Wus2和IPT轉基因番茄類愈傷組織的轉錄組分析

何鑫鑫，黃家權

摘? ? 要：以AC（Ailsa Craig）番茄為材料，采用Fast-TrACC（fast-treated agrobacterium co-culture）農桿菌轉化體系，利用RNA-Seq測序和熒光定量PCR技術，比較了轉化DRs（Wus2和IPT）形成的類愈傷組織與普通下胚軸之間的基因表達差異?；虮磉_結果分析表明，有60個差異表達基因在激素信號轉導通路中富集，其中上調表達基因34個，下調表達基因26個；體細胞胚形成關鍵基因ECP63、AGL15、FUS3、ABI3、WUS和CUC2上調表達超過4倍；ENOD93和CKX2基因在類愈傷組織中的表達量上升超過1000倍，前者編碼早期結瘤素蛋白ENOD93，后者編碼細胞分裂素氧化酶2，用于催化細胞分裂素的降解，參與氮同化和光合作用的基因低表達。研究結果可為深入解析番茄類愈傷組織發生的分子機制和發掘關鍵調控基因奠定基礎，為番茄活體體內轉化提供理論依據。

關鍵詞：番茄；植物內轉化；RNA-Seq；類愈傷組織；發育因子

中圖分類號：S641.2 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-027-10

Transcriptome analysis of transgenic tomato callus tissues from Wus2 and IPT

HE Xinxin， HUANG Jiaquan

（School of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University/Sanya Nanfan Research Institute of Hainan University， Sanya 572025， Hainan， China）

Abstract： AC（Ailsa Craig）tomato （Solanum lycopersicum L.） was used as the experimental material and the Fast-TrACC（fast created Agrobacterium co culture）Agrobacterium transformation system was used in this study. RNA-Seq sequencing and fluorescence quantitative PCR technology were used to compare the gene expression differences between the callus-like tissues formed after transforming DRs（Wus2 and IPT）and the common hypocotyls. The analysis of gene expression results showed that 60 differentially expressed genes were enriched in the hormone signal transduction pathway， including 34 upregulated genes and 26 downregulated genes. The key genes for somatic embryo formation， ECP63， AGL15， FUS3， ABI3， WUS， and CUC2， are upregulated by more than 4-fold expression; the expression levels of ENOD93 and CKX2 genes in callus-like tissues increased by more than 1000 times. The former encodes the early nodulin protein ENOD93， while the latter encodes cytokinin oxidase 2， which catalyzes the degradation of cytokinin. Low expression of genes involved in nitrogen assimilation and photosynthesis. The research results can lay a foundation for a better understanding of the molecular mechanism of tomato callus-like tissues formation and the discovery of key regulatory genes， providing a theoretical basis for tomato in plant transformation.

Key words： Tomato; In-planta transformation; RNA-Seq; Callus-like tissue; Development regulators

遺傳轉化是分析基因功能的重要手段，也是獲得新材料的重要途徑。根癌農桿菌介導的遺傳轉化是植物中應用最為廣泛的遺傳轉化方法[1-2]，根癌農桿菌能夠侵入植物細胞并將攜帶外源基因的T-DNA整合到植物基因組中遺傳給后代，實現外源基因的遺傳轉化。通常，根癌農桿菌介導的遺傳轉化需要與植物組織培養結合，耗時較長，步驟多，基因型依賴且影響轉化效率的因素較多。植物內轉化能減少或避免外源植物激素的使用，減輕植物細胞的傷害及變異，提高轉化效率，擴大受體系統的應用范圍，并能確保引入的基因更好地適應環境，在植物中穩定表達，因此該方法近年來已成為研究的熱點。但是對大部分植物而言，植物內轉化仍存在轉化效率不高、受植物生理狀態影響和可重復性差等問題。

研究發現，一些植物發育調節因子（developmental regulators，DRs），如WUSCHEL（WUS）、ISOPENTYLTRANSFERS（IPT）、BABY BOOM（BBM）、STM、WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1（WIND1）的表達能夠誘導特定的發育程序，從而決定分生組織的分化方向。WUS在分生組織干細胞中心表達，能維持干細胞活性，保持干細胞處于未分化狀態。WUS轉錄因子能通過胞間連絲移動到干細胞中[3]，調節目標位點的組蛋白乙?；?，控制生長素信號傳導和反應途徑，使生長素在局部積累并啟動細胞分化[4]。WUS的同源基因Wus2編碼一種同源異型結構域蛋白，參與頂端分生組織的維持[5]。Wus2能直接誘導高粱、玉米、煙草等植物體細胞胚的形成和再生[6-8]。IPT編碼的IPT酶是一種異戊烯基轉移酶，能夠催化異戊烯基焦磷酸和單磷酸腺苷分解產生異戊烯基單磷酸腺苷。IPT酶被認為是高等植物細胞分裂素生物合成的限速酶[9]，在植物芽形成中起關鍵作用。在蘋果中過表達MdIPT1可使其愈傷組織在缺乏細胞分裂素的培養基上保持活力[10]。擬南芥的3個IPT基因家族成員（AtIPT7、AtIPT8和AtIPT9）均可促進胚性愈傷組織形成和芽再生[11-12]。Maher等[8]利用雙生病毒載體，高表達不同的DRs組合，通過分生組織從頭誘導的方式實現了煙草幼苗的植物內轉化，并將外源基因傳遞給了下一代。然而，DRs促進類愈傷組織形成以及芽分化的分子途徑還不清楚。在本研究中，以番茄為材料，通過轉錄組測序分析研究了類愈傷組織中基因的差異表達，以探究在DRs表達的條件下類愈傷組織形成的機制，為進一步提高植物內轉化效率和實現多種作物的植物內轉化提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 番茄材料是Ailsa Craig（AC），由海南大學陳銀華老師贈予，本課題組（熱帶特色果樹團隊）留種擴繁。

1.1.2 其他材料 載體pMKV057在Daniel Voytas實驗室購買，其T-DNA區域攜帶菜豆矮縮病毒（bean yellow dwarf virus）復制子，用于表達 FireKy Luc+、Wus2和IPT。大腸桿菌GV3101在上海唯地生物技術有限公司購買。FireKy Luc+的引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成，正向引物序列為 5'- GAGATACGCCCTGGTTC -3'，反向引物序列為 5'- GCGGTTGTTACTTGACTGG -3'，2個引物間的片段長度為1434 bp。細菌質粒的DNA用SanPre Column PlASmid Mini-Preps Kit（生工生物工程股份有限公司）提取，番茄DNA用SteadyPure通用型基因組DNA提取試劑盒（艾科瑞生物工程有限公司）提取。

1.2 方法

試驗時間為2021年9月至2024年6月，地點是海南大學農科樓東副南樓311實驗室。

1.2.1 番茄轉化方法 將450粒番茄種子在清水中浸泡20 min，50 ℃恒溫水浴30 min，4 ℃靜置5 h。然后用70%酒精消毒1 min，清水清洗4次，在超凈臺上用8%的次氯酸鈉消毒10 min，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸去種子表面多余的水分后，接種于1/2 MS固體培養基（pH 5.7）上（圖1-A），25 ℃暗培養3 d，然后轉移至光照培養箱（25 ℃，濕度70%，16 h/8 h光暗周期），種子約1周萌發。

用含有目的基因的質粒轉化根癌農桿菌GV3101并驗證后，將根癌農桿菌涂布于含有3種抗生素（50 mg·L-1 kan、50 mg·L-1 rif、40 mg·L-1 gent）的YEB平板上，28 ℃暗培養1 d。收集菌體，重懸于AB∶MES（3 g·L-1 K2HPO4，1 g·L-1 Na2HPO4，1 g·L-1 NH4Cl，0.31 g·L-1 MgSO4·7 H2O，10.66 g·L-1 MES，20 g·L-1葡萄糖，0.1491 g·L-1 KCl，0.0111 g·L-1 CaCl2，0.0015 g·L-1 FeSO4，pH 5.7）溶液中，加入200 μmol·L-1乙酰丁香酮（AS），使菌液OD600=0.3，28 ℃搖菌過夜。離心收集農桿菌，重懸于含AB∶MES和1/2 MS的（1∶1，V/V）的混合液中，加入200 μmol·L-1的AS和0.01%的Silwet L-77，使工作菌液OD600=0.10～0.18。

選擇400株具有2片子葉的番茄無菌苗，浸泡在含有工作菌液的150 mL錐形瓶中，輕輕搖晃15 min，倒掉多余液體后，將番茄苗放置在25 ℃培養箱中暗培養2 d（圖1-B）。用無菌水沖洗番茄苗，無菌濾紙擦干，挑選子葉完整的100株番茄苗，移至裝有1/2 MS選擇培養基（含有300 mg·L-1特美汀，150 mg·L-1頭孢霉素）的組培瓶中，3次重復，每個組培瓶中5株番茄苗，放置在光照培養箱中（25 ℃，濕度70%，16 h/8 h光暗周期），每周更換1次培養基。2周后，番茄幼苗下胚軸膨大，形成類愈傷組織（圖1-C），這時大部分類愈傷組織保持不分化的狀態，小部分類愈傷組織分化出芽。將不定芽切下轉移至新的1/2 MS培養基上，放在光照培養箱中培養，每2 d繼代1次。部分芽能正常生長（圖1-D）。

1.2.2 轉基因陽性植株的驗證 隨機選擇3株轉化后的番茄，按照DNA提取試劑盒的說明步驟提取其類愈傷組織的DNA進行PCR鑒定，陽性對照為提取的含目的基因的根癌農桿菌質粒，陰性對照為不含目的基因的根癌農桿菌侵染后的番茄下胚軸。PCR 反應體系為10 μL，包括2 μL ddH2O、5 μL 2×Rapid Taq Master Mix、1 μL上游引物、1 μL下游引物和1 μL提取的DNA。PCR的反應程序如下：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s、48 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s為1個循環，進行30個循環；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.3 轉錄組學測序分析 對照組為不含目的基因的根癌農桿菌侵染后的番茄下胚軸，處理組為含目的基因的根癌農桿菌侵染后的番茄下胚軸長出的類愈傷組織，每個處理3個樣本，每個樣本0.8 g（大約20株番茄可收集0.8 g類愈傷組織），共6個樣本。RNA-Seq測序在北京諾禾致源技術股份有限公司進行。用hisat2將clean data比對至番茄基因組Solanum lycopersicum ITAG 5.0，選擇 FDR<0.05和|log2（fold change）|≥1作為篩選差異表達基因的（differentially expressed gene，DEG）條件。用OmicShare云平臺工具（https：//www.omicshare.com/tools）對差異表達基因進行GO（Gene Ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析。

1.2.4 熒光定量PCR 選擇13個差異表達基因進行RT-qPCR（quantitative real-time PCR）驗證，以番茄中的SAND基因作為內參基因，因為其在莖中的表達比TIP41、Actin、CAC和Expressed穩定[13]。每個基因的定量分析設置3次重復，采用相對定量2-ΔΔCt法分析結果。將轉錄組測序用到的RNA通過逆轉錄試劑盒PrimeScriptTM 1st stand cDNA Synthesis Kit（Takara）合成cDNA第一鏈，然后在MA-6000實時熒光定量儀上進行qRT-PCR。qRT-PCR反應體系為20 μL，包括10 μL 2×SYBR real-time PCR premixture、0.4 μL 10 μmol·L-1上游引物、0.4 μL 10 μmol·L-1下游引物、1 μL cDNA和8.2 μL RNase free ddH2O。qRT-PCR的反應程序如下：95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火和延伸30 s，進行40個循環。

1.2.5 數據分析 每100株轉化后的番茄為1個重復，共3個重復，采用完全隨機試驗設計。試驗數據用單因素方差分析，用鄧肯新復極差法進行處理間的顯著性分析，數據處理軟件選用DPS 6.5.5.8，圖片制作采用Excel 2021、GraphPad Prism 8和Microsoft PowerPoint 2021。

類愈傷組織誘導率/%=產生類愈傷組織的株數/總株數×100；平均每株類愈傷組織數量=類愈傷組織數量/產生類愈傷組織的株數；不定芽分化率/%=分化出的不定芽數量/類愈傷組織數量×100。

2 結果與分析

2.1 番茄類愈傷組織的誘導率及不定芽分化率

由圖2可知，番茄與根癌農桿菌共培后，前35 d的類愈傷組織誘導率、平均每株類愈傷組織數量和不定芽分化率，都隨時間的延長而增高。番茄的類愈傷組織誘導率在14～21 d期間升高最快，第21天的類愈傷組織誘導率為77.98%，第28天和第35天的類愈傷組織誘導率雖然有略微增長，但總體趨于平穩（圖2-A）。平均每株番茄的類愈傷組織數量也逐漸增加（圖2-B）。雖然類愈傷組織誘導率較高，但不定芽分化率較低，第14天、第21天、第28天和第35天的分化率分別為0.29%，1.94%，7.30%和10.74%（圖2-C）。

2.2 轉化組織的檢測

為了檢測這些類愈傷組織是否含外源基因，提取了3個類愈傷組織的DNA和1個不含目的基因的根癌農桿菌侵染后的下胚軸DNA，以其為模板對FireKy Luc+基因進行PCR檢測。結果顯示，3個類愈傷組織都有1434 bp目的條帶，而陰性對照中沒有對應的目標條帶（圖3）。這表明類愈傷組織可能是基因轉化后的產物。

2.3 基因差異表達分析

為了探究外源基因Wus2和IPT對番茄類愈傷組織形成的影響，對處理組（類愈傷組織）和對照組（下胚軸）進行了轉錄組測序分析。在得到的4928個差異表達基因中， 2676（54.30%）個基因表達上調，2252（45.70%）個基因表達下調（圖4）。

2.3.1 差異表達基因GO分析 對差異表達的基因進行GO分類以及富集分析，發現在生物學過程中，DEGs在代謝過程、細胞過程和單有機體過程富集最多；在細胞組分中，DEGs在細胞膜、細胞和細胞區域富集最多；在分子功能中，DEGs在結合和催化活性過程富集最多（圖5）。

2.3.2 植物激素信號轉導 植物激素信號轉導路徑的分析結果表明，植物內源激素廣泛參與類愈傷組織的形成過程（圖6）。富集到激素信號轉導通路的差異基因共有60個，其中上調表達基因34個，下調表達基因26個。

2.3.3 差異表達基因KEGG pathway分析 對DEGs進行KEGG通路富集分析的結果表明，差異表達基因在代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、光合作用、光合作用-天線蛋白、光合生物的固碳作用、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、碳代謝、氮代謝、DNA復制、植物病原體相互作用，以及萜、哌啶和吡啶生物堿的生物合成通路上顯著富集（圖7）。還發現SlCAB、SlLHCA、SlLHCB、SlNPF、SlGS2和SlCYCB在類愈傷組織中的表達量都低于對照組，暗示了綠色組織細胞的不正常發育，這也許是不定芽分化率較低的原因之一（圖8）。

2.3.4 體細胞胚形成相關基因的表達 在轉化Wus2和IPT形成的類愈傷組織中，與體細胞胚形成有關的基因如 ECP63、AGL15、GA2OX6、FUS3、ABI3、WUS和CUC2，其中WUS表達量上升超過32倍，ECP63、AGL15、FUS3、ABI3、WUS和CUC2表達量上升超過4倍，這表明它們可能在類愈傷組織形成過程中發揮著重要作用（圖9），并且它們的表達可能是芽形成的先決條件。

2.3.5 類愈傷組織中的高度上調基因 在類愈傷組織中高度上調的基因中，除了通過農桿菌轉移的靶基因IPT和Wus2外，還有5個基因經歷了超過1000倍的上調，即HIGD、ACS2、ENOD93、CKX2和AAT（圖10），雖然它們之間沒有直接的功能關系，但具有被非生物脅迫誘導的共同特征。

2.4 差異表達基因的qRT-PCR分析

為了驗證RNA-seq數據的準確性，選擇了13個具有顯著表達波動的基因進行qRT-PCR，這些基因與綠色組織細胞的發育和芽的形成有關。qRT-PCR數據顯示出與RNA-seq結果相似的趨勢（圖11），表明RNA-seq可以準確地反映基因的相對表達水平。

3 討論與結論

通過根癌農桿菌介導的遺傳轉化法，將Wus2和IPT基因轉入番茄幼苗后，番茄下胚軸細胞的生理過程發生了轉變，從營養狀態轉變到類似生殖或逆境狀態，從而導致了類愈傷組織的形成。在此過程中，ECP63、WUS和CUC2均上調表達，這表明了番茄下胚軸向胚性愈傷組織的轉變。ECP63是從胡蘿卜胚性培養物中分離得到的典型的LEA 基因[14]，參與了種子成熟與耐旱過程，在胚性細胞和不同發育時期的胚狀體中高度表達，但在幼苗和非胚性細胞中不表達[15]。在ecp63缺失的突變體中，外植體胚胎發生的潛能顯著降低[16]。WUS蛋白是AGAMOUS基因的激活因子，參與調節莖部分生組織中干細胞的維持，保持干細胞處于未分化狀態[17]。CUC基因在中間區域的表達有2個主要功能，一是抑制細胞的增殖和分化，分隔出2個發育中的子葉邊界，二是啟動STM在中間的表達[18]，且CUC基因在胚胎發生過程中對生長素生物合成基因的表達起著重要的調控作用，這可能有助于子葉邊界的發育[19]。

許多與內源激素合成和調控有關基因的表達也發生了改變，這說明植物激素在類愈傷組織形成過程中起著關鍵作用。在細胞分裂素、乙烯和赤霉素的信號轉導途徑中，各富集了3個、4個和3個差異表達基因。CKX2、ACS2和GA2OX6分別編碼了細胞分裂素、乙烯和赤霉素合成過程中的關鍵酶，它們在類愈傷組織形成過程中均上調表達。在前人的研究中，細胞分裂素可以促進細胞分裂和誘導芽的分化，甚至可以直接誘導豬血木葉片和葉柄的體細胞胚發生[20]，而過表達CKX2則降低了內源細胞分裂素含量，使葉片緩慢變小[21] 。GA2OX6編碼的赤霉素2-氧化酶可以使赤霉素失活，而赤霉素被認為不利于細胞分化[22]，在添加赤霉素情況下體細胞胚胎的存活率不足3%[23]，但也有研究認為相對較低的細胞分裂素和赤霉素含量有助于胚性愈傷組織的形成[24]。乙烯誘導體細胞胚形成的作用存在一些爭議。比如胚性愈傷組織中乙烯產量的增加會破壞對擬南芥體細胞胚的誘導[25]，但是乙烯生物合成和響應基因的上調卻是紫花苜蓿葉片外植體誘導體細胞胚胎發生所必需的[26]。AGL15、FUS3和ABI3則通過復雜的調控網絡影響赤霉素積累、生長素反應和乙烯積累，將有生物活性的赤霉素轉化成無生物活性的赤霉素，進而影響體細胞胚的形成。ABI3是脫落酸信號傳導途徑的中心調節因子[27]，FUS3通過調節脫落酸和赤霉素2種激素的合成來參與控制葉片器官的形成[28]，ABI3和FUS3相互正向調控并調控自身的表達[29]。AGL15可以正向調控ABI3、GA2OX6、AtIAA30、miR167A、SERF1的表達，負向調控TIR1、ARF6、ARF8的表達和赤霉素的生物合成，FUS3與AGL15之間相互正向調控[30]。

根癌農桿菌介導的植物內轉化雖然可能不受基因型的限制，但同時也存在一些問題，如芽不能正常伸長，這可能是CKX2的高表達和綠色組織細胞發育不完全導致的。在前人的研究中，番茄莖尖葉片的起始只有在光照下才能發生，暗處理會抑制葉片發育[31]；綠色組織細胞通過光合作用產生蔗糖，蔗糖被轉運到芽原基并轉化為葡萄糖，以激活葡萄糖-TOR信號通路，從而用于芽原基或分生組織的發育[32]。所以或許可以通過延長光照時間、提高光照度或者添加外源細胞分裂素來促進芽的生長發育，但還需要進一步的試驗來驗證。

參考文獻

[1] AZIZI-DARGAHLOU S，POURESMAEIL M．Agrobacterium tumefaciens-mediated plant transformation： A review[J]．Molecular Biotechnology[2023-07-01]．https：//link.springer.com/article/10.1007/s12033-023-00788-x．

[2] SINGH R K，PRASAD M．Advances in Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of graminaceous crops[J]．Protoplasma，2016，253（3）：691-707．

[3] DAUM G，MEDZIHRADSZKY A，SUZAKI T，et al．A mechanistic framework for noncell autonomous stem cell induction in Arabidopsis[J]．Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Stated of America，2014，111（40）：14619-14624．

[4] MA Y F，MIOTK A，?UTIKOVI? Z，et al．WUSCHEL acts as an auxin response rheostat to maintain apical stem cells in Arabidopsis[J]．Nature Communications，2019，10：5093．

[5] MAYER K F X，SCHOOF H，HAECKER A，et al．Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidopsis shoot meristem[J]．Cell，1998，95（6）：805-815．

[6] CHE P，WU E，SIMON M K，et al．Wuschel2 enables highly efficient CRISPR/Cas-targeted genome editing during rapid de novo shoot regeneration in sorghum[J]．Communications Biology．2022，5（1）：344．

[7] MASTERS A，KANG M，MCCAW M，et al．Agrobacterium-mediated immature embryo transformation of recalcitrant maize inbred lines using morphogenic genes[J]．Journal of Visualized Experiments，2020（156）：e60782．

[8] MAHER M F，NASTI R A，VOLLBRECHT M，et al．Plant gene editing through de novo induction of meristems[J]．Nature Biotechnology，2020，38（1）：84-89．

[9] TAKEI K，SAKAKIBARA H，SUGIYAMA T．Identification of genes encoding adenylate isopentenyltransferase，a cytokinin biosynthesis enzyme，in Arabidopsis thaliana[J]．Journal of Biological Chemistry，2001，276（28）：26405-26410．

[10] JIA P，WANG Y，SHARIF R，et al．MdIPT1，an adenylate isopentenyltransferase coding gene from Malus domestica，is involved in branching and flowering regulation[J]．Plant Science，2023，333：111730．

[11] SUN J Q，NIU Q W，TARKOWSKI P，et al．The Arabidopsis AtIPT8/PGA22 gene encodes an isopentenyl transferase that is involved in de novo cytokinin biosynthesis[J]．Plant Physiology，2003，131（1）：167-176．

[12] LI K，WANG J，LIU C L，et al．Expression of AtLEC2 and AtIPTs promotes embryogenic callus formation and shoot regeneration in tobacco[J/OL]．BMC Plant Biology，2019，19（1）：314．

[13] 韓曉雪，韓佳軒，姜晶．番茄在非生物脅迫下實時定量RT-PCR中內參基因的篩選[J]．分子植物育種，2015，13（4）：822-831．

[14] YANG H P，SAITOU T，KOMEDA Y，et al．Arabidopsis thaliana ECP63 encoding a LEA protein is located in chromosome 4[J]．Gene，1997，184（1）：83-88．

[15] 朱長甫，鐮田博，原田宏，等．與胡蘿卜胚胎發生相關的胚性細胞蛋白63 cDNA分離及其基因表達研究[J]．植物學報，1997，39（12）：1091-1098．

[16] NOWAK K，GAJ M D．Stress-related function of bHLH109 in somatic embryo induction in Arabidopsis[J]．Journal of Plant Physiology，2016，193：119-126．

[17] IKEDA M，MITSUDA N，OHME-TAKAGI M．Arabidopsis WUSCHEL is a bifunctional transcription factor that acts as a repressor in stem cell regulation and as an activator in floral patterning[J]．Plant Cell，2009，21（11）：3493-3505．

[18] JENIK P D，GILLMOR C S，LUKOWITZ W．Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana[J]．Annual Review of Cell and Developmental Biology，2007，23：207-236．

[19] YAMADA M，TANAKA S，MIYAZAKI T，et al．Expression of the auxin biosynthetic genes YUCCA1 and YUCCA4 is dependent on the boundary regulators CUP-SHAPED COTYLEDON genes in the Arabidopsis thaliana embryo[J]．Plant Biotechnology，2022，39（1）：37-42．

[20] XIONG Y P，CHEN S Y，WU T，et al．Shoot organogenesis and somatic embryogenesis from leaf and petiole explants of endangered Euryodendron excelsum[J]．Scientific Reports，2022，12（1）：20506．

[21] WERNER T，MOTYKA V，LAUCOU V，et al．Cytokinin-deficient transgenic Arabidopsis plants show multiple developmental alterations indicating opposite functions of cytokinins in the regulation of shoot and root meristem activity[J]．Plant Cell，2003，15（11）：2532-2550．

[22] RAMAKRISHNA D，SHASTHREE T．High efficient somatic embryogenesis development from leaf cultures of Citrullus colocynthis （L．） Schrad for generating true type clones[J]．Physiology and Molecular Biology of Plants，2016，22（2）：279-285．

[23] OLIVEIRA F L R，SANTANNA-SANTOS B F，FRAGA H P F，et al．Embryogenic cultures and somatic embryos development from mature seeds of jabuticaba （Plinia cauliflora （Mart．） Kausel）[J]．Anals Da Academia Brasileira De Ciencias，2022，94（4）：e20201073．

[24] WU G Y，WEI X L，WANG X，et al．Changes and transcriptome regulation of endogenous hormones during somatic embryogenesis in Ormosia henryi Prain[J]．Frontiers in Plant Science，2023，14：1121259．

[25] BAI B，SU Y H，YUAN J，et al．Induction of somatic embryos in Arabidopsis requires local YUCCA expression mediated by the down-regulation of ethylene biosynthesis[J]．Molecular Plant，2013，6（4）：1247-1260．

[26] MANTIRI F R，KURDYUKOV S，LOHAR D P，et al．The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula[J]．Plant Physiology，2008，146（4）：1622-1636．

[27] NAMBARA E，KEITH K，MCCOURT P，et al．A regulatory role for the ABI3 gene in the establishment of embryo maturation in Arabidopsis thaliana[J]．Development，1995，121（3）：629-636．

[28] GAZZARRINI S，TSUCHIYA Y，LUMBA S，et al．The transcription factor FUSCA3 controls developmental timing in Arabidopsis through the hormones gibberellin and abscisic acid[J]．Developmental Cell，2004，7（3）：373-385．

[29] TO A，VALON C，SAVINO G，et al．A network of local and redundant gene regulation governs Arabidopsis seed maturation[J/OL]．Plant Cell，2006，18（7）：1642-1651．

[30] ZHENG Q L，ZHENG Y M，JI H H，et al．Gene regulation by the AGL15 transcription factor reveals hormone interactions in somatic embryogenesis[J/OL]．Plant Physiology，2016，172（4）：2374-2387．

[31] YOSHIDA S，MANDEL T，KUHLEMEIER C．Stem cell activation by light guides plant organogenesis[J]．Genes & Development，2011，25（13）：1439-1450．

[32] SONG X H，GUO P R，XIA K K，et al．Spatial transcriptomics reveals light-induced chlorenchyma cells involved in promoting shoot regeneration in tomato callus[J]．Proceeding of the National Academy of Science United States of America，2023，120（38）：e2310163120．