基于網絡藥理學和分子對接技術的2，3-吲哚醌抗少弱精癥機制研究

倪倍倍 代夢 畢曉林 趙志臣 岳旺 隋忠國

摘要：為研究2，3-吲哚醌（isatin， ISA）治療少弱精癥的可能作用靶點和作用機制，基于公共數據庫分別獲取ISA作用靶點和少弱精癥相關疾病靶點，確定交集靶點，采用Cytoscape 軟件獲取核心靶點。通過GO功能富集和KEGG通路分析交集靶點，采用分子對接預測ISA與靶點蛋白的結合能力。研究結果顯示，ISA干預少弱精癥主要涉及氧化應激、細胞凋亡和炎癥等生物學過程，并與p53信號通路、細胞衰老通路和IL-17信號通路密切相關；經篩選確定8個核心靶點，ISA與其中6個核心靶點穩定結合。這表明，ISA可能通過作用于核心靶點CASP3、TP53、ESR1、PTGS2、TNF和ANXA5，調控p53信號通路和IL-17信號通路發揮抗少弱精癥作用。

關鍵詞：2，3-吲哚醌；網絡藥理學；少弱精癥；分子對接

中圖分類號：R963

文獻標志碼：A

不孕不育作為全球公共衛生問題，影響約15%的夫婦，其中男性因素約占一半[1]。少弱精癥是造成男性不育主要因素，其發生率約占男性不育癥患者75%左右，嚴重影響男性生殖健康[2]。少弱精癥包括少精癥（oligospermia）和弱精癥（asthenozoospermia），以精子密度和活動力下降為特征。少弱精癥的發生與精漿異常、環境、精索靜脈曲張等因素相關[3]，具體發病機制仍未完全闡明，且缺乏有效的治療藥物[4]，亟待開發抗少弱精癥新藥。2，3-吲哚醌（isatin，ISA）作為廣泛存在于動植物體內天然小分子化合物，是人體組織和體液中一種重要內源性生物活性物質[5]。研究發現，ISA具有抗氧化應激、抗凋亡、抗炎、抗腫瘤、抗衰老、神經保護和抗菌等多種生物學活性[6]。哺乳動物大鼠各組織中ISA呈特異性分布，輸精管和精囊中ISA濃度最高且百倍高于其他組織[7-8]。這一現象提示ISA可能對精子有特殊保護作用。本課題組前期動物實驗結果顯示，ISA可改善少弱精癥模型大鼠精子活動力及促進精子發生，但作用機制尚不明確[9]。因此，本文利用網絡藥理學和分子對接技術，篩選ISA抗少弱精癥的關鍵靶點，獲取ISA抗少弱精癥的信號通路，以預測ISA治療少弱精癥的可能機制。

1 研究方法

1.1 ISA作用靶點篩選獲取

PubChem數據庫輸入“isatin”后，基于Chemical-Gene Co-Occurrences in Literature、Protein Bound 3-D Structures、Chemical-Target Interactions和BioAssay Results收集化合物—蛋白質相互作用靶點信息。獲得ISA 2D結構圖后，分別上傳至pharmMapper數據庫和Swiss Target Prediction數據庫，預測ISA作用靶點。合并3個數據庫所得靶點，去除重復后確定ISA作用靶點。借 助 UniProt 數 據 庫（http：//www.uniprot.org/）規范ISA作用靶點的基因名稱。

1.2 少弱精癥相關疾病靶點篩選

以“oligospermia”和“asthenozoospermia”為關鍵詞，檢索GeneCards數據庫（https：//www. genecards.org）和DisGeNET 數據庫（https：//www.disgenet.org/）中與少弱精癥相關的疾病靶點。根據相關性分數（Relevance score）值篩選GeneCards數據庫檢索結果，只接受大于相關性分數值中位數的靶點。合并2個數據庫所得疾病靶點，去除重復后確定與少弱精癥相關的疾病靶點。

1.3 蛋白—蛋白互作網絡構建和核心靶點篩選

ISA作用靶點與少弱精癥相關疾病靶點分別上傳至在線Venny平臺（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）完成映射，得藥物疾病交集靶點。導入交集靶點至線數據庫STRING（https：//string-db.org/），完成蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）分析。PPI分析結果導入Cytoscape 3.7.2 軟件后，采用插件Cyot NCA 分析其度中心性（Degree Centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC）、介數中心性（Betweenness Centrality，BC）和緊密中心性（Closeness Centrality，CC）的網絡拓撲特征值。以超過上述4種網絡拓撲特征值的中位數作為篩選標準，確定核心靶點。

1.4 GO富集分析和KEGG 信號通路分析

使用R 4.1.2軟件中ClusterProfiler包，針對交集靶點完成基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。取GO富集分析的富集基因數前10位做可視化處理。KEGG通路分析結果以P < 0.05為篩選標準，按P由小到大取前20位做可視化處理。

1.5 分子對接

RCSB PDB蛋白質結構數據庫（https：//www.rcsb.org/）下載核心靶點的蛋白3D結構。PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載ISA分子的3D結構，通過Open Babel軟件完成格式轉換。借助Auto Dock Tools優化ISA分子結構，核心靶點蛋白結構做脫水和氫化處理。優化后的ISA分子和核心靶點蛋白保存為PDBQT格式。左卡尼汀（少弱精癥常用治療藥物）作為陽性對照[10]，與ISA做相同處理。采用Auto Dock Tools軟件做分子對接，對接結果使用PyMOL可視化。

2 結果

2.1 ISA作用靶點及少弱精癥相關疾病靶點

通過PubChem數據庫篩選后得121個ISA作用靶點，通過PharmMapper數據庫得89個ISA作用靶點，通過Swiss target Prediction數據庫篩選后得109個作用靶點，合并所得ISA作用靶點并去除重復，共得266個ISA作用靶點。通過GeneCards數據庫篩選得440個少弱精癥相關疾病靶點，經DisGeNET 數據庫檢索得381個少弱精癥相關疾病靶點，合并所得疾病靶點并去除重復，最終確定466個疾病靶點。

2.2 PPI網絡構建和核心靶點確定

通過分別上傳ISA作用靶點與少弱精癥相關疾病靶點至在線Venny 平臺映射后，得27個交集靶點（圖1）。交集靶點導入STRING數據庫，做交集靶點PPI網絡分析（圖2（a））?；贑ytoscape 軟件的Cyto NCA插件，拓撲分析交集靶點PPI網絡，計算DC、EC、BC和CC中位數分別為12、019、83和063。由表1和圖2（b）可知，有8個交集靶點參數大于上述參數中位數，則確定為核心靶點，分別是細胞凋亡相關半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、腫瘤蛋白p53（TP53）、雌激素受體1（ESR1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、缺氧誘導因子-1α（HIF1A）、前列腺素內過氧化物酶2（PTGS2）、腫瘤壞死因子（TNF）和膜聯蛋白A5（ANXA5）。

2.3 GO功能富集和KEGG通路分析

利用R 4.1.2軟件中ClusterProfiler包，針對ISA與少弱精癥的交集靶點做GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO分析結果顯示，與生物過程（biological processes，BP）相關條目共905條，主要涉及對外源性刺激的反應、氧化應激反應、活性氧代謝過程、細胞周期調控、對腫瘤壞死因子反應和對凋亡信號通路的反應等；與細胞組分（cellular components，CC）相關條目有20條，主要包括轉錄調控復合物、膜閥、質膜微區和過氧化物酶體等；與分子功能（molecular functions，MF）相關條目有63條，主要包括DNA結合轉錄因子結合、轉錄共調節因子結合、轉錄共激活因子調節、氧化還原酶活性等。根據富集基因數，分別選取BP、CC和MF前10位條目繪制條形圖（圖3（a））。KEGG通路富集分析共得相關通路78條，主要包括p53信號通路、細胞衰老通路和IL-17信號通路等，按P由小到大選取前20條目繪制條形圖（圖3（b））。

2.4 分子對接

查閱以往研究成果[11-18]，確定核心靶點蛋白與小分子結合位點，使用Grid模塊參照結合位點設置對接盒子參數（表2）。ISA與8個核心靶點（CASP3、TP53、ESR1、GAPDH、HIF1A、PTGS2、TNF和ANXA5）分別做分子對接和可視化分析（圖4）。分子對接的結合自由能越小，配體與受體結合越穩定，相互作用的可能性越大[19]。結合能小于0 kcal·mol-1時，說明配體與受體有結合潛力；結合能小于-5 kcal·mol-1時，說明配體與受體結合穩定[20]。由表3可知，陽性藥左卡尼汀與8個核心靶點對接結合能均小于0 kcal·mol-1，僅與TNF的結合能小于-5 kcal·mol-1。ISA與8個核心靶點結合能均小于0 kcal·mol-1，與CASP3、TP53、ESR1 、PTGS2、TNF和ANXA5的結合能小于-5 kcal·mol-1。

3 討論

影響精子數量和質量的因素包括氧化應激、炎癥、免疫紊亂和DNA損傷等[21]。本研究GO功能富集分析表明ISA主要通過參與氧化應激、細胞凋亡和炎癥生物學過程發揮作用，此生物學過程與既往研究中影響精子數量和質量的因素一致。本研究中KEGG通路分析推測ISA可能通過調控p53信號通路、細胞衰老通路和IL-17信號通路發揮改善少弱精癥的作用，p53信號通路是與細胞凋亡相關的重要通路之一。正常的精子發生過程中，凋亡是機體清除過量或異常生精細胞、維持正常精子數量的重要方式，但精子過多凋亡則是少弱精癥的重要原因之一[22]。研究發現，男性少弱精癥患者中p53表達增加，凋亡活躍[23]。動物實驗顯示，刪除調節因子Pumilio 1，可導致p53強烈激活并導致精母細胞凋亡和精子生成破壞，而去除p53可挽救Pumilio 1缺失小鼠的細胞凋亡并改善精子生成[24]。衰老可影響男性生殖力，胰島素信號通路是衰老相關關鍵信號通路之一，抑制胰島素信號通路可改善生殖衰老及提高生育能力[25]。IL-17信號通路通過激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路介導炎癥的發生和發展[26]，病毒感染情況下精液中IL-17異常高表達并對精子存活率及精子密度產生負面影響[27]。

靶點蛋白互作網絡篩選出核心靶點后，分子對接驗證顯示ISA與核心靶點蛋白的結合力及結合靶標數量均優于陽性藥左卡尼汀。ISA與CASP3、TP53、ESR1、PTGS2、TNF和ANXA5結合穩定（結合能<-5 kcal·mol-1），可能是ISA抗少弱精癥的關鍵靶點，并普遍與凋亡和炎癥相關。CASP3是細胞凋亡的主要執行者，接受上游信號被激活后作為特異性底物誘發細胞染色質濃集、DNA片段化，從而促進凋亡[28]。研究調查發現，少弱精癥患者的精子中CASP3活性顯著升高，CASP3蛋白表達增加，說明少弱精癥患者精子細胞凋亡活躍[29]。TP53是凋亡相關p53信號通路的關鍵成分，可與受損DNA結合而阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，TP53過度激活會導致精子過多凋亡而發生少弱精癥[30]。研究發現，相較于正常精子細胞，弱精子細胞中TP53表達顯著增加[21]。ESR1所表達的雌激素受體α可調控精子發生和成熟[31]，ESR1敲除小鼠睪丸萎縮，精子數目減少，導致生殖能力下降甚至不育[32]。PTGS2又名環氧化酶-2，是體內催化花生四烯酸合成前列腺素的誘導型關鍵酶，低氧環境下，PTGS2可被HIF1A誘導產生，在輸精管及附睪中組成型表達并參與炎癥反應[33]。TNF 是炎癥反應的核心細胞因子，通過誘導炎癥基因表達及誘導細胞死亡驅動炎癥反應[34]。男性生殖系統中TNF水平增加可降低精子活力、破壞線粒體功能和DNA完整性，相較于生育力正常的男性，少弱精癥患者精液中TNF水平顯著升高[21]。ANXA5屬于Ca2+依賴的磷脂結合蛋白家族，Ca2+存在時，胞外ANXA5與凋亡細胞外翻的特征標志物磷酯酰絲氨酸特異性結合可示蹤凋亡細胞；胞內ANXA5則有促凋亡作用[35]。ISA穩定結合的關鍵靶點與凋亡和炎癥密切相關，推測ISA抗少弱精癥的機制最可能涉及的通路是凋亡相關p53信號通路和炎癥相關IL-17信號通路，為后續研究指明方向。

4 結論

本研究采用網絡藥理學和分子對接方法，通過化學信息學數據庫和生物信息學數據庫，篩選了ISA抗少弱精癥的核心靶點和通路，預測了ISA抗少弱精癥機制。ISA可能通過作用于核心靶點CASP3、TP53、ESR1、PTGS2、TNF和ANXA5，調控p53信號通路和IL-17信號通路發揮抗少弱精癥作用。今后將圍繞關鍵靶點和通路開展動物及細胞實驗研究，為開發抗少弱精癥新藥提供參考。

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Mechanistic Study of? Isatin Against Oligoasthenozoospermia

Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

NI Bei-bei1a， DAI Meng1a， BI Xiao-lin1b， ZHAO Zhi-chen1a，YUE Wang2， SUI Zhong-guo1a

（1. a. Department of Pharmacy， b. Department of Nutrition， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266000， China;

2. Nursing and Health College， Qingdao Huanghai University， Qingdao 266427， China）

Abstract：

To investigate the potential targets and mechanisms of isatin （ISA） in the treatment of oligoasthenozoospermia， targets of ISA and disease-related targets were identified utilizing public databases to find intersecting targets. Core targets were then determined using Cytoscape software. GO functional enrichment and KEGG pathway analyses on the intersecting targets were conducted， and molecular docking was used to predict the binding affinity of ISA with core target proteins. The results indicate that ISA′s intervention in oligoasthenozoospermia primarily involves biological processes such as oxidative stress， apoptosis， and inflammation， and is closely related to the p53 signaling pathway， the cell senescence pathway， and the IL-17 signaling pathway. After screening， eight core targets were identified， with ISA stably binding to six of them. Those suggest that ISA may exert its anti-oligoasthenospermia effects by modulating the p53 signaling pathway and the IL-17 signaling pathway through core targets including CASP3， TP53， ESR1， PTGS2， TNF and ANXA5.

Keywords： isatin; network pharmacology; oligoasthenozoospermia; molecular docking