的活性氧被清除，細胞壁結構與功能受到的破壞減少，丙二醛含量降低。這與張雪蒙等[41]在鹽脅迫下番茄幼苗的研究結果相似。

非酶促抗氧化系統主要由抗壞血酸（AsA）、還原性谷胱甘肽（GSH）構成，其中AsA 被稱為天然的非酶類抗氧化劑，在保護植物免受活性氧傷害發揮著重要作用。此外由AsA 和GSH 組成的AsAGSH循環可以有效清除活性氧[42]。胡文成[43]研究水稻（Oryzasativa）發現，在鹽脅迫下AsA-GSH 循環活性會隨著鹽脅迫程度先升高后降低，AsA 可以參與AsA-GSH 循環去參與H2O2 的清除，也可以通過抗壞血酸過氧化物酶當作單線態氧，發生作用并消除活性氧。

4 結論

本試驗探討在鹽脅迫下，施加外源硫化氫對‘晉農1號’達烏里胡枝子幼苗生長特性和抗氧化系統的影響，試驗結果表明，施加100μmol·L-1NaHS顯著緩解了150mmol·L-1鹽脅迫對達烏里胡枝子幼苗生長的抑制作用。外源硫化氫的施加提高了鹽脅迫下達烏里胡枝子幼苗的抗氧化酶活性，抑制了丙二醛合成，降低了相對電導率，延緩膜脂過氧化的發生。綜上所述，施加外源硫化氫減輕了鹽脅迫對植物細胞的傷害，提高了達烏里胡枝子幼苗對鹽的耐受性，同時也提高了達烏里胡枝子的生產性能。