驢SCD1基因克隆及組織表達規律研究

黃飛 祁業輝 劉桂芹 王長法 周苗苗

摘 要 旨在克隆驢硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase-1， SCD1）基因并進行生物信息學分析、檢測其在驢不同組織中的表達。設計 SCD1基因引物，PCR克隆得到其CDS序列，然后對 SCD1基因編碼產物進行生物信息學預測，同時使用qRT- PCR檢測驢心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪、乳腺內 SCD1基因mRNA相對表達量。結果顯示，驢 SCD1基因CDS長1 080 bp，可編碼359個氨基酸，SCD1蛋白質分子質量為41.61 ku，等電點為9.32，不穩定指數為44.16，疏水性總平均值為-0.157，屬于不穩定堿性親水蛋白；SCD1蛋白二級結構主要由α-螺旋（51.25%）和無規則卷曲（42.62%）構成。 SCD1基因在所檢測驢組織中均有表達，其中在肝臟中表達量最高，脂肪、乳腺和肺臟中次之，心臟和肌肉中最低（P<0.05），提示 SCD1在驢肝臟、脂肪和乳腺等組織不飽和脂肪酸的合成過程中發揮重要作用。

關鍵詞? SCD1 ；驢；基因克隆；生物信息學分析；組織表達

硬脂酰輔酶A去飽和酶（Stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）是催化單不飽和脂肪酸合成的限速酶，參與細胞的新陳代謝和前體脂肪細胞的分化，廣泛存在于動物各種組織細胞中。SCD1可將細胞中的飽和脂肪酸轉變為不飽和脂肪酸，在動物體內脂肪合成和代謝調節過程中發揮著重要的生理作用［1］。Rincon等［2］研究發現SCD基因的表達及其產物的活性決定了脂肪細胞單不飽和脂肪酸的合成及細胞膜磷脂和甘油三酯的組成， SCD1基因可通過膽固醇調節元件結合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）通路來調控乳脂的合成。另有研究發現SCD1可以介導還原型輔酶Ⅰ（NADH）-泛素氧化還原酶亞基A9（Ndufb9）通路對脂肪合成的調控，用阿氨酚抑制SCD1活性可抑制Ndufb9通路，進而阻斷脂肪的合成［3］。此外，SCD1亦可介導Ndufa6對成脂分化的調控作用［4］。

SCD1蛋白由大約359個氨基酸殘基組成，有4個跨膜區，種間高度保守，參與脂肪的代謝調節［5］。周秀敏等［6］研究發現，牛 SCD1基因可編碼359個氨基酸殘基組成的蛋白質，其平均分子質量為41.71 ku，是一種不穩定的水溶性蛋白。石恒波等［7］研究發現山羊SCD基因CDS序列全長為1 080 bp，進一步研究發現乳腺中SCD可通過調控脂肪酸合成酶（FASN）、心型脂肪酸結合蛋白（H-FABP）、瘦素受體蛋白（LEPR）、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARγ）等基因的表達影響乳脂中脂肪酸的組成。Zhang等［8］研究發現，牛血管基質組分（SVF）細胞中過表達? SCD1可增強PPARγ受體活性，進而增加脂滴積累（12?? μg/mg）。Burchat等［9］研究發現，小鼠腸道SCD1不僅可以調節腸道組織脂質含量，亦可調節血漿和肝臟的脂質代謝。Jin等［10］對山羊基因的研究表明， SCD1基因對山羊脂肪酸代謝有重要作用。另有研究發現驢脂肪和乳脂具有不飽和脂肪酸高的特點［11-12］，研究SCD1在驢不飽和脂肪酸合成過程中的調控作用具有重要意義。然而，目前關于驢 SCD1基因的研究鮮見報道。因此，本試驗研究驢 SCD1基因的克隆及組織表達規律，為進一步研究SCD1調控驢脂肪和乳脂中不飽和脂肪酸的合成以及改善驢奶和驢肉品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集 驢組織樣品來自于山東東阿天龍食品有限公司。選取4頭健康的德州母驢，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、乳腺和皮下脂肪，液氮速凍，-80 ℃冷凍保存。

1.1.2 主要試劑 pGM-T Fast克隆試劑盒、? E. coli DH5α感受態細胞、DNA凝膠回收試劑盒均購于天根生化有限公司；反轉錄試劑盒（M5 Super qPCR RT kit with Gdna remover）和熒光定量試劑盒（2×Real- time PCR Super mix SYBRgreen，with anti-Taq）均購于北京聚合美有限公司 ；2×Es Taq Master- Mix（Dye）購自康為世紀公司；DNA Marker購自中科瑞泰有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取與全長cDNA克隆 Trizol法提取驢肝臟總RNA。Fermentas反轉錄試劑盒合成cDNA。使用高保真酶以 SCD1基因的cDNA為模板進行PCR擴增：引物見表1；反應體系總體積為50 μL，5×buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/L） 4 μL、上游引物（10 μmol/L） 1.5 μL、下游引物（10 μmol/L） 1.5 μL、酶（2.5 U/μL） 0.5 μL、模板 2.0 μL、雙蒸水? 30.5 μL；反應條件為98 ℃ 10 s→? 55 ℃?? 5 s→? 72 ℃ 1.75 min（擴增35個循環）→? 72 ℃?? 5 min。PCR產物在電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Magen）回收并純化目的產物。膠回收產物連接克隆載體pTOPO - Blunt vector（Azbio - chem）轉化DH5α感受態細胞，涂布于含100?? μg/mL氨芐青霉素LB（Luria - Bertani）的平板于37 ℃培養過夜后，挑取陽性菌落PCR鑒定，并交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.2 SCD1生物信息學及系統發育樹分析 通過ORF Finder推導氨基酸序列；利用計算機pI/Mw工具（ExPASy Proteomics Server）、NetNglyc、NetPhos等在線預測SCD1蛋白的分子質量、理論等電點、二級結構、跨膜區等（表2）；利用MEGA 7構建系統進化樹［13］。

1.2.3?? SCD1基因組織表達分析（qRT-PCR） Trizol法分別提取各組織的總RNA。取1 mg RNA，用Prime Script○RRT試劑盒（TaKaRa）合成cDNA。然后用SYBR○RTrimeScriptTM試劑盒（TaKaRa）在ABI 7500（Applied Biosystems，Singapore）上測定 SCD1基因相對表達量。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL。PCR引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH）為內參，采用2-△△Ct的方法計算 SCD1基因相對表達量［14-15］。每個樣品重復３次，超純水替代樣品做陰性對照。

1.2.4 統計與分析 所有數據用SAS 9.2進行分析，多組數據間采用單因素方差分析，數據用柱狀圖表示，誤差線為標準差。當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果與分析

2.1?? SCD1的基因提取及克隆

Trizol法提取驢肝臟組織總RNA（圖1-a）。將RNA反轉錄后，以cDNA為模板，PCR特異性擴增 SCD1基因。PCR擴增產物進行電泳檢測發現一條約1 000 bp大小的條帶（圖1-b）。重組后菌液PCR產物電泳結果如圖1-c，電泳條帶大小約為1 000 bp，與目的基因大小一致。

2.2? SCD1的基因序列及系統進化樹分析

經測序驗證成功擴增 SCD1基因。序列比對分析表明 SCD1的開放閱讀框為1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基組成的多肽鏈（圖2）。根據不同動物 SCD1基因的序列構建的系統進化樹如圖3所示，驢和平原斑馬、馬的 SCD1基因相似度最高， 親緣關系最近。

2.3 生物信息學分析

2.3.1 SCD1蛋白理化性質及親/疏水性表達分析 利用ProtParam軟件對SCD1蛋白進行預測得出其分子式為C1937H2919N501O506S9；分子質量為41.61 ku；脂肪族指數為88.86；帶負電荷殘基總數（色氨酸、谷氨酸）為32個；帶正電荷殘基（精氨酸、賴氨酸）總數為43個；等電點為9.32，屬于堿性蛋白；不穩定指數44.16，基因編碼產物不穩定指數大于40 ［16］，屬于不穩定蛋白。氨基酸組成分析結果顯示，SCD1蛋白含有20種氨基酸，其中占比最高的是亮氨酸（Leu），占11.7%；其次是丙氨酸（Ala），占7.8%；最低的是半胱氨酸（Cys），僅占0.8%。

利用ProScale分析驢SCD1親/疏水性，發現225處Leu存在最大疏水值3.2；在64處組氨酸（His）存在最小疏水值-3.0；疏水性平均值為?? -0.157，屬于親水性蛋白（圖4）。

2.3.2 SCD1蛋白二級結構及二硫鍵預測 通過NovoPro在線工具預測SCD1蛋白二級結構，發現SCD1蛋白二級結構中有184個α-螺旋（Hh）、22個β-折疊（Ee）和153個無規則卷曲（Cc），占比分別為51.25%、6.13%和42.62%（圖5）。利用SCRATCH Protein Predictor在線工具預測，SCD1蛋白存在兩個Cys和一個二硫鍵。二硫鍵的位置可能在蛋白質的226和326個氨基酸殘基之間，可推出兩個Cys也分別位于肽鏈的226和326位置。

2.3.3 SCD1蛋白信號肽及跨膜結構預測 運用SignalIP-5.0分析SCD1信號肽，發現SCD1中信號肽存在的可能為0.095%；利用TMHMM 2.0分析跨膜結構，發現SCD1有4個跨膜區。

2.3.4 SCD1蛋白修飾位點預測 通過NetNGlyc 1.0、NetPhos 3.1預測驢SCD1蛋白糖基化修飾位點和磷酸化位點。發現在第259和318位氨基酸處存在N-糖基化位點；預測SCD1蛋白磷酸化位點結果顯示SCD1蛋白有10個絲氨酸（Ser）、9個蘇氨酸（Thr）和5個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，共24個。

2.3.5? SCD1基因組織表達分析 通過qRT-PCR技術檢測驢8個組織中 SCD1基因的mRNA表達量，發現在所有組織中都檢測到 SCD1基因，表達量從高到底依次為肝臟、脂肪、乳腺、肺臟、腎臟、脾臟、肌肉和心臟（P<0.05，圖6）。

3 討 論

SCD1是單不飽和脂肪酸生成過程中的關鍵酶［17-18］。已有研究表明，SCD1在癌細胞、脂肪組織以及乳腺組織脂肪酸代謝中發揮重要的調控作用。Mason等［11］研究發現，多種癌癥細胞的生存依賴于單不飽和脂肪酸的合成，SCD1等的缺失會引起不可逆的細胞毒性，并最終導致癌細胞死亡。另有研究表明，人體游離脂肪酸水平與其SCD1的表達量相關［12］。Duchemin等［19］研究發現奶牛 SCD1基因型可影響乳中不飽和脂肪酸含量。王小龍等［20］研究則發現 SCD1基因型可影響奶牛乳蛋白率、乳脂率。Li等［21］研究發現水牛乳腺中SCD1可通過調控脂代謝主控轉錄因子（ SREBP1）、過氧化物酶體增生激活受體γ（PPARG）、磷酸甘油脂酰基轉移酶（GPAT）和酰基甘油3磷酸酰基轉移酶（AGPAT）等基因表達來調控乳腺脂肪代謝。此外，Zou等［22］研究發現，SCD1可介導冷刺激引起的三酰甘油的分解，SCD1主要通過促進C3H10T1/2白色脂肪細胞的脂解來產生熱量供機體保暖。

目前，關于其他家養動物脂肪代謝的研究較多，而驢脂肪代謝調節相關研究較少［23-24］。驢肉和驢奶有不飽和脂肪酸含量高的特點［25-26］，研究SCD1在驢脂肪代謝中的作用，可為進一步改善肉質、進行乳成分的合成調控提供基礎［1］。本研究結果表明，驢 SCD1基因CDS長1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基構成的不穩定的親水蛋白；驢SCD1蛋白氨基酸殘基的數目與牛［6］、羊［7］和豬［27］相同；驢SCD1蛋白的不穩定系數大于40，與牛［6］、豬［27］ SCD蛋白相同，為不穩定蛋白；據驢SCD1蛋白二級結構推測，其三級結構主要以α-螺旋和無規則卷曲為主，含有少量的β-片層結構，而牛SCD1蛋白完全不含β-片層結構［6］。此外，驢 SCD1基因組織表達研究結果發現在所有檢測組織中均有SCD1的表達，其中肝臟中表達量最高，其次為脂肪、乳腺和肺臟，心臟和肌肉表達最低。以上結果提示 SCD1在驢肝臟、脂肪和乳腺等組織中發揮重要作用，為進一步研究驢脂肪和乳脂中不飽和脂肪酸的合成調控提供理論? 依據。

4 結 論

成功擴增出驢 SCD1基因，序列分析表明 SCD1基因的開放閱讀框為1 080 bp，可編碼359個氨基酸殘基組成的多肽鏈。

研究證實 SCD1基因在驢組織中普遍表達，且在肝臟、脂肪、乳腺和肺臟中高表達。

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Cloning and Tissue Expression of? SCD1?? Gene in Donkey

HUANG Fei，QI Yehui，LIU Guiqin，WANG Changfa and ZHOU Miaomiao

（Liaocheng Research Institute of Donkey High-Efficiency Breeding and Ecological Feeding， College of Agriculture of Liaocheng? University，Liaocheng Shandong 252000，China）

Abstract In this study，the full-length cDNA cloning，bioinformatics analysis and tissues expression of donkey stearoyl-CoA desaturase-1 （SCD1） gene was carried out. The CDS sequence of donkey? SCD1 gene was obtained by the PCR method first，and then the? bioinformatic prediction of the? SCD1 genes coding product was done. Additionally，the relative mRNA expression of the? SCD1 gene in different tissues of donkey （heart，liver，spleen，lung，kidney，muscle，fat，and mammary gland） was determined by qRT-PCR. The results showed that the donkey? SCD1 genes CDS was 1 080 bp，which could encode a peptide with 359 amino acid residues; the molecular mass，isoelectric point，instability index，and hydrophobicity average value of SCD1 protein were 41.61，9.32，44.16，and -0.157，respectively，which was a basic hydrophilic protein with an unstable secondary structure. The secondary structure of SCD1 protein was mainly composed of α-helix （51.25%） and random coil （42.62%）. The mRNA of? SCD1 gene were expressed in all tested donkey tissues，and the relative mRNA level was highest in liver，followed by fat，mammary gland and lung，and lowest in heart and muscle （P

Key words? SCD1 ; Donkey; Gene cloning; Bioinformatics analysis; Tissue expression

Received? 2022-12-07??? Returned 2023-02-08

Foundation item National Key R&D Plan of China （No.2022YFD1600103）; Open Project for Animal Husbandry Research of Liaocheng University（No.319312101-09）;the Open Project of Liaocheng University Animal Husbandry Discipline（No.319462207-9）.

First author HUANG Fei，male，master student. Research area：herbivore lactation physiology.?? E-mail： 2470303187@qq.com

Corresponding?? author ZHOU Miaomiao，female，associate professor.Research area：herbivore lactation physiology. E-mail：zhoumm0329@163.com

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）