香蕉HOS15基因的鑒定及枯萎病菌脅迫下的表達分析

摘要：為了研究HOS15（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 15）是否參與香蕉抗性調控過程，利用擬南芥HOS15蛋白序列，采用多種生物信息學分析工具，對香蕉HOS15（MaHOS15）基因進行鑒定；以高抗品種‘南天黃’和易感品種‘威廉斯’為試驗對象，研究MaHOS15在枯萎病菌脅迫下的表達分析及其調控植物病害的潛在機制。結果表明：MaHOS15蛋白中LisH結構域和WD40重復蛋白序列高度保守；MaHOS15蛋白二級結構具有α螺旋、β折疊、延伸鏈和無規(guī)卷曲結構，且以無規(guī)卷曲為主，占比為46.2%；亞細胞定位發(fā)現MaHOS15在細胞核內，推測MaHOS15可能在細胞核內參與香蕉枯萎病的調控；MaHOS15可能響應SA信號通路、MeJA信號通路和脫落酸反應；推測MaHOS15是在植物抗病過程中負調控植物對病原體防御的關鍵基因。

關鍵詞：香蕉；HOS15（MaHOS15）基因；擬南芥HOS15；枯萎病菌；生物信息學；基因表達

中圖分類號：S 668.1文獻標志碼：A

文章編號：1000-5013（2024）03-0351-06

Identification of Banana HOS15 Gene and Expression Analysis Under Stress of Fusarium Wilt

WANG Zishu^1，2，WANG Mingyuan^1，2，CHEN Kelin^1，2，JIA Xingchen^1，2，WEI Jinyi^1，2，RONG Hang^1，2，TANG Yi^1，2

（1. Institute of Horticulture Science and Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China；2. College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

Abstract：In order to study whether HOS15 （HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 15） is involved in the regulation of banana resistance process，the Arabidopsis HOS15 protein sequence is used to identify banana HOS15 （MaHOS15） gene using various bioinformatics analysis tools，and using the highly resistant variety 'Nantianhuang' and the susceptible variety 'Williams' as experimental objects，the expression analysis of MaHOS15 under the stress of fusarium wilt and its potential mechanism of regulating plant diseases are studied. The results show that the LisH domain and WD40 repeat protein sequence in MaHOS15 protein are highly conserved. The secondary structure of MaHOS15 protein has α-helix，β-fold，extended chain and random coil structure，and the random coil is the main structure accounting for 46.2%. Subcellular localization is in the nucleus，which can be supposed thatMaHOS15 may be involved in the regulation of banana fusarium wilt in the nucleus. MaHOS15 may respond to SA signaling pathway，MeJA signaling pathway and abscisic acid reaction. It is speculated that MaHOS15 is a key gene in the negative regulation of plant defense against pathogens in the process of plant disease resistance.

Keywords：banana；HOS15（MaHOS15）gene；Arabidopsis HOS15；fusarium wilt；bioinformatics；gene expression

香蕉廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是非洲、亞洲和美洲5億多人的重要營養(yǎng)來源和主要食物之一^[1-2]。然而，全世界64%的香蕉感染了由香蕉枯萎病菌熱帶4號生理小種（Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4，Foc TR4）引起的香蕉枯萎病，極大限制了香蕉的生產^[3-4]。因此，為了提高枯萎病抗性，識別參與調控枯萎病防御反應的關鍵基因并確定其潛在機制至關重要。

HOS15（HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENES 15）是一種轉錄輔抑制因子。這些轉錄輔抑制因子與其他轉錄因子、適配器和輔助蛋白形成多蛋白復合物，可在表觀遺傳學上抑制靶基因，在植物信號轉導和抗性調節(jié)中起著重要作用^[5-7]。Shen等^[8]發(fā)現HOS15可以與SKP1和Cullin1蛋白連接，并作為SCF（SKP1-Cullin1-F-box）E3復合物底物受體，靶向磷酸化NPR1，從而參與SA信號調節(jié)，協(xié)同抑制防御誘導細胞中轉錄激活的基因，從而分別防止NPR1介導的防御提前激活和過度激活。桃^[9]、小麥^[10]等植物的相關研究表明，HOS15可以參與SA信號調控植物抗病。Lin等^[11]已證實SA信號通路中MaTGA8可能通過與MaNPR11或MaNPR4互作來增強香蕉對Foc TR4的抗性。因此，HOS15作為一種多功能蛋白，可能通過介導SA信號通路，在抗香蕉枯萎病中起著至關重要的作用，而HOS15是否參與香蕉抗性調控過程依然未知。基于此，本文在香蕉基因組數據中BLAST篩選出香蕉HOS15（MaHOS15）蛋白序列，以‘南天黃’葉片為材料，克隆得到MaHOS15基因，并進行生物信息學分析，繼而以高抗品種‘南天黃’（Musa acuminate L. AAA Cavendish，‘Nantianhuang’）和易感品種‘威廉斯’（Musa acuminate L. AAA group cv. Cavendish，‘Williams’）為試驗對象，進一步研究其在枯萎病菌脅迫下的表達分析。

1 材料與方法

1.1 MaHOS15的基因克隆和香蕉‘威廉斯’和‘南天黃’MaHOS15的表達分析

使用高抗品種‘南天黃’和易感品種‘威廉斯’的4片葉齡的組培苗（廣東省高州市石生原生物科技有限公司）。選取長勢一致、4片葉齡的香蕉幼苗，采用蘸根接菌法將‘南天黃’和‘威廉斯’的香蕉根系浸泡在配制好的Foc TR4孢子懸浮液（1×10⁶ cfu·mL^-1）中2 h，移植到基質（草碳土和蛭石以體積比2∶1混合）中進行盆栽（上口徑為15 cm，下口徑為12 cm）。為研究Foc TR4接種后香蕉幼苗根系的變化，在接種后的第0，2，4，6天各選取3株幼苗，剪取根系，混合后迅速置于液氮中保存。

使用DP441型多糖多酚植物核糖核酸（RNA）提取試劑盒（北京市天根生化科技（北京）有限公司）提取‘南天黃’葉片總RNA，將獲得的2 μg RNA使用PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒（日本TaKaRa公司）合成互補脫氧核糖核酸（cDNA）。采用Primer Premier 5.0軟件設計引物，根據MaHOS15 cDNA序列進行引物設計。

試驗的相關引物，如表1 所示。

RT-PCR擴增程序在以下條件下進行：94 °C 5 min，94 °C 30 s，50 °C 45 s，