農藥殘留快速檢測試紙條的研制及應用

孫召偉，趙小中，胡波，趙伊行，許雪，杜苗，翁海波

摘? ? 要：簡單快速地篩查有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留對食品安全具有重要意義。采用酶抑制法，以重氮固紅RC鹽為指示劑、乙酸吲哚酚為乙酰膽堿酯酶（AChE）底物，設計開發了一種一步式快速檢測試紙條。該試紙條底部為塑料膠板，上面依次粘貼樣品墊、酶墊、阻滯墊、底物墊、吸附墊和固定有重氮固紅RC鹽的硝酸纖維素（NC）膜，通過檢測區域顏色的變化可以實現農藥殘留的定性或定量分析，操作方法簡單快捷。不同農藥的檢出限分別如下：馬拉硫磷為0. 6 mg·L-1，氧化樂果為0. 4 mg·L-1，乙酰甲胺磷為1.3 mg·L-1，敵敵畏為0.1 mg·L-1，呋喃丹為0. 1 mg·L-1，涕滅威為0.07 mg·L-1，且在實際果蔬樣品檢測中顯示出良好的重現性和高靈敏度。

關鍵詞：乙酰膽堿酯酶；農藥殘留；快速檢測；試紙條

中圖分類號：S482.3 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-111-08

Construction and application of paper test strip for rapid detection of pesticide residues

SUN Zhaowei1， ZHAO Xiaozhong2， HU Bo2， ZHAO Yihang1， XU Xue1， DU Miao1， WENG Haibo1

（1. School of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou 450001， Henan， China; 2. Zhengzhou Agricultural Products Quality Inspection and Circulation Center， Zhengzhou 450006， Henan， China）

Abstract： Simple and rapid screening of organophosphorus and carbamate pesticide residues is of great significance for food safety. In this study， the authors designed and developed a one-step rapid test strip using enzyme inhibition method， with the diazo red RC salt as indicator and indoxyl acetate as substrate of acetylcholinesterase（AChE）. The bottom of the test strip is a plastic rubber plate， which is successively pasted with sample pad， enzyme pad， block pad， substrate pad， adsorption pad and nitrocellulose （NC） film that fixed with diazo red RC salt. Qualitative or quantitative analysis of pesticide residues can be achieved by detecting changes in the color of the detection area， and the operation method is simple and fast. The detection limits of different pesticides are as follows： 0.6 mg·L-1 for malathion， 0.4 mg·L-1 for omethoate， 1.3 mg·L-1 for acephate， 0.1 mg·L-1 for dichlorvos， 0.1 mg·L-1 for carbofuran， 0.07 mg·L-1 for aldicarb. It shows good reproducibility and high sensitivity in actual fruit and vegetable samples.

Key words： Acetylcholinesterase; Pesticide residue; Rapid detection; Test strip

隨著社會的進步和生活水平的提高，人們對果蔬的消耗量日益增加，農業生產中殺蟲劑的使用越來越趨向于大量化、多樣化，其中廣泛應用的一大類為有機磷和氨基甲酸酯類農藥[1-2]。他們通過結合乙酰膽堿酯酶 （AChE） 活性位點，抑制其活性，阻止神經遞質的傳遞，致使昆蟲死亡[3]。乙酰膽堿酯酶是中樞神經系統的關鍵酶，能降解乙酰膽堿，終止神經遞質對突觸后膜的興奮作用，保證神經信號在生物體內的正常傳遞。大量殺蟲劑的使用不僅污染環境，而且經常造成農藥殘留超標，危害人們的身體健康。因此，果蔬在進入銷售、食用之前，對其進行農藥殘留檢測是非常必要的。

在現有檢測方法中，氣相色譜和高效液相色譜法是分析農業和環境樣品中農藥殘留的成熟方法[4-7]。這些技術方法需要復雜、昂貴的儀器設備和專業的技術操作人員，因此，通常無法在常規篩查和快速檢測中推廣應用。基于AChE酶抑制的檢測方法更為簡便快捷，適合于現場快速篩檢樣本中復合農藥殘留是否超標[8-9]。目前已開發出多種基于酶抑制法的農藥殘留快速檢測技術，包括比色法、熒光法、免疫化學法和生物傳感器技術等[10-14]。但是，目前這些方法仍然嚴重依賴技術設備和專業操作人員，不適用于臨時市場或偏遠地區的快速應用，因此開發一種便攜、快捷、靈敏的農藥殘留檢測分析方法迫在眉睫。

基于試紙條的分析方法在現場篩選方面具有多種優勢：試紙價格低廉、數量充足、可一次性使用；紙張還具有無需動力即可通過毛細作用移動流體的獨特特性，有效分離混合物中的成分；這些便攜式試紙條可用于缺乏設備的偏遠地區，操作簡單，無需專業人員[15-16]。筆者基于AChE的抑制原理，以重氮固紅RC鹽為指示劑，以乙酸吲哚酚為AChE底物，結合新材料和化學分析等方法，研究和開發了一站式、快捷速測試紙條，可通過檢測區域顏色的變化進行農藥殘留的快速、準確的定性和定量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗于2023年2－6月在鄭州大學生命科學學院進行。

乙酰膽堿酯酶購自鄭州貝貝生物科技有限公司；果蔬樣品購自鄭州當地超市；農藥分析標準品購自國家標準物質認證信息中心；乙酸吲哚酚、重氮固紅RC鹽、乙酰硫代氯化膽堿、二甲基甲酰胺、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）等化學試劑購自上海阿拉丁試劑有限公司；聚酯纖維- KL43，VL78，玻璃纖維- KB50，RB65，SB08和吸水紙- SX18、聚酯纖維膜、硝化纖維素膜、聚氯乙烯（PVC）膠板購自上海金生物科技有限公司。無水甲醇、二甲基甲酰胺、磷酸二氫鉀、無水磷酸氫二鉀購自上海阿拉丁試劑有限公司，均為分析純。MilliQ試劑水系統（Millipore，Billerica，MA）制備超純水。UV-Vis紫外分光光度計用于酶活性測定。

1.2 溶液的配置

取適量乙酰膽堿酯酶凍干粉溶于水中，配置3000 U·mL-1的酶溶液；取17.518 mg乙酸吲哚酚溶于1 mL無水甲醇中，配制濃度為100 mmol·L-1乙酸吲哚酚溶液備用；稱取60 mg重氮固紅RC鹽溶于1 mL 含有15%（φ）的二甲基甲酰胺水溶液，配制成質量濃度為60 mg·mL-1的重氮固紅RC溶液備用；取0.63 g磷酸二氫鉀與12.28 g無水磷酸氫二鉀溶于1 L超純水中，配制PBS（pH 8.0）緩沖溶液；用丙酮稀釋不同農藥，配制農藥原液（100 mg·mL-1），-20 ℃避光保存。

1.3 試紙條制備工藝參數的優化

1.3.1 酶膜片及濃度的優化 將100 μL 3500 U·mL-1的AChE溶液 固定于玻璃纖維（KB50、RB65、CB08）、聚酯纖維（KL43、VL78）和吸水紙（SX18）等不同固定材料的膜片上，優化酶膜片。將100 μL的AChE溶液 （1500、2000、3000、3500、4000、4500 U·mL-1）固定于玻璃纖維RB65膜片上，優化酶濃度。膜片干燥后，放入含有100 μL磷酸鹽緩沖液的1.5 mL離心管中，依據Ellmam法測定酶活性，計算酶活性回收率。酶活性回收率（R）計算公式為：R/%=ΔA1/ΔA2 ×100。同時，將AChE膜片浸泡在不同濃度的滅蟲威和敵敵畏農藥中，檢測農藥對乙酰膽堿酯酶的實時抑制率。根據AChE的回收率和抑制率確定AChE的最佳濃度和膜片。每組試驗選擇2組樣本數，3次重復。

1.3.2 底物膜片及濃度的優化 將100 μL 100 mmol·L-1的乙酸吲哚酚溶液固定于玻璃纖維（KB50、RB65、CB08）、聚酯纖維（KL43、VL78）和吸水紙（SX18）等不同固定材料的膜片上，優化底物膜片。將100 μL乙酸吲哚酚（10、50、100、200 mmol·L-1）固定在聚酯纖維VL78膜片上，優化底物濃度。膜片干燥后，放入含有100 μL磷酸鹽緩沖液的1.5 mL離心管中，取上清液，與等量乙酰膽堿酯酶混合，室溫下進行不同時間孵育。乙酰膽堿酯可催化無色乙酸吲哚酚水解生成吲哚酚，吲哚酚被空氣迅速氧化生成靛藍（靛藍的最大吸收波長為605 nm），通過測量605 nm處的吸光度選擇最佳底物膜片。根據檢測區的最終顏色強度確定AChE的最佳底物濃度和膜片。每組試驗選擇2組樣本數，3次重復。

1.3.3 重氮固紅RC鹽濃度的優化 采用不同質量濃度重氮固紅RC鹽（10、20、40、60、100 mg·mL-1）對檢測區進行劃線，通過觀測檢測區的顏色強度變化來確定最適濃度。每組試驗選擇2組樣本數，3次重復。

1.3.4 干燥方式的優化 酶片采用冷凍、4 ℃和37 ℃ 3種溫度干燥20 min進行酶片的固定，測定干燥后酶活性回收率，選擇最適干燥條件。每組試驗選擇2組樣本數，3次重復。

1.4 試紙條的制備與條件優化

1.4.1 試紙條的制備 按照優化后的工藝參數，選擇最適的玻璃纖維、聚酯纖維或吸水紙切成正方形（3 mm × 3 mm），分別滴加乙酰膽堿酯酶、乙酸吲哚酚溶液，制備酶片和底物片。將選擇好的硝化纖維素膜、樣品片、酶片、阻滯片、底物片和吸附片剪成4 mm×10 mm的長條，硝化纖維素膜上用最適濃度重氮固紅RC鹽溶液進行劃線，酶片和底物片分別用鑷子依次粘貼塑料膠板上，制成試紙條備用。

1.4.2 試紙條使用條件的優化 將試紙條分別放置4、25和37 ℃反應20 min，記錄不同時間和溫度條件下的反應結果，優化反應時間和溫度。每組試驗選擇2組樣本數，3次重復。

1.5 試紙條檢測性能的測試

1.5.1 標準農藥的測試 用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）將有機磷農藥（OP）：馬拉硫磷、氧化樂果、乙酰甲胺磷、敵敵畏和氨基甲酸酯類農藥（CM）：呋喃丹、涕滅威稀釋至不同濃度，作為農藥殘留檢測樣本。分析時，其中一個在樣品片上滴加70 μL純凈水作為檢測陰性對照，其他依次滴加農藥樣本液，室溫反應15 min。分別利用國家標準法[17]和市售農殘速測試劑盒測定不同種農藥的檢出限（LOD，規定為農藥可以抑制50%酶活性的農藥濃度，即IC50，與該試紙條進行比較）。

1.5.2 實際果蔬樣品的測試 選擇食用頻率高的果蔬樣本，輕輕擦拭表面泥土，以1 mL·g-1的量噴灑不同濃度的氧化樂果農藥，氧化樂果溶液質量濃度分別為0、1、2、4、6、8、10、20、30、40、50 μg·mL-1。室溫放置24 h后，剪成碎片，稱取2 g樣品，放入燒杯中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液，震搖2 min后靜置，上清液備用。分析時，其中一個在樣品片上滴加70 μL純凈水作為檢測陰性對照，其他依次滴加果蔬樣本液，室溫反應15 min。同時利用乙腈提取一些噴灑不同濃度農藥的白菜樣品，進行氣相色譜-質譜分析。每組試驗2組樣本數，3次重復。

1.6 試紙條存儲穩定性的測試

將試紙條密封于暗處，在4 ℃、室溫（RT，25 ℃）和37 ℃條件下保存60 d以上，每隔10 d在樣品墊上滴入分析液（70 μL）進行檢測，測定顏色強度，并與新制備的顏色強度進行比較。

1.7 統計分析

通過獲取數字圖像并使用Photoshop軟件分析圖像來量化顏色強度。陰性對照不含任何抑制劑的棕紅色賦值為100，陽性對照不含酶的淡黃色賦值為0。試驗采用完全隨機設計，每個試驗重復3次。使用GraphPad Prism軟件于Fishers LSD（最小顯著性差異）法進行差異顯著性分析，采用Excel 2019 繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 試紙條的原理

試紙條由帶有樣品墊、酶墊、阻滯墊、底物墊、硝酸纖維素（NC）膜和吸附墊的塑料墊板組成（圖1）。含有酶和底物的墊為親水性膜，能夠吸附和釋放全劑量的酶或底物。在吸水紙的毛細血管作用下，樣品墊上的樣品液經過酶片時，酶膜上的乙酰膽堿酯酶可快速溶于水中，并繼續移動，經過阻滯片后到達底物片，與底物乙酸吲哚酚發生反應生成親核芳香化合物靛藍，繼而在水的作用下移動到NC膜上與重氮固紅RC鹽發生耦合反應，產生棕紅色指示帶。隨著滴加的樣品液中農藥殘留濃度的提高，檢測孔的顏色從棕紅色依次遞淺，可根據顏色強度的差異判斷樣品中的農藥殘留量。

2.2 固定材料的確定

2.2.1 酶膜片的確定 酶和底物的最佳固定化材料應該是生物惰性的，這樣就不會受到生物活性物質的影響，能夠達到完全吸附且完全釋放的效果。因此，筆者以玻璃纖維（KB50、RB65、CB08）、聚酯纖維（KL43、VL78）和吸水紙（SX18）為固定材料，分別測定不同材料酶片酶活性的回收率，結果發現，不同材料作為酶片得到的酶活性回收率不同，玻璃纖維膜RB65的酶活性回收率最高，達75%（圖2-A）。孵育不同時間后進行酶活性回收率檢測，結果發現，其對酶活性影響不大（圖2-B）。因此，確定玻璃纖維膜RB65為最適酶固定材料。

2.2.2 底物膜片的確定 對于底物片材料，將回收后的底物與酶反應，進行吸光度的檢測。從圖3可以看出，聚酯纖維素膜VL78在605 nm處的吸光度值隨著反應時間的延長而增大，說明VL78膜片上的底物回收率最高。因此，確定聚酯纖維素膜VL78為最適底物固定材料。

2.3 固定濃度的確定

2.3.1 酶濃度的確定 酶片上乙酰膽堿酯酶的濃度對試紙條檢測結果影響較大。增加乙酰膽堿酯酶的濃度可以提高顯色顏色強度。但是，如果酶量過多，靈敏度會降低。因此，色彩強度和測試靈敏度需要平衡。從圖4-A～B可以看出，當酶片上AChE濃度從1500 U·mL-1增加到4500 U·mL-1時，回收率提高，抑制率降低。因此，酶的最佳濃度確定為3500 U·mL-1。

2.3.2 底物濃度的確定 底物濃度優化結果如圖5-A～B所示，當乙酸吲哚酚濃度達到100 mmol·L-1時，顏色強度趨于穩定，不再增加。因此，乙酸吲哚酚最佳濃度確定為100 mmol·L-1。

2.3.3 重氮固紅RC鹽濃度的確定 重氮固紅RC鹽濃度優化結果如圖6-A～B所示，當重氮固紅RC鹽質量濃度達到60 mg·mL-1時，顏色強度趨于穩定，不再增加。因此，重氮固紅RC鹽最佳質量濃度確定為60 mg·mL-1。

2.4 膜片干燥方式的確定

3種酶片干燥方式的酶活性回收率差異顯著（圖7），冷凍干燥20 min后酶活性回收率為78%，4 ℃條件下酶活性回收率為19%，37 ℃條件下酶活性回收率為56%，因此，酶片選擇回收率最高的冷凍干燥方式。

由于乙酸吲哚酚溶解在甲醇中，容易蒸發，因此，底物片選擇室溫干燥方式。

2.5 反應時間和溫度的確定

將速測試紙條分別放置4、25、37 ℃進行反應，實時檢測結果如表1所示。無論在4、25℃，還是在37 ℃條件下進行反應，試紙條均在15 min內達到最大顯色強度；在4 ℃條件下，顏色強度反應較弱，在25和37 ℃條件下，顏色強度差異不大，當溫度為37 ℃時，測試條蒸發速度快，需要更多的液體溶液來反應。因此，確定最佳反應時間為15 min，最佳使用溫度為25 ℃。

2.6 試紙條檢測性能的測試

2.6.1 農藥標準品的測試 農藥標準品的測試結果如表2所示，試驗結果利用顏色分析軟件分析，陰性對照的藍綠色顏色強度設為100，陽性結果的無色設為0。通過對顏色強度的分析，實現速測試紙條的LOD分析。農藥的檢出限規定為農藥可以抑制50%酶活性的農藥濃度，即IC50。從結果中可以看出，試紙條對于不同農藥的檢出限分別如下：馬拉硫磷為0. 6 mg·L-1，氧化樂果為0. 4 mg·L-1，乙酰甲胺磷為1.3 mg·L-1，敵敵畏為0.1 mg·L-1，呋喃丹為0.1 mg·L-1，涕滅威為0.07 mg·L-1，均明顯低于國家標準方法規定的檢出限和市售農殘快速檢測卡的檢出限，說明其具有較好的靈敏度和較低的檢出限。

2.6.2 實際果蔬樣品的測試 實際果蔬樣品的測試結果如表3所示。隨著果蔬表面噴灑農藥濃度的提高，檢測試紙條檢測區域的顏色逐漸變淺，當噴灑農藥的質量濃度高于6 mg·L-1時，與未噴施農藥的陰性對照相比，可明顯看到顏色差異。噴灑同樣濃度的氧化樂果，3種不同果蔬檢測結果基本一致，說明該試紙條在實際果蔬農藥殘留檢測時具有良好的靈敏性、穩定性和重現性。

通過農藥標準品和實際果蔬樣品檢測，本研究根據平均抑制比，設置陰性（-）、陽性（+）和強陽性（++）3個不同顏色水平作為篩選和檢測標準，檢測結果與之比對后，可簡單、快速地實現果蔬中農藥殘留的檢測（圖8）。

為了驗證試紙條在實際樣品檢測中的靈敏性，筆者與氣相色譜-質譜分析進行了比較，結果如表4所示。當噴灑農藥質量濃度為6 mg·L-1時，依據本研究標準色卡圖，該試紙條顯色結果為陽性（+），而GC-MS檢測結果為0.51 mg·L-1，遠低于國家標準可檢測的LOD值（2.3 mg·L-1 ）。當噴灑濃度為10 mg·L-1時，該試紙條顯示結果為強陽性（++），GC-MS檢測結果為2.05 μg·mL-1，說明該試紙條具有較高的靈敏性和較低的檢出限。

2.7 試紙條存儲穩定性的測試

試紙條存儲穩定性測試結果如圖9所示，4 ℃和室溫（RT，25 ℃）密封避光保存60天，試紙條仍然保持75%的活性，37 ℃條件下剩余活性為55%。說明本研究中的試紙條穩定性好，室溫放置2個月仍有較高的活性，可滿足目前市場農藥殘留檢測的要求。

3 討論與結論

農藥的過量使用導致果蔬中農藥高濃度殘留，愈來愈引起人們的重視。特別是冬季塑料大棚和溫室環境，由于病蟲害數量增加，果農對施藥后的農產品快速上市銷售，導致農藥殘留量急劇上升[18]。多種農藥殘留檢測技術應運而生，如色譜分析、生化檢測等[19]。然而，多數檢測方法依賴于儀器設備和技術人員，檢測過程復雜，耗時長，不適用于日常生活檢測。因此，開發簡便快捷、靈敏高效的新型檢測方法對日常生活中農藥殘留的檢測具有重要意義。

筆者基于酶抑制法原理，偶聯重氮離子與芳香族化合物，研制開發了一種新型果蔬農藥殘留快速檢測試紙條。該試紙條可根據檢測區域顏色強度的變化，實現農藥殘留定性或定量的檢測。通過對6種不同的有機磷和氨基甲酸酯類農藥標樣和3種果蔬樣品的實際檢測分析，均顯示該試紙條具有較低的檢出限、較高的靈敏度、良好的穩定性和重現性[17]；通過放置于不同環境下密封保存，驗證了該試紙條具有較好的穩定性，可室溫保存2個月。然而，目前該方法仍處于試驗階段，采用的實際樣本量不夠豐富，需要進一步擴大樣本量，探討其在市場或家庭場所的實際應用情況；或可結合信號輸出技術，開發可直接通過手機掃描即顯示檢測結果的裝置，提高該檢測試紙條的便捷性和智能性。

筆者設計的檢測試紙條具有操作簡單、使用方便、檢測靈敏等優點，適用于企業、市場、家庭、餐廳等場所，可滿足目前市場上快速檢測的要求，是今后農藥殘留快速檢測的主要發展方向和趨勢。

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