外源赤霉素和褪黑素對三種脅迫下白三葉種子萌發、幼苗生長及生理的影響

關鍵詞：白三葉;外源物質;脅迫;種子萌發;幼苗生長;抗氧化酶活性

白三葉（Trifoliumrepens）是豆科（Fabaceae）車軸草屬（Trifolium ）植物，是一種多年生優良豆科草種，具有持久性強，適應性廣特有點。其可常年固氮，同時，強壯的莖和密集淺根系能夠起到保護土壤的作用，是國內外應用廣泛的牧草和草坪草[1]。近年來，由于大量的不合理灌溉，土壤中巨大的蒸發量會急劇加重了鹽堿化，干旱問題也進一步嚴峻[2]。鹽、堿和干旱脅迫均會抑制白三葉種子萌發和幼苗的生長，導致白三葉成坪速度減緩，品質下降，不利于白三葉的推廣和應用[3]。種子萌發期和幼苗期是植物生長的關鍵時期，且種子萌發和幼苗生長發生在土壤表面，受脅迫程度更高[4]。因此，在種子萌發期和幼苗生長期，緩解植物受到的外界脅迫對植物建植有積極作用。

施加外源物質是改善植物抗性，緩解外界脅迫的有效措施。赤霉素（Gibberellin，GA）和褪黑素（Melatonin，MT）可緩解植物逆境脅迫[5-6]。赤霉素是植物六大內源激素的重要成員，不僅能夠促進植物的種子萌發和莖葉生長，還能有效緩解外界脅迫對植物的影響[7]。噴施一定濃度的赤霉素能夠提高鹽脅迫下紫花苜蓿（Medicagosativa）的抗氧化酶活性，積累滲透調節物質[8]。赤霉素浸種對鹽脅迫下大黃（Rheumpalmatum ）種子的發芽情況和幼苗生長有積極作用[9]。褪黑素是天然的吲哚類化合物，也是一種天然的自由基清除劑，能夠直接清除植物體內產生的活性氧，維持氧化還原動態平衡，對提高植物脅迫耐受性有重要作用[10]。噴施褪黑素能夠提高干旱脅迫下紅小豆（Vignaangularis）葉片中抗氧化酶含量以及滲透調節物質的活性，顯著降低活性氧含量[11]。一定濃度褪黑素溶液浸種對紫花苜蓿種子萌發有促進作用[12]。

赤霉素和褪黑素可提高豆科植物的抗逆性[8，11]，但關于赤霉素和褪黑素緩解鹽、堿和干旱脅迫對白三葉不良影響還鮮有報道。但是，白三葉作為一種優良的牧草和草坪草，有較高的生態和經濟價值[1]，提高白三葉對鹽、堿和干旱脅迫的耐受能力，對擴大其應用范圍具有重要意義。因此，本試驗以白三葉‘瑞文德’為研究對象，分析不同濃度赤霉素和褪黑素對鹽、堿和干旱脅迫下白三葉種子萌發、幼苗生長以及抗氧化酶活性的影響，以期篩選出可有效緩解3種脅迫對白三葉種子和幼苗抑制作用的外源物質及最佳濃度，為白三葉在鹽堿和干旱地區的推廣種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白三葉‘瑞文德’種子，儲藏于東北林業大學園林學院。凈種后種子千粒重為0.702g，含水量為8.88%，發芽率為97.78%。

1.2 試驗方法

用75%的酒精浸泡均勻、飽滿、無損傷的種子3min，用蒸餾水沖洗4次，最后將種子用無菌濾紙吸干待用[13]。將消毒后種子分別按表1外源物質處理進行浸種6h。

采用pH7.0的100mmol·L-1 NaCl（S0）溶液模擬鹽脅迫。用pH8.0的5mmol·L-1 NaOH（A0）溶液模擬堿脅迫。用pH7.0的10% PEG-6000（D0）溶液模擬干旱脅迫。用pH7.0的蒸餾水作為對照（CK）。試驗所用溶液均用蒸餾水配置，用1mol·L-1 HCl和1mol·L-1 NaOH 調節pH。用S代表鹽脅迫，A 代表堿脅迫，D 代表干旱脅迫，G代表赤霉素處理，M 代表褪黑素處理，各處理編號見表1。

發芽試驗采用培養皿濾紙發芽法，培養皿（Φ10cm）中放置兩層濾紙，將濾紙用上述脅迫溶液浸濕，每皿5mL。將浸種后的種子均勻置于其中，每皿50粒。采用光照培養箱培養，設置20℃恒溫，相對濕度75%，光周期12h光照/12h黑暗[14]。共27個處理，每個處理3次重復。

1.3 指標測定

以胚根長達到種子長視為發芽[15]，從種子置皿之日起每隔24h記錄種子萌發個數。在發芽第3天，已基本達到發芽高峰，在發芽第5天，基本沒有新種子萌發，因此，在第3天測定種子發芽勢（Germinationpotential，PG），在第7天測定種子發芽率（Germinationrate，RG）[16]。第7天觀察幼苗生長情況，每個處理隨機取15株幼苗，濾紙吸干表面水分后用天平（0.0001g）測量15 株幼苗的鮮重（Freshweight，FW）。每個處理隨機取9株幼苗，用游標卡尺（0.01mm）測量下胚軸（子葉到胚根基部）長（Hypocotyllength，HL）[17]和胚根（胚根基部到胚根頂部）長（Radiclelength，RL）[18]。發芽率RG、發芽勢PG、發芽指數（Germinationindex，GI）[15]和活力指數（Vitalityindex，VI）[19]計算公式如下：

式中：NG 為第7d發芽種子數，個;N 為供試種子數，個;NN 為第3d發芽種子數，個;Gt 為t 時間內發芽數，個;Dt 為發芽天數，天;RL 為胚根長，mm。

幼苗試驗在穴盤中進行。將種子均勻置于穴盤中（基質為蛭石），進行脅迫處理，使脅迫溶液完全浸透基質，每個處理重復3次，10盆幼苗為一個重復，出芽15d后取樣測定其生理指標。取幼苗葉片測定其抗氧化酶活性，超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）活性采用氮藍四唑法測定[20]，過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性采用愈創木酚法[21]，過氧化氫酶（Catalase，CAT）和活性采用紫外吸收法測定[22]。

1.4 數據分析

數據整理，用SPSS24.0（StatisticalProductandServiceSolutions，IBM，Amonk，New York，USA）分析。采用單因素方差分析（ANOVA）分析數據，用Tukey方法分析平均值之間的差異顯著性。統計圖表由Origin 2021 （OriginLab，Northampton，Massachusetts，USA）制作。

不同處理下種子萌發、幼苗生長和生理指標的綜合評價采用模糊數學隸屬函數法[23]。

2 結果與分析

2.1 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉種子萌發的影響

2.1.1 赤霉素和褪黑素對鹽脅迫下白三葉種子萌發的影響 鹽脅迫會顯著抑制白三葉的種子萌發，與CK相比，發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數在S0處理下分別顯著降低了27.49%，25.01%，43.89%和81.77%（Plt;0.05）（表2）。隨著外源物質濃度的上升，發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數均呈現出先上升后降低的趨勢。在GA 處理下，與S0相比，各項種子萌發指標在20mg·L-1的濃度下均顯著升高（Plt;0.05）。50mg·L-1 GA 處理下，白三葉的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數較S0降低。在MT處理下，與S0相比，發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數在2mg·L-1濃度下均顯著升高，且達到最大值（P lt;0.05）。但12mg·L-1 MT浸種顯著抑制了鹽脅迫下白三葉的種子萌發。

2.1.2 赤霉素和褪黑素對堿脅迫下白三葉種子萌發的影響 堿脅迫會抑制白三葉的種子萌發，與CK相比，發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數在A0處理下均顯著降低，分別降低了21.25%，12.51%，22.24%和45.13%（Plt;0.05）（表3）。隨著GA 和MT濃度增加，各個指標呈現先增加后降低的趨勢。在GA處理下，白三葉發芽勢、發芽指數和活力指數在20mg·L-1 濃度下達到峰值，較A0差異顯著（Plt;0.05）。在MT處理下，白三葉的發芽勢、發芽指數和活力指數在2mg·L-1濃度下達到最大值，較A0差異顯著（Plt;0.05）。在12mg·L-1 MT 濃度下，發芽率較A0降低，但差異并不顯著。

2.1.3 赤霉素和褪黑素對干旱脅迫下白三葉種子萌發的影響 與CK相比，干旱脅迫會對白三葉種子萌發產生抑制作用，發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數在D0 處理下分別顯著降低了21.25%，15.91%，30.83%和69.02%（Plt;0.05）（表4）。隨著GA和MT濃度增加，各個指標呈現先增加后降低的趨勢。在GA 處理下，發芽勢、發芽指數和活力指數在20mg·L-1濃度下達到最大值，較D0差異顯著（Plt;0.05）。在MT 處理下，白三葉的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數在5mg·L-1 濃度下達到最大值，較D0 差異顯著（Plt;0.05）。

2.2 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉幼苗生長的影響

2.2.1 赤霉素和褪黑素對鹽脅迫下白三葉幼苗生長的影響 鹽脅迫處理下，S0的下胚軸長和胚根長較CK顯著降低（Plt;0.05）（圖1）。隨著GA和MT濃度的升高，下胚軸長、胚根長和鮮重均呈現先升后降的趨勢。在GA 處理中，下胚軸長和胚根長在濃度為20mg·L-1時達到峰值，相較S0處理胚根長顯著升高了71.69%（Plt;0.05）。在濃度為10mg·L-1時鮮重達到最大值，較S0顯著升高了93.59%（Plt;0.05）。在MT處理中，下胚軸長在濃度為5mg·L-1時達到最大值，較S0顯著升高了44.37%（P lt;0.05）。濃度為2mg·L-1，胚根長和鮮重最大，較S0 顯著升高了85.68%和92.19%（Plt;0.05）。

2.2.2 赤霉素和褪黑素對堿脅迫下白三葉幼苗生長的影響 堿脅迫對白三葉幼苗生長會產生抑制作用，GA和MT促進了堿脅迫下白三葉幼苗生長（圖2）。下胚軸長、胚根長和鮮重隨著外源物質的濃度增加呈現先升后降的趨勢。在GA處理下，下胚軸長和胚根長在濃度為20mg·L-1時達到峰值，其中下胚軸長較A0顯著升高了63.06%（Plt;0.05）。濃度為10mg·L-1時鮮重較A0顯著升高了39.29%（Plt;0.05）。在MT處理下，下胚軸長、胚根長和鮮重在5mg·L-1濃度下達到最大值，分別顯著升高了60.86%，41.22%和51.07%（Plt;0.05）。

2.2.3 赤霉素和褪黑素對干旱脅迫下白三葉幼苗生長的影響 干旱脅迫會顯著降低白三葉的下胚軸長和胚根長，對鮮重影響較小（圖3）。在GA處理中，下胚軸長和胚根長在濃度為20mg·L-1時下胚軸長和胚根長較D0 分別顯著升高了29.23% 和32.43%（P lt;0.05）。鮮重在濃度為10mg·L-1時較D0顯著升高了33.65%（Plt;0.05）。在MT處理中，濃度為5mg·L-1時，胚根長和鮮重較D0顯著升高了33.31%和44.37%（Plt;0.05）。濃度為2mg·L-1時，下胚軸長顯著升高了38.20%（Plt;0.05）。

2.3 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉幼苗抗氧化酶的影響

2.3.1 赤霉素和褪黑素對鹽脅迫下白三葉幼苗抗氧化酶的影響 GA和MT對鹽脅迫下白三葉的抗氧化酶活性的影響較相似（圖4）。隨著浸種濃度的增加，抗氧化酶活性呈先升后降的趨勢。與S0相比，在GA浸種下，SOD，POD和CAT 活性在20mg·L-1濃度時增幅最大，增長幅度分別為233.48%，131.75% 和221.91%（Plt;0.05）。且各個處理組的抗氧化酶活性均高于S0。在MT 浸種下，濃度為5mg·L-1 時，SOD，POD 和CAT 活性較對照處理顯著升高了182.57%，161.51%和173.02%（Plt;0.05）。

2.3.2 赤霉素和褪黑素對堿脅迫下白三葉幼苗抗氧化酶的影響 堿脅迫會顯著抑制白三葉的抗氧化酶活性（圖5）。隨著外源物質濃度的升高，SOD，POD 和CAT 活性整體上均呈現先升后降的趨勢。在GA處理中，SOD，POD和CAT 活性在濃度為20mg·L-1達到峰值，分別顯著升高了250.24%，133.69%和229.07%（Plt;0.05）。在MT 處理中，SOD 活性在濃度為5mg·L-1時較A0顯著升高了277.26%，POD和CAT活性在濃度為2mg·L-1時達到峰值，其中，POD活性較A0顯著升高了51.69%（Plt;0.05）。

2.3.3 赤霉素和褪黑素對干旱脅迫下白三葉幼苗抗氧化酶的影響 在干旱脅迫下，隨著外源物質濃度的升高，SOD，POD和CAT活性整體上均呈現先升后降的趨勢（圖6）。在GA 處理中，SOD和CAT活性在濃度為20mg·L-1達到峰值，較D0分別顯著升高了235.44%和666.61%（Plt;0.05）。POD活性在濃度為10mg·L-1達到峰值。在MT 處理中，SOD，POD和CAT活性在濃度為5mg·L-1時較D0顯著升高了382.45%，691.30%和511.86%（Plt;0.05）。

2.4 綜合分析

在鹽脅迫下，20mg·L-1 GA浸種對白三葉緩解效果最佳，其次是2mg·L-1 MT，二者的綜合評價值分別達到了7.80和7.04。R1，R3，R8 和R10 在20mg·L-1 GA浸種下隸屬函數值均達到最高（表5）。

在堿脅迫下，20mg·L-1 GA 浸種對白三葉的緩解效果最佳，其次是5mg·L-1 MT，二者的綜合評價值為8.52和7.91。其中R1，R3，R5，R9 和R10在20mg·L-1 GA 浸種下隸屬函數值均達到最高（表6）。

在干旱脅迫下，5mg·L-1 MT 浸種緩解白三葉效果最佳，其次是20mg·L-1 GA，二者的綜合評價值為7.31和6.45。5 mg·L-1 MT 浸種下R1，R7 和R9 的隸屬函數值達到最高（表7）。

3 討論

3.1 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉種子萌發的影響

種子萌發期是植物對環境脅迫較敏感的時期，此時植物對外界環境的響應迅速。鹽、堿和干旱脅迫對白三葉的種子萌發有不同程度的抑制，而施加外源物質能夠提高植物對環境脅迫的耐受性[25]。結果表明施加外源GA 和MT 可促進鹽、堿和干旱脅迫下白三葉的種子萌發。在GA 處理中，10mg·L-1和20mg·L-1 GA 浸種可有效促進鹽、堿和干旱脅迫下白三葉的種子萌發，其中20mg·L-1GA 浸種處理效果優于10mg·L-1 GA。在對黃芪（Astragalusmembranaceus）和紫蘇（Perillafrutescens）種子的研究中也得到了相似的結果。GA3浸種能夠提高鹽和干旱脅迫下黃芪的發芽率，縮短平均發芽時間;GA 浸種能夠顯著提高鹽脅迫下紫蘇的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數[13，26]。GA 促進環境脅迫下植物種子萌發的原因可能是，脅迫條件下種子吸脹受到影響，種子內脫落酸（Abscisicacid，ABA）濃度下調受阻，種子持續處于休眠狀態，而GA 與ABA 具有拮抗作用，能夠打破ABA造成的種子休眠，促進種子萌發[27]。同時，GA 能夠誘導多種編碼水解酶的基因進行轉錄，合成的水解酶能夠促進種子內營養物質分解，維持種內營養物質穩定，保障種子正常萌發[28]。

在MT處理中，2mg·L-1和5mg·L-1 MT浸種顯著促進了鹽、堿和干旱脅迫下白三葉的種子萌發。在對高粱（Sorghumbicolor）‘晉雜2002’和谷子（Setariaitalica）‘邯谷2號’的研究中也有相似結果。一定濃度MT 能夠顯著促進鹽脅迫下高粱的發芽勢和發芽率，也提高了干旱脅迫下谷子的發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數[29-30]。MT促進脅迫下植物種子萌發的原因可能是一定濃度的MT 能夠降低ABA 生物合成基因的表達，提高ABA 分解及代謝基因的表達，調控ABA 的合成，進而緩解環境脅迫[31]。

但50mg·L-1 GA 和12mg·L-1 MT會抑制鹽、堿脅迫下白三葉的發芽勢和發芽率。對萬壽菊（Tageteserecta）的研究結果也顯示，高濃度GA3 在鹽脅迫下嚴重抑制萬壽菊的種子萌發和幼苗生長[32]。造成此現象的原因可能是外源物質能夠調控部分基因，影響細胞的分化及發育;也可能高濃度外源物質造成滲透脅迫，進而抑制種子萌發[33]。

3.2 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉幼苗生長的影響

種子萌發后胚軸和胚根的生長是種子由萌發期向苗期過渡的重要階段，直接關系到幼苗后期的生長發育及其對環境的耐受性[34]。研究發現施加外源GA 和MT 能夠促進鹽、堿和干旱脅迫下白三葉的幼苗生長。10mg·L-1和20mg·L-1 GA 浸種能夠有效緩解鹽、堿和干旱條件對白三葉幼苗生長的脅迫作用。其中20mg·L-1 GA 能夠提高3種脅迫下白三葉的下胚軸長和胚根長，10 mg·L-1GA 浸種能有效提高3種脅迫下白三葉的鮮重。在對堿茅（Puccinelliadistans）的研究中也得到了相似的結果，一定濃度的GA 處理對堿茅幼苗根和莖的生長有促進作用[27]。GA 促進脅迫下植物幼苗生長一方面可能是通過促進細胞生長和細胞分裂引起植物伸長;另一方面可能是其通過提高種子水解酶活性，促進貯藏物質的分解以及種內能量釋放為種子提供養分，進而輸送到新生器官供生長使用，緩解植物受到的脅迫[9]。

2mg·L-1和5mg·L-1 MT 浸種促進鹽、堿和干旱脅迫下白三葉幼苗生長的效果較好。二者均提高了3種脅迫下白三葉的下胚軸長、胚根長和鮮重，但對不同脅迫的緩解效果有差異。其中2mg·L-1 MT浸種對鹽脅迫下白三葉的胚根長和鮮重促進效果最佳，5mg·L-1 MT 浸種對堿和干旱脅迫下白三葉的胚根長和鮮重的促進效果最佳。對春小麥（Triticumaestivum ）‘綿雜麥168’的研究得到了相似結果，MT 能有效緩解鹽脅迫對春小麥根長和胚芽鞘生長的抑制作用[35]。MT 促進脅迫下植物生長的原因可能是外源MT 被代謝為IAA或IAA 促進劑，進而調節植物體內激素水平刺激根系生長，提高植物耐受性[36]。

3.3 赤霉素和褪黑素對不同脅迫下白三葉幼苗抗氧化酶的影響

植物種子萌發和幼苗生長過程中，活性氧的產生和清除一直處于動態平衡。在逆境脅迫條件下，酶和活性氧物質的動態平衡很容易被打破，如果產生的過量活性氧未被及時淬滅，植物的細胞膜將會受到損傷，導致代謝異常[37]。施加外源物質能夠誘導抗氧化酶的高活性來緩解植物受到的脅迫[38]。本研究發現，在3種脅迫下，20mg·L-1 GA 浸種使白三葉的SOD，POD 和CAT 活性均達到了峰值。對紫花苜蓿的研究中有相似結果，GA 處理對鹽脅迫下紫花苜蓿葉片的SOD，POD，抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbateperoxidase，APX），苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanineammonialyase，PAL）和CAT 活性均有較大提升[8]。GA 能夠促進脅迫下植物的抗氧化酶活性可能是由于GA 處理下植物體內的活性氧清除酶活性得到了改善和增強，能夠更有效的清除活性氧，達到緩解外界脅迫的效果[39]。

5mg·L-1 MT浸種有效提高了3種脅迫下白三葉的SOD，POD和CAT 活性。在對小麥的研究中得到相似的結果，MT 能夠提高鹽脅迫下小麥的SOD和CAT活性[38]。MT提高脅迫下植物的抗氧化酶活性的原因可能是外源MT上調了SOD，POD和CAT 的基因表達，緩解外界脅迫導致的抗氧化酶活性降低[40];也可能是MT與活性氧反應也會產生一系列的抗氧化劑，如N1-乙酰基-N2-5-甲酰基-甲氧基犬尿胺、2-羥基褪黑素、環3-羥基褪黑素，可以同植物體內的抗氧化酶共同清除活性氧[41]。

隸屬函數結果顯示20 mg·L-1 GA 和5mg·L-1 MT對白三葉鹽、堿和干旱脅迫下白三葉種子萌發、幼苗生長及抗氧化酶的促進效果較佳。但對黃芪的研究發現100mg·L-1 GA 能夠較好的緩解鹽和干旱脅迫造成的不良影響，對高粱的研究發現100μmol·L-1 MT 緩解鹽脅迫的效果最佳。外源物質緩解外界脅迫的最佳濃度不同可能是由于不同植物對外源激素的敏感性不同。因此，在實際應用外源物質緩解植物受到的外界脅迫時，應選擇適宜濃度的外源物質進行處理。

4 結論

鹽、堿和干旱脅迫均會抑制白三葉種子萌發、幼苗生長以及抗氧化酶活性，在白三葉種子經過不同濃度的GA 和MT 浸種處理后，種子萌發以及幼苗形態和抗氧化酶活性得到了一定的提升。隨著兩種外源物質濃度的增加，各個指標均呈現先升后降的趨勢。通過隸屬函數分析可得，20mg·L-1 GA 浸種緩解鹽和堿脅迫效果最好，5mg·L-1 MT 浸種緩解干旱脅迫效果最好。綜上所述，在不同環境種植白三葉時可以使用不同濃度不同種類的外源物質對種子進行預處理，提高種子對脅迫的耐受性。