虹鱒 Scarb1基因克隆、生物信息學及組織表達分析

張東強 黃進強 李永娟 吳深基 趙璐 宋玉芳

摘 要 清道夫受體B類成員1 （scavenger receptor class B member 1， Scarb1）作為細胞表面的膜受體蛋白，在動物體色形成過程中發揮重要作用。為了解? Scarb1基因在虹鱒（Oncorhynchus mykiss）體色形成中的作用，通過RACE技術克隆虹鱒? Scarb1基因的cDNA全長，并運用生物信息學方法分析該基因及其序列結構特征，同時使用實時定量PCR（qRT-PCR）檢測? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及其雜交F1代不同發育階段和不同組織中的表達情況。結果顯示，? Scarb1基因cDNA序列全長為2 032 bp，開放閱讀框1 479 bp，編碼492個氨基酸，預測分子質量為55.59 ku，且存在保守的CD36結構域和2個跨膜區。序列同源性分析顯示，虹鱒與其他硬骨魚類的氨基酸序列相似度為71.69%～98.58%；進化分析發現虹鱒與大馬哈魚親緣關系最近，與哺乳動物和兩棲動物親緣關系最遠。qRT-PCR檢測結果表明，在虹鱒與金鱒胚胎期及出膜后各發育階段中? Scarb1基因均有不同程度表達，且表現為受精期至桑葚期的表達顯著高于其他時期（P<0.05），對虹鱒與金鱒同一時期的差異分析發現該基因在胚胎期及7 dph （days post hatch）、1 M （month post hatch）、2 M和? 3 M時期中表達存在顯著差異（P<0.01）。? Scarb1基因在虹鱒與金鱒背部皮膚和背部肌肉等色素沉著性組織中表達量較高，其中在金鱒背部皮膚的表達量顯著高于虹鱒（P<0.01）。此外，? Scarb1基因在雜交F1代不同發育時期中的表達規律與雙親一致；在不同組織中，該基因在雜交F1代背部皮膚中的表達量介于雙親之間。研究結果表明，? Scarb1基因與虹鱒體色形成有著密切關系，且可能在金鱒黃色體色形成過程中發揮重要作用。

關鍵詞 虹鱒；體色；清道夫受體B類成員1 （? Scarb1）；基因克隆；表達分析

體色是動物適應環境變化的常見表型之一，不僅參與動物生存繁衍、隱蔽偽裝及溫度調節等生物學進程，而且也是其觀賞性和經濟價值的主要決定因素［1］。魚類體色模式有著獨特的物種特異性，其取決于體表皮膚和鱗片中所含色素細胞的類型及不同的數量分布［2］。魚類目前已發現的色素細胞有6種，包括黑色素細胞、黃色素細胞、紅色素細胞、白色素細胞、虹彩細胞以及藍色素細胞［3］。黑色素細胞在各種動物體的真皮和表皮中分布廣泛，目前國內外對脊椎動物體色的研究主要集中在黑色素細胞，對其他色素細胞分化、發育及代謝調控機制的研究相對較少［4］。黃色素細胞作為脊椎動物中常見的色素細胞之一，其化學本質為類胡蘿卜素和蝶啶類物質［5］。類胡蘿卜素是黃色素細胞的主要顯色物質，魚類自身不能進行合成，而是來源于攝食或內源性代謝轉化［6］。雖然體色受到多種環境因子的復雜調控，但魚類體色的形成主要受遺傳基因的控制［7］。目前，已發現有多個基因參與類胡蘿卜素的代謝調控與黃色素的形成，包括清道夫受體B類成員1 （scavenger receptor class B member 1，?? Scarb1）、簇決定因子36 （cluster determinant 36，? CD36）、β-胡蘿卜素-9′10-雙加氧酶（beta-carotene oxygenase 2，? Bco2）和載脂蛋白D （apolipoprotein D， Apod）等［8-10］。

Scarb1是一種重要的模式識別蛋白（Pattern recognition receptor， PRPs），在組織細胞吸收類胡蘿卜素過程中發揮著關鍵作用［11］。B類清道夫受體包括CD36、Scarb1和LIMPⅡ （lysosomal integral membrane proteinⅡ） 3個主要成員，其中CD36和Scarb1都參與細胞內維生素A類類胡蘿卜素的吸收過程［8， 12］。類胡蘿卜素為脂溶性色素，在機體內首先與脂蛋白結合形成復合物，隨后運輸至特定組織進行沉積［13］。 Scarb1可作為高密度脂蛋白受體參與該復合物的識別，從而介導靶組織類胡蘿卜素著色［14］。在哺乳動物中，? Scarb1基因的敲除使小鼠（Mus musculus）腸道對類胡蘿卜素吸收顯著降低［15］；在金絲雀（Serinus canaria）中，? Scarb1基因剪接異常會導致其對類胡蘿卜素的吸收產生障礙，從而形成白色金絲雀［16］。在魚類中也發現? Scarb1是斑馬魚（Danio rerio）黃色素細胞中類胡蘿卜素沉積的必需基因［17］。此外通過miR-430b過表達抑制錦鯉（Cyprinus carpio）中? Scarb1基因的表達，可以降低皮膚鱗片中的類胡蘿卜素含量和黃/紅色素細胞密度，最終導致相應的著色缺陷和色素細胞減少［18］。上述研究說明? Scarb1基因參與脊椎動物體色的形成，并與類胡蘿卜素的吸收和轉運密切相關。

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬鮭科，太平洋鮭屬，是一種對水質要求較高的冷水性魚類，因其肉質鮮美、營養價值極高等特點，已成為中國廣泛養殖的經濟品種。目前虹鱒主要養殖品種有兩種常見表型，分別為背部膚色呈黑灰色的野生型虹鱒（虹鱒）和背部膚色呈金黃色的突變型虹鱒（金鱒），是魚類體色變異與改良研究的良好材料。魚類皮膚和肌肉著色程度是評價其品質的重要指標，盡管? Scarb1基因在類胡蘿卜素運輸過程中的重要作用被廣泛關注，但虹鱒中該基因的表達特征及其在體色形成中的作用研究相對缺乏。此外，本研究團隊前期研究中發現隨著金鱒皮膚黃色素的逐漸沉著，? Scarb1基因在其皮膚中的表達逐漸上升［19］。為此，本試驗克隆虹鱒? Scarb1的cDNA序列全長，對其編碼氨基酸和蛋白進行分析，并通過qRT-PCR技術分析? Scarb1在虹鱒、金鱒及雜交F1代胚胎發育不同階段和成魚不同組織中的表達模式，探究? Scarb1基因在虹鱒體色形成中的作用，為后期進一步闡明金鱒體色形成的分子機制提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚來源于甘肅農業大學水產科學實訓中心。將受精卵置于孵化池中，自然孵化得到虹鱒、金鱒及其雜交F1代不同發育時期的胚胎樣本，包括受精期、4細胞期、16細胞期、桑葚期、囊胚期、原腸期、神經期、體節期和心跳期；對出膜后的仔魚繼續培育，分別在出膜后1 d、出膜后3 d、出膜后5 d、出膜后7 d、出膜后10 d、出膜后1個月、出膜后2個月、出膜后3個月等發育階段采集個體的背部皮膚。待虹鱒、金鱒和雜交F1代正常發育至約12月齡時，各挑取大小和體色相近的個體，經3-氨基苯甲酸乙酯（MS-222）麻醉后分別取背部皮膚、背部肌肉、頭腎、肝臟、脾臟、心臟、鰓、腦、眼和腸共計10個組織，上述樣品采集后放于液氮中速凍，后轉至-80 ℃冰箱保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

使用總RNA提取試劑盒（TIANGEN， 北京）得到虹鱒、金鱒及雜交F1代組織樣品的總RNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop超微量分光光度計檢測RNA樣品的完整性和濃度及純度。按反轉錄試劑盒（TaKaRa， 大連）的使用方法將檢測合格的RNA樣品進行反轉錄，所得cDNA放-20? ℃保存，待用。

1.3 虹鱒? Scarb1基因cDNA全長克隆

基于虹鱒皮膚轉錄組數據獲得? Scarb1基因部分序列，使用Primer 5.0軟件設計Scarb1-5′基因特異性引物（gene specific primer， GSP）、Scarb1-3′ GSP、Scarb1-3′巢式基因特異性引物（nested gene specific primer， NGSP） （表1）。以金鱒背部皮膚總RNA反轉錄而成的RACE Ready cDNA為模板，使用SMARTer○RRACE 5′/3′ Kit （Clontech， 美國）進行RACE擴增。擴增體系（50 μL）：ddH2O 15.5 μL，2×SeqAmp Buffer 25 μL，10×混合通用引物（UPM） 5 μL，5′或3′ GSP 1 μL，SeqAmp DNA Polymerase?? 1 μL，5′ 或 3′ RACE Ready cDNA 2.5 μL。反應條件：94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min （5 個循環）；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min （5 個循環）；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min （25 個循環）。以首輪3′擴增產物稀釋50倍為模板進行巢式PCR擴增，體系（50 μL）：ddH2O 17 μL，2×SeqAmp Buffer 25 μL，短通用引物（UPS） 1 μL，3′ NGSP?? 1 μL，SeqAmp DNA Polymerase 1 μL，3′ RACE Ready cDNA 5 μL。擴增程序：94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min （18 個循環）。

將上述PCR擴增產物進行純化回收，并與pMD19-T載體（TaKaRa， 大連）連接后轉化到Trans5α感受態細胞（TransGen， 北京）中，經過夜培養后，挑取陽性克隆菌送公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

將測序序列使用DNAMAN軟件進行拼接，從而獲得? Scarb1基因的全長cDNA序列。用ORF finder （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）查找開放閱讀框；利用ExPASy ProtParam （https：//web.expasy.org/protparam/）和ExPASy ProtScale （https：//web.expasy.org/protscale/）在線分析蛋白的基本理化性質與親疏水性；磷酸化位點用在線工具NetPhos 3.1 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）進行預測；利用SignalP 5.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測信號肽和糖基化位點；采用TMHMM 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行跨膜結構分析；使用SMART （http：//smart.embl.de/）預測Scarb1蛋白的二級結構；利用Clustalx 2.0軟件進行序列同源比對；進化樹用MAGE 7.0軟件中的鄰接法（Neighbour-Joining）進行構建。

1.5 qRT-PCR檢測和數據處理

根據? Scarb1基因cDNA序列全長為基礎設計qRT-PCR引物Scarb1-F和Scarb1-R （表1）。以獲得的虹鱒、金鱒及其雜交F1代各組織樣品cDNA作為模板，β-actin為內參基因進行qRT-PCR反應。PCR反應體系參照熒光定量試劑盒說明書。擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s （40 個循環）。? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及雜交F1代不同發育階段和不同組織中的相對表達量用2-ΔΔCt法進行計算。采用SPSS 22.0中單因素方差分析（One-way ANOVA）和多重比較（Duncans）對試驗數據進行顯著性檢驗［20］。

2 結果與分析

2.1 虹鱒? Scarb1基因的cDNA全長克隆和氨基酸序列分析

虹鱒? Scarb1基因（GenBank No.ON456558）序列全長為2 032 bp，包含300 bp的5′-UTR和253 bp的3′-UTR，ORF為1 479 bp，共編碼492個氨基酸。通過ProtParam分析顯示Scarb1蛋白分子式為C2534H3916N630O708S33，理論分子質量為55.59 ku，等電點為6.56，親水性平均系數為0.031，表明該蛋白為疏水性蛋白。通過NetPhos 3.1 Server和SignalP 5.0分析顯示，? Scarb1編碼的氨基酸序列存在34 個磷酸化位點和8 個N-糖基化位點，且不存在信號肽，屬于非分泌性蛋白（圖1）。

TMHMM 2.0預測顯示，虹鱒Scarb1蛋白含2 個跨膜區，分別位于第7～29位和第? 439～461位氨基酸，使用SMART分析顯示，Scarb1蛋白含CD36保守結構域，位于第12～460位氨基酸。SOPMA對蛋白質二級結構預測顯示，該蛋白由α-螺旋（28.05%）、β-轉角? （4.88%）、延伸鏈（27.64%）和無規卷曲? （39.43%）4種結構組成（圖2）。

2.2 Scarb1同源比對與系統進化分析

利用Clustalx軟件對虹鱒與其他物種的Scarb1進行氨基酸多序列比對，發現虹鱒與大馬哈魚（Oncorhynchus keta）同源性高達98.58%，與大西洋鮭魚（Salmo salar）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）和半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）的同源性達到80%以上，與斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）、金魚（Carassius auratus）、甌江彩鯉（Cyprinus carpio var. color）和斑馬魚的同源性為71.69%～78.76%，且? Scarb1基因編碼的CD36結構域在上述物種間相對保守（圖3），與人類（Homo sapiens）和小鼠同源性分別為54.95%和54.87%，與熱帶爪蟾（Xenopus tropicalis）同源性最低為50.86%。

系統進化樹結果顯示，虹鱒與大馬哈魚親緣關系最近，聚為一支，與其他硬骨魚類聚為一大支，與人類、小鼠和熱帶爪蟾親緣關系最遠? （圖4），這與Clustalx分析結果一致，反映虹鱒? Scarb1基因的進化地位和系統進化發育情況。

2.3?? Scarb1在虹鱒、金鱒及雜交F1代不同時期中的表達分析

qRT-PCR檢測結果顯示，? Scarb1基因在虹鱒和金鱒9個胚胎發育時期及出膜后各發育階段中均有不同程度表達（圖5）。在虹鱒中，? Scarb1基因在受精期的表達量最高（P<0.05），在4細胞期、桑葚期、16細胞期、囊胚期和3 M的表達量依次遞減，在原腸期至2 M中該基因表達量相對較低。在金鱒中，? Scarb1基因在4細胞期表達量最高且顯著高于其他各時期（P<0.05），在受精期、16細胞期、桑葚期、囊胚期、3 M、2 M和1 M的表達量逐漸降低，在其他組織中的表達量較低且差異不顯著（P<0.05）。對虹鱒和金鱒同一發育時期的表達量進行差異性分析發現，? Scarb1基因在胚胎期、7 dph、1 M、2 M和3 M中表達量差異極顯著（P<0.01）。

Scarb1基因在雜交F1代胚胎期及出膜后各發育時期中的表達與雙親類似（圖5）。? Scarb1基因在受精期至囊胚期中有較高表達，顯著高于其他各時期（P<0.05）。與雙親同一發育階段的表達量進行差異分析顯示，? Scarb1基因在雜交F1代4細胞期、16細胞期、桑葚期、體節期、心跳期、1 dph、3 dph、5 dph、7 dph、10 dph、1 M和2 M中表達量與虹鱒存在極顯著差異（P<0.01），在3 M中 Scarb1基因的表達量與虹鱒差異顯著（P<0.05）。雜交F1代16細胞期、桑葚期、囊胚期、原腸期、神經期、體節期、心跳期、1 dph、3 dph、? 5 dph、7 dph、10 dph和3 M中的表達量與金鱒差異極顯著（P<0.01），在受精期和4細胞期中該基因表達量存在顯著差異（P<0.05）。

2.4?? Scarb1在虹鱒、金鱒及雜交F1代不同組織中的表達分析

在虹鱒、金鱒及其雜交F1代不同組織中的qRT-PCR結果顯示，? Scarb1基因在虹鱒和金鱒各組織中均有表達，但主要集中在背部皮膚和眼睛（P<0.05），在其他組織中的表達相對較低（圖6）。對虹鱒和金鱒相同組織的表達量進行差異性分析發現，? Scarb1在金鱒背部皮膚和背部肌肉等色素沉著性組織中的表達量極顯著高于虹鱒? （P<0.01），此時? Scarb1在虹鱒脾臟和鰓中的表達量與金鱒存在顯著差異（P<0.05），在頭腎、肝臟和腸中的表達量存在極顯著差異 （P<0.01）。

Scarb1基因在雜交F1代的10種組織中也均有表達，? Scarb1基因在雜交F1代不同組織中的表達主要集中在背部皮膚、眼和頭腎中，在背部皮膚中的表達量最高（P<0.05），在肝臟中表達量最低（圖6）。與? Scarb1在雙親相同組織的表達量差異進行分析顯示，? Scarb1基因在雜交F1代頭腎、脾臟、腦、眼和腸中的表達極顯著高于雙親，在背部皮膚中表達量介于雙親之間，且? Scarb1基因在雜交F1代各組織中的表達量與雙親均存在極顯著（P<0.01）或顯著差異（P

3 討? 論

魚類不同類型的色素細胞含有相應的色素顆粒，色素顆粒類型和數量分布的變化以及色素細胞在表層中的遷移均會導致體色的改變［21］。類胡蘿卜素作為魚類中廣泛存在的一類色素，能夠呈現出不同的色澤，魚類體表組織中大多數紅色、橙色及黃色都是以類胡蘿卜素為基礎的［22］。除著色作用外，類胡蘿卜素在促進機體細胞增殖、分化和機體免疫等方面也發揮著重要作用［23］。類胡蘿卜素受自身脂溶性與高度疏水性的限制，在血液或血淋巴中進行轉運時需要與脂蛋白或載脂蛋白進行結合，從而轉移至特定的組織進行沉積［24］。? Scarb1是類胡蘿卜素吸收過程中的關鍵基因，編碼的脂蛋白受體能選擇性識別脂蛋白，繼而被靶組織攝取以介導類胡蘿卜素向細胞內轉運［13］。另外，魚類皮膚中類胡蘿卜素沉積與脂質儲存的方式相一致，說明? Scarb1基因的表達水平可以間接反映類胡蘿卜素的含量［25］。本研究克隆虹鱒? Scarb1基因，并運用qRT-PCR技術分析該基因在虹鱒、金鱒及雜交F1代不同發育階段和不同組織中的表達模式，從而深入了解? Scarb1基因在虹鱒體色形成中的作用。

本研究獲得虹鱒? Scarb1基因的全長序列為2 032 bp，預測編碼492個氨基酸。? Scarb1基因編碼的蛋白結構高度保守，并具有保守CD36結構域和N-糖基化位點等B類清道夫受體的典型結構特征，這與草魚（Ctenopharyngodon idellus）?? Scarb1基因的分析結果相一致［26］。在功能上，CD36結構域負責配體結合［12］，N-糖基化位點可以影響 Scarb1的細胞內運輸和脂質轉運蛋白的活性［27］。虹鱒? Scarb1基因編碼的氨基酸序列與分類學地位相同的大馬哈魚同源性最高達? 98.58%，與其他硬骨魚類如大西洋鮭魚、半滑舌鰨、甌江彩鯉的同源性為71.69%～89.44%，表明該基因在生物進化過程中具有高度保守性。系統發育樹結果顯示金鱒與大馬哈魚親緣關系最近，其次是其他硬骨魚類，與哺乳動物和兩棲動物的親緣關系最遠，這表明虹鱒? Scarb1基因的進化地位和系統進化發育情況相一致。

為了進一步明確虹鱒? Scarb1基因表達與其體色形成的關系，本研究檢測分析了虹鱒、金鱒及雜交F1代不同發育階段和組織中? Scarb1的相對表達量。結果發現? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及F1代胚胎期和出膜后各時期均有表達，主要在受精期、4細胞期、16細胞期、桑葚期和囊胚期表達，在發育至原腸期時表達量驟減。色素細胞的前體是來自神經脊無色素沉積的色素母細胞，其通過背外側或腹側途徑遷移至各組織中，最后分化成不同類型色素細胞［28］。研究發現，? Scarb1在鳥類卵子發育時脂質資源從體內轉運到卵子中的過程對胚胎的生長發育至關重要［29］。在魚類中也發現類胡蘿卜素與胚胎發育存在潛在相關性［30］。對虹鱒、金鱒及雜交F1代胚胎組織學觀察發現，在桑葚期之前其色素細胞尚未開始形成，而? Scarb1在胚胎發育前期即出現高表達現象，推測? Scarb1基因不僅參與類胡蘿卜素的吸收與運輸過程，可能還發揮其他的生物學功能，例如機體內脂質轉運和胚胎發育等［24］。除此之外，研究發現細胞中維生素D和維生素E的吸收過程也與? Scarb1基因密切相關［23］。在金鱒胚胎培養時觀察發現原腸期囊胚表面細胞向卵黃部分下包，色素細胞逐漸分化成熟［31］。對紅斑馬魚（Brachydanio rerio）早期體色發育過程研究發現，紅斑馬魚背部最先形成黑色素細胞，并逐漸增多且沿著背部和腹部進行擴散，隨后黃色素細胞也開始形成并遷移［21］。另外，在胚胎發育的后期階段，黃色素細胞形成后黑色素細胞還未減少和消退，此時兩者同時生長可能會相互影響［32］。因此，本試驗所測? Scarb1基因在原腸期至出膜后10日齡表達較低可能與此有關。而? Scarb1基因在金鱒1月齡至3月齡背部皮膚的表達量呈上升趨勢且顯著高于虹鱒和F1代，說明此時期金鱒黃色素細胞發育可能占主導地位，并預示? Scarb1基因可能在黃色素細胞形成過程中發揮著重要? 作用。

組織表達結果顯示，? Scarb1基因在12月齡虹鱒、金鱒及雜交F1代的10個組織中均有表達。其中，? Scarb1基因在背部皮膚和眼等色素沉著性組織中的表達量較高，且在背部皮膚中的表達量顯著高于其他組織（P<0.05），表現出明顯的組織特異性，這與? Scarb1基因在甌江彩鯉中的表達規律相一致［24］。類胡蘿卜素在鮭鱒魚類不同發育階段色素沉積部位不同，幼魚期主要沉積于皮膚，魚種期主要在肌肉，性成熟期又轉移至皮膚［33］。2002年在果蠅（Drosophilidae）中首次報道了? Scarb1同源蛋白NinaD基因，研究發現該基因參與視覺發色團的形成，同時認為? Scarb1基因參與果蠅眼睛中類胡蘿卜素的運輸過程。說明? Scarb1基因在背部皮膚和眼的高表達可能與類胡蘿卜素在組織中的沉積有關［34］。? Scarb1基因在虹鱒與金鱒頭腎和鰓中表達量較低，這一結果與? Scarb1在蝦夷扇貝中的表達模式相似［35］。研究發現，? Scarb1基因存在于腦神經的小神經膠質細胞和血管內皮細胞上，參與小神經膠質細胞粘附和神經凋亡體的清除等過程［36］。? Scarb1基因在腦中的高表達可能與此有關。研究表明，? Scarb1基因參與腸道中類胡蘿卜素的吸收，且在大西洋鮭魚中腸的表達相對較高［17］。這與本研究中? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及雜交F1代腸道中的表達模式相反，說明? Scarb1基因在不同魚類中其組織表達模式存在較大差異。此外，? Scarb1基因在“全紅”和”粉玉”甌江彩鯉之間存在極顯著性表達差異（P<0.01），? Scarb1主要在“全紅”皮膚中進行表達，而在“粉玉”皮膚中不表達或者表達量極低［37］。本研究中，? Scarb1基因在金鱒背部皮膚表達量高于虹鱒和雜交F1代，說明? Scarb1在該類組織中存在著重要調控作用。結合? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及雜交F1代同一組織qRT-PCR結果的差異分析，表明? Scarb1基因可能與金鱒黃色體色的形成有關。

4 結? 論

本研究從虹鱒背部皮膚克隆獲得了? Scarb1基因的全長序列，通過生物信息學分析發現Scarb1存在CD36保守結構域，且在不同物種間具有較高的保守性。? Scarb1基因在虹鱒、金鱒及雜交F1代各組織中的表達主要集中背部皮膚和眼等色素沉著性組織，且該基因在金鱒背部皮膚中的表達顯著高于虹鱒和雜交F1代。綜上表明，? Scarb1基因可能參與虹鱒體色的形成，并與金鱒黃色表型的形成密切相關。該結果為進一步研究? Scarb1基因在金鱒黃色體色形成中的作用提供基礎資料。

參考文獻 Reference：

［1］ HELEN N S，SARA A，MARGARETA W. Rapid color change in fish and amphibians-function，regulation，and?? emerging applications［J］.Pigment Cell & Melanoma Research，2013，26（1）：29-38.

［2］ INABA M，YAMANAKA H，KONDO S. Pigment pattern formation by contact dependent depolarization［J］.Science，2012，335（6069）：677.

［3］ 王曉讕，吳深基，黃進強，等.虹鱒酪氨酸酶基因的生物信息學分析及其在不同發育階段和組織中的表達分析［J］.? 中國畜牧獸醫，2021，48（5）：1516-1524.

WANG X L，WU SH J，HUANG J Q，et al. Bioinformatics and expression analysis of tyrosinase gene at the different stages and tissues of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）［J］.Chinese Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2021，48（5）：1516-1524.

［4］ 孟 超，徐 皓，黃 超，等.魚類體色相關功能基因的研究進展［J］.湖南文理學院學報（自然科學版），2020，32（3）：30-35.

MENG CH，XU H，HUANG CH，et al. Research progress on color-related genes of fish［J］.Journal of Hunan University of Arts and Science（Science and Technology），2020，32（3）：30-35.

［5］ 胡 菊，馮 彩，馬 曉，等.錦鯉墨蝶呤還原酶基因的克隆、表達和定位分析［J］.水產學報，2020，44（4）：551-561.

HU J，FENG C，MA X，et al. Molecular cloning and expression of sepiapterin reductase in Japanese ornamental carp （Cyprinus carpio var. koi）［J］.Journal of Fisheries of China，2020，44（4）：551-561.

［6］ MAOKA T. Carotenoids in marine animals［J］.Marine Drugs，2011，9（2）：278-293.

［7］ 李 歡，桑衛國，段青源，等.魚類體色成因及調控研究進展［J］.海洋科學，2014，38（8）：109-115.

LI H，SANG W G，DUAN Q Y，et al. Advance of fish color mechanism and its regulation［J］.Marine Sciences，2014，38（8）：109-115.

［8］ BOREL P，LIETZ G，GONCALVES A，et al. CD36 and SR-BI are involved in cellular uptake of provitamin a carotenoids by Caco-2 and HEK cells，and some of their genetic variants are associated with plasma concentrations of these micronutrients in humans［J］.Journal of Nutrition，2013，143（4）：448-456.

［9］ BABINO D，PALCZEWSKI G，WIDJAJA-ADHI M A，? et al. Characterization of the role of β-Carotene 9，10-Dioxygenase in macular pigment metabolism［J］.The Journal of Biological Chemistry，2015，290（41）：24844-24857.

［10］ GAO G Q，SONG L S，TONG B，et al. Expression levels of?? GSTA2 and? APOD genes might beassociated with carotenoid coloration in golden pheasant （Chrysolophus pictus） plumage［J］.Zoological Research，2016，37（3）：144-150.

［11］ MCKAY G J，LOANE E，NOLAN J M，et al. Investigation of genetic variation in scavenger receptor class B，member 1 （? Scarb1） and association with serum carotenoids［J］.Ophthalmology，2013，120（8）：1632-1640.

［12］ CANTON J，NECULAI D，GRINSTEIN S. Scavenger receptors in homeostasis and immunity［J］.Nature Reviews Immunology，2013，13（9）：621-634.

［13］ SAKUDOH T，KUWAZAKI S，LIZUKA T，et al. CD36 homolog divergence is responsible for the selectivity of carotenoid species migration to the silk gland of the silkworm Bombyx mori［J］.Journal of Lipid Research，2013，54（2）：482-495.

［14］ TSUCHIDA K，SAKUDOH T. Recent progress in molecular geneticstudies on the carotenoid transport system?? using cocoon-color mutants of the silkworm［J］.Archives of Biochemistry and Biophysics，2015，572：151-157.

［15］ VAN BENNEKUM A，WERDER M，THUAHNAI S，? et al. Class B scavenger receptor-mediated intestinal absorption of dietary β-carotene and cholesterol［J］.Biochemistry，2005，44（11）：4517-4525.

［16］ TOOMEY B，RICARDO J，PERDO M，et al. High-density lipoprotein receptor?? Scarb1 is required for carotenoid coloration in birds［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2017，114（20）：5219-5224.

［17］ SUNDVOLD H，HELGELAND H，BARANSKI M，et al. Characterisation of a novel paralog of scavenger receptor class B member I （? Scarb1） in Atlantic salmon （Salmo salar）［J］.BMC Genetics，2011，12：52.

［18］ TIAN X，PENG N，MA X，et al. microRNA-430b targets scavenger receptor class B member 1 （? Scarb1） and inhibits coloration and carotenoid synthesis in koi carp （Cyprinus carpio L.）［J］.Aquaculture，2021，546：737334.

［19］ WU S J，HUANG J Q，LI Y J，et al. Analysis of yellow mutant rainbow trout transcriptomes at different developmental stages reveals dynamic regulation of skin pigmentation genes［J］.Scientific Reports，2022，12：256.

［20］ 黃 姻，馮鵬霏，潘傳燕，等.卵形鯧鲹 SST1基因的克隆與組織表達［J］.西北農業學報，2021，30（8）：1130-1141.

HUANG Y，FENG P F，PAN CH Y，et al. Molecular cloning and tissue distribution of? SST1 gene from Trachinotus ovatus［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2021，30（8）：1130-1141.

［21］ 王 梅，張永勤，黃 靖，等.紅斑馬魚體色觀察及敲除mitfa基因對其體色發育的影響［J］.激光生物學報，2022，31（1）：19-26.

WANG M，ZHANG Y Q，HUANG J，et al. Observation of red zebrafish body color and the effects of knocking out mitfa gene on its body color development［J］.Acta Laser Biology Sinica，2022，31（1）：19-26.

［22］ SEFK K M，BROWN A C，CLOTFELTER E D. Carotenoid-based coloration in cichlid fishes［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A：Molecular & Integrative Physiology，2014，173：42-51.

［23］ LIGON R A，SIMPSON R K，MASON N A，et al. Evolutionary innovation and diversification of carotenoid-based pigmentation in finches［J］.Evolution：International Journal of Organic Evolution，2016，70（12）：2839-2852.

［24］ 杜金星.甌江彩鯉? Scarb1和? Scarb1-like基因對其紅色體色形成的調控機制［D］.上海：上海海洋大學，2019.

DU J X. The regulation mechanism of?? Scarb1 and?? Scarb1-like genes in controlling red coloration in Oujiang color common carp （Cyprinus carpio var. color）［D］. Shanghai：Shanghai Ocean University，2019.

［25］ AHI E P，LECAUDEY L A，ZIEGELBECKER A，et al. Comparative transcriptomics reveals candidate carotenoid color genes in an East African cichlid fish［J］.BMC Genomics，2020，21（1）：54.

［26］ OU M， HUANG R，LUO Q，et al. Characterisation of scavenger receptor class B type 1 in rare minnow （Gobiocypris rarus）［J］.Fish & Shellfish Immunology，2019，89：614-622.

［27］ VINALS M，XU S，VASILE E，et al. Identification of the N-linked glycosylation sites on the high density lipoprotein （HDL） receptor SR-BI and assessment of their effects on HDL binding and selective lipid uptake［J］.Journal of Biological Chemistry，2003，278（7）：5325-5332.

［28］ STREELMAN J T，PEICHEL C L，PARICHY D M. Developmental genetics of adaptation in fishes：the case for novelty［J］.Annual Reviews of Ecology，Evolution，and Systematics，2007，38：655-681.

［29］ FLACHOWSKY G. Natural antioxidants in avian nutrition and reproduction：P.F. surai （Ed.），Nottingham University Press，Nottingham，2002，65 pp. 50.00，Hardcover，ISBN：1-897676-95-6［J］.Animal Feed Science and Technology，2003，103（1）：177-178.

［30］ KARADAS F，PAPPAS A C，SURAI P F，et al. Embryonic development within carotenoid-enriched eggs influences the post-hatch carotenoid status of the chicken［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part B：Biochemistry and Molecular Biology，2005，141（2）：244-251.

［31］ 王慶龍.金鱒和虹鱒繁殖與育種關鍵技術研究［D］.山東青島：中國海洋大學，2013.

WANG Q L. Studies on reproduction and breeding key technology of? Oncorhynchus mykiss［D］. Qingdao Shandong：Ocean University of China，2013.

［32］ DJURDJEVIC I，KREFT M E，SUSNIK B S. Comparison of pigment cell ultrastructure and organisation in the dermis of marble trout and brown trout，and first description of erythrophore ultrastructure in salmonids［J］.Journal of Anatomy，2015，227（5）：583-595.

［33］ 冷向軍，李小勤.水產動物著色的研究進展［J］.水產學報，2006（1）：138-143.

LENG X J，LI X Q. The recent advance of aquatic animal pigmentation［J］.Journal of Fisheries of China，2006（1）：138-143.

［34］ KIEFER C，SUMSER E，WERNET M F，et al. A class B scavenger receptor mediates the cellular uptake of carotenoids in Drosophila［J］.Proceedings of the National?? Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（16）：10581-10586.

［35］ 任曉亮，侯 睿，王 珊，等.控制蝦夷扇貝閉殼肌積累類胡蘿卜素相關基因的篩查［J］.中國海洋大學學報（自然科學版），2012，42（9）：41-47.

REN X L，HOU R，WANG SH，et al. Identification of genes relating to carotenoids accumulation in adductor muscles of Yesso scallops （Patinopecten yessoensis）［J］.Periodical of Ocean University of China，2012，42（9）：41-47.

［36］ HUSEMANN J，SILVERSTEIN S C. Expression of scavenger receptor class B，type I，by astrocytes and vascular smooth muscle cells in normal adult? mouse and human brain and in alzheimers?? disease? brain［J］.The?? American Journal of Pathology，2001，158（3）：825-832.

［37］ DU J X，CHEN H，MANDAL B K，et al. HDL receptor/Scavenger receptor B1-? Scarb1 and?? Scarb1-like mediate the carotenoid-based red coloration in fish［J］.Aquaculture，2021，545（2）：737208.

Cloning， Bioinformatics and Tissues Expression Analysis of?? Scarb1 Gene in Rainbow Trout

ZHANG Dongqiang1， HUANG Jinqiang1， LI Yongjuan1，2， WU Shenji1， ZHAO Lu1 and SONG Yufang1

（1.College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，

China; 2. College of Science， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，China）

Abstract Scavenger receptor class B member 1 （Scarb1）， a cell surface membrane receptor protein， plays an important role in the formation of skin color in animals. To study the function of?? Scarb1 gene in the formation of? skin? color of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）， we obtained the full-length cDNA sequence of rainbow trout?? Scarb1 gene by RACE technique， and analyzed its sequence features by bioinformatics. The quantitative real-time PCR （qRT-PCR） was used to detect the expression of?? Scarb1 gene at different developmental stages and tissues of wild-type rainbow trout （WT）， yellow mutant rainbow trout （YM） and their hybrid F1 generation. The results showed that the full length of?? Scarb1 cDNA was 2 032 bp， with an open reading frame of? 1 479 bp，encoding?? 492-amino acid protein.The? molecular? mass? of the protein was approximately 55.59 ku? and conserved CD36 structural domain and two transmembrane regions. The homology analysis showed that the amino acid sequence similarity of?? Scarb1 between rainbow trout and other bony fishes was 71.69% to 98.58%.The phylogenetic analysis showed that rainbow trout had the closest relationship with salmon， and the farthest relationship with mammals and amphibians.The qRT-PCR analysis showed that?? Scarb1 gene was expressed at embryo and post hatch stages of WT and YM， and the expression at fertilization stage， 4-cell， 16-cell and multi-cell was significantly higher than that at other stages （P<0.05）. Additionally， the expression of?? Scarb1 gene was extremely significant differences （P<0.01） at the embryonic stage， 7 dph （days post hatch）， 1 M （month post hatch）， 2 M and 3 M stage of WT and YM. The expression of?? Scarb1 gene was higher at the dorsal skin and dorsal muscle， and the dorsal skin of YM? was significantly higher than that of WT? （P<0.01）. Moreover， the expression pattern of?? Scarb1 gene at different developmental stages of F1 generation was consistent with that of both parents， and the expression of the gene in the dorsal skin of the F1 generation was intermediate between the both parents. All these results suggest that the?? Scarb1 gene may play an important role in the formation of yellow skin color in YM.

Key words Rainbow trout; Skin color; Scavenger receptor class B member 1 （? Scarb1）; Gene cloning; Expression analysis

Received? 2022-10-19??? Returned 2022-12-26

Foundation item National Natural Science Foundation of China （No.31760755）;Discipline Team Project of Gansu Agricultural University（No.GAU-XKTD-2022-23）.

First author? ZHANG Dongqiang， male， master student. Research area：aquaculture biotechnology. E-mail：514024286@qq.com

Corresponding?? author HUANG Jinqiang， male， professor， doctoral supervisor. Research area：aquaculture biotechnology. E-mail：huangjq@gsau.edu.cn

（責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor：GU Yulan）