網絡毒理學在中藥研究中的應用現狀與思考

謝曉 劉敏 楊敏 劉錢 田佩靈 曾珊 劉濤

收稿日期：2023-04-14

基金項目：四川省2021—2023年高等教育人才培養質量和教學改革項目（JG20211106）；成都大學2021—2023年研究生人才培養質量和教學改革項目（cdjgy2022004 ）

作者簡介：謝曉（2002—），女，從事中藥新藥開發及質量再評價研究.Email：2941207759@qq.com

通信作者：劉濤（1976—），男，博士，研究員級高級工程師，從事中藥再評價研究.Email：liutao0578@sina.com劉敏（1981—），女，從事藥物再評價研究.Email：752544391@qq.com

摘要：網絡毒理學是對中藥多個“成分—靶點—通路”進行分析，從而預測毒性成分和探究毒性機制的方法.近年來，網絡毒理學應用廣泛，對其研究方法和應用現狀進行綜述，并對其面臨的問題進行討論，以期為網絡毒理學在中藥中的進一步應用提供參考.

關鍵詞：網絡毒理學；中藥；應用；毒性機制；毒性成分

中圖分類號：R285

文獻標志碼：A

0引言

網絡毒理學可用于中藥毒性成分的預測和毒性機制的探究.網絡毒理學的提出標志著中醫藥方面的研究在網絡藥理學的基礎上已向生物學和計算機科學等多個學科層面邁進，促進了中醫藥的發展.本文以中國知網、維普資訊和ScienceDirect online數據庫的文獻為基礎，主要對網絡毒理學在中藥領域的研究方法和應用現狀進行綜述，擬為認識學習和深入研究網絡毒理學提供參考依據.

1網絡毒理學簡介

1.1基本定義

網絡毒理學是一種源于網絡藥理學，可以對藥物進行多個“毒性成分—靶點—通路”分析，從而初步揭示藥物毒性機制的研究技術，是一種結合生物學和計算機科學等學科建立毒性預測評價模型，初步闡釋毒理性質的重要方法［1］.網絡生物學和網絡藥理學概念的提出及其相關領域的研究為網絡毒理學的發展提供了全新的思路.為提高中藥的安全性，將網絡藥理學的“疾病（藥物治療對象）—基因—疾病靶點—藥物”相互作用網絡衍生為“毒性（副作用）—基因—毒性靶點—藥物”相互作用網絡，藥理學數據庫轉變為毒理學數據庫，關鍵詞從某種“疾病”變成了某種“毒性（副作用）”，從而產生了網絡毒理學這一毒理學分析模型［2］.網絡毒理學具有研究成本低、臨床試驗成功率高和毒副作用低等特點，可用其解釋中醫藥的內涵，為中醫藥的現代化發展做出一定貢獻［3］.網絡毒理學技術主要運用了分子相互作用技術、網絡可視化技術和高通量/高內涵技術等［4-5］，其發展與網絡藥理學、基因組學、蛋白質組學、代謝組學、轉錄組學和免疫組學等息息相關.

1.2常用研究工具

應用網絡毒理學時離不開各種數據庫、軟件和平臺.網絡毒理學常用的研究工具見表1，研究人員應根據其研究內容的深度和廣度選擇較為合適的數據庫.另外，進行毒性預測的TOPKAT、Hazard Expert和DEREK等軟件，以及化合物致癌毒性預測系統（PSCT）等也是研究人員常用的毒性預測工具［4-6］.

1.3研究思路與方法

網絡毒理學是基于成分、基因、蛋白和通路構建的用于尋找單味中藥或方劑中的有毒成分，并闡述有毒單味中藥或方劑的毒性機制，以及詮釋中藥配伍禁忌的內涵等的方法［2］.網絡毒理學的研究流程主要通過收集化學成分、候選毒性化合物、候選化合物靶點與疾病靶點，構建“成分—靶點—通路”網絡，并進行GO和KEGG分析.值得一提的是，目前尚未有研究表明網絡毒理學具有特有的毒理學靶點.一方面，疾病和毒性（副作用）的靶點會有重合現象，不同毒性成分對應的基因有重疊，而不同基因對應的靶點也可能相同，這與不同數據庫的分析方法有差異相關；另一方面，因為中藥的成分組成較為復雜，且有效成分的臨床使用與量效有密切關系，在兩種不同的藥材中同一種成分可能一個起到治療作用，而另一個會產生毒性反應.簡而言之，靶點是網絡藥理學和網絡毒理學二者通用的，根據不同數據庫、篩選條件和分析目的的選擇可得到相應的結果［2-3］.

1.3.1中藥成分收集

中藥富含多種成分，根據某些毒性反應（副作用）相關的毒性化合物結構的相似性可構建“化合物—化合物”網絡，再加入結構明確的中藥成分進行網絡分析，與已知毒性化合物處于同一組的則為潛在毒性化合物.常用TCMSP數據庫查詢出中藥的所有成分，再以生物利用度OB≥30%及類藥性DL≥0.18的標準進行進一步篩選與該中藥相關度較高的化合物［10］，建立“藥材—成分”數據庫.其次，利用毒理基因組學CTD數據庫以“毒性名稱”作為關鍵詞對TCMSP得出的成分進行毒性查詢，篩選得到候選毒性化合物.

1.3.2毒性靶點篩選

在得到毒性靶點的過程中，可根據實際情況選擇不同的篩選方法.當通過網絡毒理學探究中藥的毒性及其機制時，可采用PubChem數據庫查詢候選毒性成分的代謝物結構，將其作為關鍵詞在Swiss TargetPrediction數據庫中進行搜索，選定物種，得到靶點蛋白和Uniprot ID，以靶點蛋白名稱為關鍵詞在Uniprot數據庫中搜索得到靶點基因［15］.另外，Uniprot數據庫的數據完整性還有待提高，在搜索不到靶點基因時，可結合PharmMapper數據庫進行補充完善.在探究中藥某一特定的毒性類型或疾病類型時，可直接以疾病名稱為關鍵詞在GeneCards或CTD數據庫中進行搜索，根據相關性得分選取大于中位數的毒性靶點［11］.

1.3.3構建蛋白互作網絡

當通過網絡毒理學探究中藥的毒性及其機制時，可利用STRING數據庫建立“成分—靶點蛋白”互作網絡，限定物種為人，得到蛋白互作網絡；而在探究中藥某一特定的毒性類型或疾病類型時，可先用Venny網站獲取候選毒性成分與疾病的交集靶點，再導入STRING中得到“靶點—靶點”互作網絡.

1.3.4GO和KEGG分析

利用STRING數據庫對交集基因進行GO 分類富集分析.分別選擇分子功能、生物學過程和細胞組分分析靠前的結果.使用DAVID工具進行KEGG通路富集分析，使用Omicshare 數據庫將篩選出的KEGG通路信息繪制成氣泡圖，并將所得到的通路均用GraphPad Prism 6.0 繪制柱狀圖［11］.

1.3.5數據可視化

將上述獲得的成分、靶點和通路信息導入Cytoscape3.6.0進行可視化分析，并獲取網絡拓撲參數，根據Degree值，選取大于中位數或大于中位數2倍的數值作為關鍵毒性成分、靶點和通路.

1.3.6數據分析

根據構建的“成分—靶點—通路”對中藥的毒性機制或中藥配伍內涵等進行闡釋.

2應用現狀

中藥一直被認為毒副作用少，療效好，但近年來相關報道發現，中藥無論是單用、配伍或是復方使用都可能對心臟、肝臟和腎臟等產生一定的毒性［1］，網絡毒理學的出現對中藥產生的毒性機制可進行初步闡釋.

2.1在單味中藥中的應用

中藥的作用機制具有多靶點的特點，對其進行毒理機制研究較困難，而網絡毒理學的出現解決了這一難題.目前，網絡毒理學在對單味中藥的毒性成分篩選，以及單味中藥對肝臟、心臟和腎臟等毒性機制探究方面有著廣泛的應用.

僅用網絡毒理學對單味中藥進行探究，研究方法較為單一，數據可信度較低，但可初步解釋毒性機制.例如，李潔等［16-17］篩選出魚腥草6種毒性成分，表明魚腥草可能是通過多信號通路引發過敏反應、抑制中樞神經系統和影響細胞凋亡等產生毒性，大黃主要通過影響鈣離子通道和細胞凋亡產生毒性.另外，梁雨璐等［11］通過網絡藥理學對合歡皮抗焦慮機制與網絡毒理學對合歡皮產生腎毒性機制的研究表明，合歡皮的治療機制與毒性機制相差較大，提出減少毒性成分皂苷類化合物的同時，最大限度地保留木脂素類化合物的臨床應用思路，以此減少合歡皮的腎毒性，又可以保證其抗焦慮藥效.基于網絡藥理學和網絡毒理學的整合研究，衛博文等［18］發現，雷公藤其毒/效機制高度一致，發揮藥效和毒性的成分和靶點都較一致，表明雷公藤既可治療免疫性肝臟損傷也可以產生一定的肝臟毒性，該研究充分闡釋了中藥中“有故無殞”的內涵.

隨著科學技術的發展，網絡毒理學結合多種技術如分子對接、動物實驗、代謝組學、基因轉錄組學、免疫組學和細胞實驗等技術進行驗證，可以更加準確地闡釋中藥毒性機制，又可以評估網絡毒理學的預測水平.

網絡毒理學與分子對接技術結合可很好地驗證中藥毒性成分與毒性靶點的結合活性和相互作用能力，提高數據的可信等級.例如，郭小紅等［19］基于網絡毒理學中的admetSAR 2.0平臺預測鬧羊花中二萜類化合物的毒性，且毒性等級為“Ⅲ”級的有11個，證明毒性成分的官能團是鬧羊花毒性大小的決定性因素，并結合長期毒性試驗和代謝組學研究表明，鬧羊花對肝臟、心臟和神經有較大的毒性，也與相關報道相符，進一步驗證網絡毒理學的準確高效性.此外，楊雪等［20］基于虛擬策略的網絡毒理學方法，初步篩選出商陸皂苷甲為商陸中潛在的腎臟毒性成分，并用蛋白質印跡法和整體動物酶聯免疫吸附劑測定法初步預測其誘導大鼠腎臟毒性的產生與NFκB信號、磷酸化IκBα靶蛋白、下游炎癥因子TNFα和IL1β密切相關.孔嬌等［21］針對八角蓮醇提液所致的肝臟毒性提出“量—權—證”的研究思路，首次將含量納入網絡毒理學靶點篩選，預測出的八角蓮肝臟毒性成分更準確，并且發現八角蓮對肝臟細胞沒有損傷，主要通過調控氧化應激、細胞凋亡和炎癥反應對肝組織有一定程度的損傷.

對利用網絡毒理學探究單味中藥毒性機制較為明確的20余篇文獻進行分析，研究結果見表2，可以發現，中藥產生的毒性主要是肝臟毒性，而表中的幾種毒性機制主要集中在調控氧化應激、炎癥反應、細胞周期和細胞凋亡（又稱程序性死亡）的過程中.肝臟是機體代謝的主要場所，在藥物的臨床使用中出現肝臟毒性的比率較其他毒性較大.因此，肝臟毒性需引起重視，如何更好地完善肝毒性的評價體系是中藥研究中面臨的難題.故可對上述出現頻率較高的機制進行“對癥下藥”，減少藥物的毒性.此外，只有少數研究采用體內外實驗對網絡毒理學分析結果進行驗證，因此，可考慮建立應用網絡毒理學時結合體內外實驗驗證的最低標準，以保證研究結果的質量.

2.2在中藥配伍中的應用

目前，網絡毒理學在中藥配伍中的應用主要是闡述機制，為揭示中藥配伍禁忌起到參考作用.淫羊藿和補骨脂2味藥單用已被證實有一定的肝臟毒性，有研究發現，二者的聯用會加重肝臟毒性，如壯骨關節丸和仙靈骨葆膠囊.淫羊藿和補骨脂除了自身的多個成分具有肝臟毒性外，還通過NLRP3炎癥小體為聯系紐帶，以自身活性成分協同毒性成分誘發NLRP3炎癥小體持續活化.此外，時瀟麗等［37］發現，補骨脂和淫羊藿配伍毒性加劇的機制是通過關鍵毒性成分與核心靶點相互作用與肝臟細胞中部分蛋白氧化磷酸化及相互結合等.

網絡毒理學的應用可解釋中藥配伍減少藥物毒性的原因.研究發現，結合網絡毒理學和藥物動力學得到淫羊藿的毒性成分以黃酮類化合物為主，而淫羊藿和女貞子配伍能夠顯著減少淫羊藿中5種黃酮類成分在體內的富集，可減少其毒性［30］.柴胡中的毒性成分為柴胡皂苷和揮發油，柴胡與甘草、白芍、當歸和黃芩的關聯程度較高，通過網絡毒理學得出共有的肝臟毒性靶點，發現甘草、白芍、當歸和黃芩4味中藥均參與阿爾茨海默病與化學致癌DNA加合物等通路，與PTGS2相互作用密切，這4味中藥常與柴胡配伍“相殺”減輕柴胡的肝臟毒性［38］，上述靶點通路可能是配伍時拮抗肝臟毒性的潛在靶點和通路.通過配伍，2種藥物的共同靶點作用于同一個信號通路但二者的作用相互拮抗，則可以減輕甚至阻斷毒性成分和毒性靶點在共同信號通路的作用，這是減少中藥肝臟毒性的一種思路.

2.3其他應用

網絡毒理學在中藥中的常見研究思路通常為有毒成分的預測，中藥毒性機制的闡述，中藥配伍禁忌理論內涵的解釋，中醫與西醫的相互解釋.由于中藥成分的復雜和網絡毒理學的局限性，對于復方中藥的相關毒性研究結果具有爭議，因此相關研究較少.隨著網絡毒理學在中藥研究中的廣泛應用，可用來區分寒性藥物和熱性藥物.寒性藥物和熱性藥物的關鍵靶蛋白在生物通路、作用疾病及毒理作用上存在差異，林林［39］和梁非［40］通過網絡毒理學發現，促進或抑制細胞的生長率和增殖率相關基因，以及能量代謝相關基因的表達是區分2種藥物的關鍵所在.此外，可通過挖掘單味藥物的藥理作用，并基于單味藥物的藥理作用開展方劑藥理作用研究，以特定疾病為例，用網絡毒理學評估其毒性大小，驗證方劑治療疾病的合理性.

3結語

網絡毒理學研究成本低，涉及學科廣，促進了中藥的發展，在探究中藥毒性機制方面具有重要意義.但網絡毒理學預測毒性成分具有一定的局限性：1）中藥結構不穩定，在配伍或是復方中可能會產生新的物質，而網絡毒理學在探究毒性機制的過程中是將單味中藥的毒性成分和毒性靶點進行篩選后簡單疊加，表明網絡毒理學預測非單味中藥的毒性成分和機制不一定準確.2）目前，有文獻報道，確切毒性成分未出現在網絡毒理學預測的范圍內里，而預測出的某些毒性成分還尚未有文獻研究，因此，需結合后期實驗驗證才能更準確地預測中藥的毒性機制.3）目前，網絡毒理學面臨數據庫不完善、篩選成分標準不統一（且沒有考慮劑型）和數據分析結果不準確等問題，且絕大多數數據庫是國外研發的，國內研發的還比較少.4）利用網絡藥理學篩選出的活性成分并不是中藥材現行標準中的主要質控成分或藥材中含量較高的成分，如何評價和處理這一差異是一難題.同時，網絡藥理學篩選出的部分活性成分存在相似度高的問題［41］.5）網絡藥理學篩選得到的有效成分只能定性，不能體現其在中藥材中的含量，篩選得到的有效成分是否可以在臨床使用中達到“量—效”關系而發揮作用還有待進一步研究.其次，不同部位的藥材成分含量可能不同，比如藥用部位和非藥用部位［41］，在數據庫中不能得以體現.

網絡毒理學單用數據可靠等級較低，同時其以已有數據庫為基礎進行研究，其結果受所用數據庫數據準確性的影響 .因此，對于研究結果，應靈活結合多項技術進行體內與體外試驗進行驗證，從而提高可靠性.將網絡毒理學、質量標志物和代謝組學結合，可更準確地推斷出毒性成分，為中藥的毒性機制和安全性評價提供基礎，此外，可參考于瑞等［42］整理的毒性預測評價模型.利用網絡毒理學研發出更多的新藥，并且提高中藥的安全性是科研人員面臨的難題.目前，“網絡靶標”理論已成為網絡藥理學的核心理論，網絡藥理學解析藥物及治療對象之間的分子關聯規律，其研究理念與中醫藥學的整體論思想不謀而合，被廣泛應用于藥物和中藥活性化合物的發現、整體作用機制闡釋、藥物組合和方劑配伍規律解析等方面，為臨床安全用藥、新藥的研發和中藥復雜體系的研究提供了思路和支撐.相信后續通過網絡藥理學的相關研究思路，對網絡毒理學的研究也更加深入，并逐步解決上述面臨的難題，力爭將網絡毒理學存在的價值發揮到極致，提高中藥的安全性.

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（責任編輯：伍利華）