大豆根瘤菌定向微生態研究與應用

曹軼　崔文靖　馬瑞強

摘要：我國大豆根瘤菌種質資源豐富，但其應用進展緩慢，接種面積僅占全國大豆總種植面積的1%～3%。造成該問題的原因主要是根瘤菌不能產芽孢，其抗逆能力較差，導致產品貨架期短，應用效果不穩定。為實現根瘤菌產品多元化、功能化、差異化，提高產品活性與應用效果，使用定向微生態（directed micro-ecology，DME）體系優化培養策略，實現根瘤菌、芽孢桿菌的定向擴培及應用。通過單因素實驗及響應面法獲得根瘤菌最優培養基（ 25.5 mL·L?1 糖蜜液、15.2 g·L?1酵母膏、pH 6.98），在DME培菌機中使用該配方可以實現根瘤菌（100 L·min?1，20 h） 及芽孢桿菌（ 150 L·min?1，14 h） 菌量50倍以上的擴增，達到（20～50）×108 CFU·mL?1，且雜菌率控制在5%以下。盆栽接種實驗表明，DME擴培菌株接種處理的效果顯著優于實驗室常規培養菌株的同等接種處理，這表明DME培菌機培養的功能微生物應用效果更好。根瘤菌與芽孢桿菌的復配組合可以協助根瘤菌更好地實現其共生功能，具體表現在苗期結瘤數增加、葉綠素含量增加，并且最終的產量與單接種菌株相比也增加了近20%。定向微生態（DME）體系通過定向營養和生長控制，使得目標功能微生物在含有多種微生物的微生態環境中，達到應用級別的產量和純度，實現與純培養菌株相同的功能，對于促進根瘤菌的產業化、加快功能菌株的推廣應用具有重要意義和應用價值。

關鍵詞：定向微生態體系；根瘤菌；芽孢桿菌

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0758

中圖分類號：S182 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）04021510

氮氣是空氣中含量最高的組分，而植物卻無法直接利用，需要固氮作用將分子態氮被還原成氨和其他含氮化合物才可以被植物吸收利用。生物固氮是土壤氮素的主要來源，其中，根瘤菌-豆科作物共生固氮作用固定的氮含量占自然界總固氮量的65%以上[1]，大豆-根瘤菌共生體系最為高效。合理利用大豆根瘤菌固氮體系對于農業生態可持續發展和提高大豆產量具有至關重要的作用。

根瘤菌在國際上已經得到非常廣泛的應用，美國、巴西、阿根廷等多個國家和地區都在生產和應用大豆根瘤菌劑，根瘤菌接種率達到了95%以上，可替代80%～100% 的氮肥，大豆單產在3 000 kg·hm?2以上[2]。我國大豆根瘤菌種質資源非常豐富[34]，但應用進展緩慢，其接種面積占全國大豆總種植面積的1%～3%，且集中在東北地區，大豆產量在2 250 kg·hm?2左右[5]。就大豆根瘤菌應用效果而言，我國利用率較低的原因主要有以下幾點：長期以來過量使用氮肥，造成土壤氮素含量高，而根瘤菌對氮素極為敏感[6]，導致結瘤固氮效率偏低；研發人員偏重關注根瘤菌的固氮效率，而忽略了根瘤菌的抗逆能力及環境適應能力[7]，導致根瘤菌不能在植物根際有效生存和定殖；由于根瘤菌對于不同的大豆品種具有不同的匹配性[8]，這對于我國豐富的土壤類型和大豆品種來說是個挑戰；根瘤菌不能產芽孢，其抗逆能力較差，導致根瘤菌產品貨架期很短[9]，應用效果不穩定。因此，深入了解根瘤菌生長繁殖、共生匹配特性，探索生物工程手段改良作物品種及根瘤菌菌種，優化生產流程，以提高根瘤菌生產效率和應用效果，對于進一步推廣和應用根瘤菌具有重要作用。

提升根瘤菌的產品活性和質量穩定性是維持其穩定高效應用的保障。挖掘高效固氮且抗逆能力優良的根瘤菌菌種有助于實現根瘤菌穩定高效的固氮，提升大豆產量[10]。由于根瘤菌固氮酶需要鐵、鉬這些微量元素，因此根瘤菌搭配這些微量元素可以提升其固氮活性[8]。近年來，越來越多的研究人員利用根瘤菌復合促生菌接種大豆，一方面促進了大豆根瘤菌的結瘤效率，另一方面在促生、生防上也具有積極作用[1112]。

目前，根瘤菌主流的產品形態以液體制劑為主，室溫下貨架期可達到1年[13]。根瘤菌產品貨架期短、使用效果不穩定是制約根瘤菌產業發展的主要因素之一。將微生物產品的生產前置到應用端，實現就地生產就地應用，是解決這一限制因素的方法之一。為了實現微生物產品的就地標準化生產和便捷化操作，綠氮生物科技有限公司（簡稱“綠氮生物”）提出定向微生態（directed microecology，DME）的概念，其原理是在含有目標微生物和多種環境微生物的微生態環境中，通過施加有利于目標功能微生物的定向選擇壓，使其在種間競爭中取得優勢，在特定培養時間內占據微生物群落的主導地位，表現為優勢微生物，且來自環境微生物的污染率低，從而使目標微生物在應用中有效發揮功能。基于DME原理，綠氮生物開發了定向微生態系統，根據應用需求確定目標功能微生物（功能模塊，function， F），確定與之相匹配的定向培養基（營養模塊，nutrition， N）與工藝模型（工藝模塊，process， P），通過定向微生態培菌機（生產模塊，production， P）實現目標功能微生物的就地標準化生產和應用。通過串聯這4大模塊建立“FNPP”循環，實現定向微生態應用體系的迭代升級。

本研究針對大豆根瘤菌在大豆種植上的應用，對大豆根瘤菌的擴培硬件設備、培養策略與應用效果進行評估。為定向微生態（DME）系統在農業微生物上的應用提供理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大豆根瘤菌菌株為黃淮海優勢菌種Sinorhizobium fredii GN85 （宿主為齊黃34），由本實驗室保存。枯草芽孢桿Bacillus subtilis GN125、貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis GN138、地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis GN263分離自山東圣豐種業科技有限公司試驗田，兼具促生及生防功能。

1.1.2 主要試劑和儀器

糖蜜液購自武漢京世達實業有限公司，酵母粉和酵母膏購自安琪酵母股份有限公司。定向微生態培菌機（DME-05），綠氮生物；顯微鏡（BK6000），重慶奧特光學儀器有限公司；恒溫搖床 （MQD-B1T），上海旻泉儀器有限公司；恒溫培養箱（LHS-70SC），無錫瑪瑞特科技有限公司；便攜式葉綠素儀（SPAD-502PLUS），日本柯尼卡美能達株式會社。

定向微生態菌培機包括溫控元件、加熱及降溫模塊、攪拌電機、氣泵及濾菌膜、自動投料菌盒等，溫度控制范圍25～95 ℃，轉速、通氣量均可定量調控，主要參數如表1所示。

1.1.3 培養基

根瘤菌培養基活化及種子液制備均采用TY 培養基（1 L）：蛋白胨5 g、酵母粉3 g、CaCl2 0.6 g，pH 7.0。

芽孢桿菌培養基活化及種子液制備均采用LB培養基（1 L）：胰蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl10 g，pH 7.0。

MY0培養基（1 L）：10 mL糖蜜液，酵母膏5 g、酵母提取物3 g、K2HPO4 0.3 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaC1 0.1 g、KNO3 0.8 g、MnSO40.01 mg、FeCl3 0.01 mg，初始pH 7.0。

1.2 菌株活化及種子液制備

用滅菌竹簽蘸取S. fredii GN85菌液，在TY固體培養基上劃線，于恒溫培養箱中28 ℃倒置培養。挑取單菌落接到5 mL液體培養基中，28 ℃、180 r·min?1再培養2～3 d，按5% （體積分數）接種量轉接到200 mL液體培養基中，28 ℃、180 r·min?1，振蕩培養至OD600 3.0左右。

1.3 菌量計數

采用稀釋平板計數法計算活菌數，將根瘤菌種子液進行10?1～10?7梯度稀釋，選擇合適稀釋梯度吸取100 μL進行TY固體平板稀釋涂布，恒溫培養箱內28 ℃倒置培養3 d計數并計算最終菌量。

1.4 單因素實驗設計

以根瘤菌為材料，以MY0培養基作為出發培養基，探索碳源（糖蜜液）、氮源（酵母膏）及pH對擴培有效活菌數的影響，所有實驗均在搖瓶內進行。

糖蜜液含量分別設定為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（體積分數），其他培養基組分保持不變，將初始pH 調整為7.0。28 ℃、180 r·min?1，培養2 d對發酵液進行計數，以確定碳源對最終菌量的影響并獲得最佳糖蜜液含量。

將酵母膏含量分別設定為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（質量體積分數），糖蜜液按照最佳添加量，初始pH7.0，28 ℃、180 r·min?1，培養2 d對發酵液進行計數，以確定最佳酵母膏含量。

設置pH 6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，糖蜜液和酵母膏按照最佳添加量，28 ℃、180 r·min?1，培養2 d對發酵液進行計數，以確定最佳pH。

1.5 響應面優化培養基配方

利用Design Expert v13.0.1.0 進行響應面分析。以糖蜜液含量、酵母膏含量、pH 作為自變量，以有效活菌數作為響應值，設計3 因素3 水平（表2）的響應面分析試驗，優化培養基配方。

1.6 DME 培菌機擴繁菌株的應用效果驗證

1.6.1 DME 培菌機通氣量和培養時間的確定

為研究DME培菌機通氣量和培養時間對擴繁菌株的影響，設置50、100、150 L·min?1 3個通氣量，根瘤菌設置20、40 h 2個培養時間，芽孢桿菌設置14、20 h 2個培養時間，以確定最佳培養條件，利用優化后的MY0最優培養基和培養時間對根瘤菌和芽孢桿菌分別進行擴大培養。MY0最優培養基（1 L）：25.5 mL 糖蜜液、15.2 g 酵母膏、K2HPO4 0.3 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaC1 0.1 g、KNO3 0.8 g、MnSO4 0.01 mg、FeCl3 0.01 mg，pH 6.98。DME培菌機裝液量45 L，滅菌溫度設置為90 ℃，維持10 min。待降溫至30 ℃后，分別接種根瘤菌和芽孢桿菌種子液200 mL （100×108 CFU·mL?1），使得初始菌量在0.2×108 CFU·mL-1。轉速180 r·min?1，培養溫度30 ℃。稀釋涂布后計算活菌數，并統計非根瘤菌或非芽孢桿菌數在總菌數所占比例。

1.6.2 大豆生長實驗

供試大豆品種為齊黃34，由山東圣豐種業科技有限公司提供。根瘤菌實驗室常規培養菌液制備參照1.2。芽孢桿菌實驗室常規培養流程如下：將芽孢桿菌接種于LB固體培養基上，30 ℃恒溫倒置培養；培養2 d 后轉接到5 mL液體培養基中，20 ℃、200 r·min?1再培養1 d天，按5% 接種量轉接到200 mL 液體培養基中，28 ℃、200 r·min?1，培養1 d即獲得到種子液。根瘤菌及芽孢桿菌DME培菌機發酵流程參照1.6.1進行。根瘤菌活菌數調整為6×106 CFU·mL?1，芽孢桿菌統一調整為2×106 CFU·mL?1通過室外土壤盆栽實驗檢測DME培養菌的應用效果。以尿素作為氮源，設置完全無氮（0 N）、80%氮（80%N）及全氮（100%N，霍格蘭營養液的氮素水平）3個氮素水平不接菌的處理為對照。在80%N條件下進行接菌實驗，設置只接根瘤菌處理（GN85）、以及接根瘤菌+枯草芽孢桿菌（GN85+GN125）、根瘤菌+貝萊斯芽孢桿菌（GN85+GN138）、根瘤菌+地衣芽孢桿菌（GN85+GN263）共4 個處理。每個處理9 盆，3 個重復（每個重復3盆），每盆5棵大豆；在大豆出芽一周后用移液器接種施菌，每株接種總量5 mL（2種菌處理的各接種2.5 mL）。45 d后統計表型數據，葉綠素使用便攜式葉綠素儀（SPAD-502PLUS）進行測定，根瘤數待根沖洗干凈后直接摘取計數。

此外，實驗室條件下MY0常規培養的根瘤菌及芽孢桿菌菌株進行同等條件的復配及接種，與上述處理對應，設置只接根瘤菌的處理（GN85lab），以及接根瘤菌+枯草芽孢桿菌（GN85+GN125lab）、根瘤菌+貝萊斯芽孢桿菌（GN85+GN138lab）、根瘤菌+地衣芽孢桿菌（GN85+GN263lab）的處理。

1.7 表型測定

自下往上選取第1片三葉復葉，使用便攜式葉綠素儀（SPAD-502PLUS）測定葉綠素含量，重復3次取平均值作為該處理的葉綠素含量，每盆所有植株的葉綠素含量的平均值表征一盆處理的平均葉綠素水平。根瘤數待根沖洗干凈后直接摘取計數，每盆所有植株的根瘤數的平均值表征一盆處理的平均結瘤水平。收獲期收集所有豆莢，對每株的豆莢進行烘干處理，之后收集種子，將其水分控制在8%以下即可，以大豆種植密度約30萬株·hm?2計算理論產量（kg·hm?2）。

理論產量=大豆種植株密度×單株均產量（1）

1.8 數據分析

實驗數據作圖采用GraphPad軟件，采用SPSS軟件進行ANOVA單因素方差分析和t 檢驗。

2 結果與分析

2.1 培養基碳源、氮源、pH 對根瘤菌生長的影響

為了最大化培養目標菌株根瘤菌，對根瘤菌培養配方的碳、氮源和pH進行單因素試驗。單因素實驗均呈單峰曲線，表明設置的范圍包含最適條件，隨著糖蜜液、酵母膏添加量及pH的增加，根瘤菌有效活菌數呈現遞增趨勢，超過最佳值后有效活菌數呈下降趨勢（圖1）。糖蜜液的最適添加量為2.5%，S. fredii GN85最大活菌數約為45×108CFU·mL?1，添加量過高或過低都會影響最終的活菌數；酵母膏的最適添加量為1.5%，GN85的最大活菌數約為40×108 CFU·mL?1；起始pH 為7.0 時，GN85 達到最大活菌數，約為42×108 CFU·mL?1。綜合來看，實現培養達到最大的活菌數，需要調整合適的糖蜜液、酵母膏添加量及初始pH，這些數值過高或過低均會對最終活菌數有較大影響。

2.2 根瘤菌MY0 培養基配方優化結果分析

培養基配方優化實驗結果表明，因素間不同水平的組合對于最終的有效活菌數有著較大差異，有效活菌數最低為29×108 CFU·mL?1，最高為53×108 CFU·mL?1。通過回歸分析對表3實驗數據進行擬合，得到二階多項式方程模型。

Y=41+4.85A+1.88B+1.25C+1.25AB-BC-1.63A2-2.13A2-8.88B2 （2）

式中，Y 表示最終有效活菌數，A 代表糖蜜液，B 代表酵母膏，C 代表pH。

該模型經ANOVA檢驗了二次回歸方程擬合的顯著性（表4）。F 值為20.71，P 值為0.037 1（<0.05），表明二次回歸方程顯著。失擬項P 值為0.399 9 （>0.05），表明不顯著，模型適當。模型回歸系數（R2）為0.932 2，調整后的決定系數（RAdj2）為0.901 6，表明該模型具有較高的顯著性。

最后，利用響應面法進一步分析3個因素在最終有效活菌數上的相互作用及其最佳水平，三維響應面曲線和相應的等高線圖如圖2所示。結果表明，糖蜜液、酵母膏、pH間的相互作用都較強。根據響應面分析，當糖蜜液、酵母膏用量和pH分別為25.5 mL·L?1、15.2 g·L?1和6.98時，預測有效活菌數的最大值為48.28×108 CFU·mL?1。

2.3 根瘤菌及芽孢桿菌在DME 培菌機上的擴培測試

從圖3A可以看出，在不同培養時間，通氣量較好的是100 L·min?1，且根瘤菌培養40 h的有效活菌數明顯高于培養20 h的有效活菌數；盡管40 h有效活菌數較高，為（30～40）×108 CFU·mL?1，但其污染率卻高達10%～30%，隨著通氣量的增加污染率顯著遞增，而培養20 h 的污染率均可以控制在4% 以下。因此，對根瘤菌而言，通氣量控制在100 L·min?1，培養時間控制在20 h，可以達到高純度擴培菌株的要求。

此外，還以根瘤菌最優培養基為基礎測試了3株兼具促生、生防功能的芽孢桿菌的擴培效果（圖3B）。結果發現，3株芽孢桿菌均在14 h達到最大有效活菌數，為（20～30）×108 CFU·mL?1，而20 h的培養時間下其有效活菌數均顯著降低，降低至10×108 CFU·mL?1以下。3株芽孢桿菌在14 h培養時間內，隨著通氣量的增加其有效活菌數也顯著提升；培養20 h有效活菌數較低，且其污染率在10% 左右，通氣量的增加同樣也會提升污染率，而培養14 h的污染率均可以控制在5%以下。因此，對于芽孢桿菌言，通氣量控制在150 L·min?1，培養時間控制在14 h，可以達到高純度擴培菌株的要求。

綜合來看，根瘤菌及芽孢桿菌在合適通氣量及培養時間下均可以實現50倍以上的擴增，且污染率控制在5%以下。

2.4 DME 培菌機在功能微生物上的應用測試

為了驗證DME培菌機擴培后的功能微生物的應用效果，設計大豆盆栽實驗，采集苗期數據及收獲期數據來進行驗證，結果如圖4所示。

可以看出，實驗室常規培養菌株（標記lab）與DME培菌機擴培菌株應用效果無顯著差異，表明DME培菌機擴培菌株可以實現實驗室常規培養菌株的正常功能，表現在最終的產量無顯著性差異。相比于0 N、80%N、100%N不接菌處理，80%N接種根瘤菌GN85顯著提升了結瘤數，其中根瘤菌復合枯草芽孢桿菌是所有菌株處理中顯著促進結瘤的，并且葉綠素含量高于100%N處理。值得注意的是，定向微生態擴培菌株的接種處理顯著性地優于實驗室常規培養菌株的接種處理。此外，通過對最終的單株均產及理論產量計算發現，0 N處理有著最低的產量，與苗期數據類似，根瘤菌復合枯草芽孢桿菌依然是所有菌株處理中產量提升最顯著的，并且定向微生態菌液復合處理相比于實驗室常規培養菌液復合處理對產量有一定提升，而其他菌株處理與100%N、80%N處理間無顯著性差異。

綜合看來，DME培菌機對于菌株的功能發揮優于實驗室常規培養接種處理，并且GN85+GN125的復配組合不僅促進苗期結瘤固氮，對最終的產量也具有顯著的提升作用（約20%）。

3 討論

一般來說，實驗室條件下單一功能微生物有時會有不錯的表現，如單一大豆根瘤菌劑的使用可以顯著減少氮肥施用、增加大豆產量[14]。但在根瘤菌的實際應用中，實驗室可控條件下的促生表型并不能在大田得到較好的復現[15]，這表明根瘤菌功能的穩定性普遍較差。為了提升特定功能微生物的表現穩定性，應對復雜多變的土壤環境，采用復合微生物（微生態制劑）的手段往往能起到更穩定的輸出效果[1516]。本研究運用DME系統實現大豆根瘤菌等農業功能微生物的定向擴培，并且表現了優于實驗室常規培養菌株的應用效果。推測原因是由于DME培菌機并非嚴格的純菌擴培，其較低含量的非目標微生物可能對于提升根瘤菌、根瘤菌-芽孢桿菌菌劑功能穩定性具有促進作用，具體原因有待進一步研究分析。

除此之外，導致農業微生物菌株（尤其是非芽孢類菌株）功能難以發揮、實驗室表現難以復現的另一主要因素是其產品貨架期太短，以致終端用戶使用時有效活菌數急劇下降，應用豐度太低，無法產生種群優勢。針對這一難題，盡管已經有大量的研究結果表明，添加保護劑可以有助延長功能微生物液體或固體劑型產品的貨架期[17]，但由于成本偏高，其延長效果不足以支撐商業化落地，也有一些產品型態雖然成本可控但施用方式不友好，例如草炭吸附等，不能用于噴施等菌劑添加方式[18]。DME通過定向營養和生長策略的控制，使得目標功能微生物在含有多種微生物的微生態環境中，達到應用級別的產量和純度，實現與純培養菌株相同的功能。本研究對于解決非芽孢類功能微生物貨架期短、應用效果不穩定的問題具有積極意義，借助DME 應用系統可以做到“現培鮮用”，無需耗費過多資源去研究延長農業微生物產品的貨架期。在本研究中，運用DME系統可以實現目標功能微生物的標準化擴培，并將污染率控制在5%以下，實現農業微生物產品的就地生產和應用，保證功能菌株使用時，仍具有較高有效活菌數。這不僅有效解決了農業微生物產品（尤其是非芽孢類菌株，如根瘤菌）貨架期短的劣勢，保證了應用效果，更是規避了工廠化大規模發酵生產，以及繁瑣的無菌操作流程。類似地，美國Pivot Bio公司委托3Bar Biologics公司開發出兼性厭氧固氮菌便攜式發酵系統，能實現每天每毫升2億菌量的擴增，完成活菌遞送系統的搭建 （https：//www.3barbiologics.com/）。綜合來看，DME系統對于打通我國農業微生物基礎研發與產業發展，降低功能微生物的產業化門檻，加快功能菌株的推廣應用，對于推動我國農業微生物產業的健康發展具有重要意義。

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（責任編輯：溫小杰）